阅读说明：本技术 使用嵌合凝血因子治疗血友病性关节病的方法 (Use the method for chimeric coagulation factor therapies hemophilic arthosis ) 是由 J·杜蒙 N·贾恩 D·格拉泽布鲁克 于 2017-12-01 设计创作，主要内容包括：本公开提供治疗患有血友病的人类关节的可逆性血友病性关节病的方法,其包括向所述人类施用有效量的包含凝血因子和Fc区的嵌合蛋白或组合物。(The disclosure provides the method for invertibity hemophilic arthosis of the treatment with haemophiliachemophiliac human joint comprising a effective amount of chimeric protein or composition comprising coagulation factor and the area Fc of Xiang Suoshu human administration.)

使用嵌合凝血因子治疗血友病性关节病的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年12月2日提交的美国临时申请序列第62/429,509号、2017年7月7日提交的美国临时申请序列第62/529,896号、2017年8月25日提交的美国临时申请序列第62/550,488号和2017年9月14日提交的美国临时申请序列第62/558,793号的权益，所述专利各自以全文引用方式并入本文。

技术领域

本公开大体上涉及用于止血障碍的治疗剂的领域。

背景技术

血友病为由编码凝血蛋白的基因，特别是因子VIII(FVIII)基因(其导致缺乏FVIII活性(A型血友病))或因子IX基因(其导致缺乏FIX活性(B型血友病))的突变和/或缺失造成的X连锁性出血病症(参见例如Peyvandi,F.等人Haemophilia 12:82-89(2006))。所述疾病的特征在于自发性流血和创伤后过量出血。血友病的治疗通过使FVIII和/或FIX活性恢复以防止自发性出血为目标的替代疗法进行(参见例如Mannucci,P.M.,等人,N.Engl.J.Med.344:1773-1779(2001)。

随时间流逝，常开始于童年早期的向肌肉和关节中的反复出血会导致血友病性关节病和关节损伤。血友病性关节病是一种与血友病相关联的常见且重度并发症，其常导致疼痛、畸形和能力丧失。罹患血友病性关节病的最常见患者为3岁与15岁之间的年轻男性。尽管膝盖为最可能受到影响的关节，但是血友病性关节病也可存在于肘关节、踝关节、肩关节和脊柱关节。已知血友病性关节病为不可逆的。因此当前可使用的针对血友病性关节病的治疗为有限的。

因此，需要发展新的治疗血友病性关节病的方式。

发明内容

本公开的一个方面提供一种治疗患有血友病的人类关节的可逆性血友病性关节病的方法，其包括向所述人类施用有效量的包含凝血因子和Fc区的嵌合蛋白或包含所述嵌合蛋白的组合物。在一些实施方案中，所述可逆性血友病性关节病包括滑膜炎。在某些实施方案中，所述可逆性血友病性关节病包括微出血或亚临床出血。

本公开的另一方面提供一种治疗患有血友病的人类的滑膜炎的方法，其包括向所述人类施用有效量的包含凝血因子和Fc区的嵌合蛋白或包含凝血因子和Fc区的组合物。在一些实施方案中，所述滑膜炎与血友病性关节病相关联。

本公开的另一方面提供一种减少患有血友病的人类关节的血管重塑的发生的方法，其包括向所述人类施用有效量的包含凝血因子和Fc区的嵌合蛋白。本公开的另一方面提供患有血友病的人类关节的血管重塑的预防性治疗，其包括向所述人类施用有效量的包含凝血因子和Fc区的嵌合蛋白或包含凝血因子和Fc区的组合物。

本公开的另一方面提供一种改善患有血友病的人类关节的周围软组织的方法，其包括向所述人类施用有效量的包含凝血因子和Fc区的嵌合蛋白或包含凝血因子和Fc区的组合物。

在一些实施方案中，施用改善所述人类的关节健康计分(HJHS)。在一些实施方案中，所述施用减少了所述人类的关节疼痛。

在某些实施方案中，所述Fc区特异性结合至低亲和力免疫球蛋白γFc区受体II-b(FcγRIIB)。在一些实施方案中，所述Fc区特异性结合至树突细胞特异性细胞内粘附分子-3-抓取型非整联蛋白(DC-SIGN)。

在一些方面中，所述方法进一步包括识别需要所述治疗的人类。在一些实施方案中，所述识别包含使用成像系统。在某些实施方案中，所述成像系统包含放射线摄影术、磁共振成像、超声波检查术、能量多普勒音波检查术(power Doppler sonography)或其任何组合。在一些实施方案中，所述人类表达一个或多个与关节炎症相关联的生物标记物。

在一些方面中，所述凝血因子为选自由以下组成的组：因子VII(FVII)、因子VIIa(FVIIa)、因子VIII(FVIII)、因子IX(FIX)、因子X(FX)、冯·维勒布兰德因子(VWF)、其特异性结合至FIX和FX的抗原结合部分或其任何组合。在一些实施方案中，所述嵌合蛋白包含FVIII-Fc。在其他实施方案中，所述嵌合蛋白包含FIX-Fc。在一个实施方案中，所述嵌合蛋白包含因子VIII部分和VWF部分，其中所述FVIII部分包含FVIII多肽或其片段，其中所述VWF部分包含VWF多肽或其片段，其中所述FVIII部分连接至第一Fc区，其中所述VWF部分连接至第二Fc区，并且其中所述第一Fc区和所述第二Fc区彼此缔合。

在一些实施方案中，所述嵌合蛋白进一步包含半衰期延长部分。在某些实施方案中，所述半衰期延长部分包含白蛋白或其片段、白蛋白结合部分、PAS序列、HAP序列、转铁蛋白或其片段、聚乙二醇(PEG)、聚唾液酸、羟乙基淀粉(HES)、其衍生物或其任何组合。

在一些方面中，包含FVIII和Fc区的所述组合物(例如，所述嵌合蛋白)的有效量为约20IU/kg至约300IU/kg。在一些实施方案中，包含FVIII-Fc的所述嵌合蛋白以以下给药间隔施用：约两日、约三日、约四日、约五日、约六日、约七日、约八日、约九日、约十日、约11日、约12日、约13日、约14日、约15日、约16日、约17日、约18日、约19日、约20日、约21日、约22日、约23日或约24日。

在其他方面中，包含FIX-Fc的所述嵌合蛋白的有效量为约20IU/kg至约100IU/kg。在一些实施方案中，包含FIX-Fc的所述嵌合蛋白以以下给药间隔施用：约三日、四日、五日、六日、七日、八日、九日、十日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日、25日、26日、27日或28日。

在一个特定实施方案中，所述嵌合蛋白包含FVIII部分、VWF部分、第一Fc区和第二Fc区；其中所述FVIII部分包含FVIII多肽或其片段；其中所述VWF部分包含VWF多肽或其片段；其中所述FVIII部分连接至所述第一Fc区；其中所述VWF部分连接至所述第二Fc区；并且其中所述第一Fc区和所述第二Fc区彼此缔合。

实施方案

E1.一种治疗患有血友病的人类关节的可逆性血友病性关节病的方法，其包括向所述人类施用有效量的包含凝血因子和Fc区的嵌合蛋白。

E2.如E1所述的方法，其中所述可逆性血友病性关节病包括滑膜炎。

E3.如E1或E2所述的方法，其中所述可逆性血友病性关节病包括微出血。

E4.一种治疗患有血友病的人类的滑膜炎的方法，其包括向所述人类施用有效量的包含凝血因子和Fc区的嵌合蛋白。

E5.如E4所述的方法，其中所述滑膜炎与血友病性关节病相关联。

E6.一种预防或减少患有血友病的人类关节的血管重塑的发生的方法，其包括向所述人类施用有效量的包含凝血因子和Fc区的嵌合蛋白。

E7.一种改善患有血友病的人类关节的周围软组织的方法，其包括向所述人类施用有效量的包含凝血因子和Fc区的嵌合蛋白。

E8.如E1至E7中任一项所述的方法，其中所述施用改善所述人类的关节健康计分(HJHS)。

E9.如E8所述的方法，其中所述关节健康计分为关节总计和整体步态计分的和。

E10.如E9所述的方法，其中所述关节总计基于肿胀、肿胀持续时间、肌肉萎缩、活动时捻发声、屈曲丧失、伸展丧失、关节疼痛和强度进行测量。

E11.如E9所述的方法，其中所述整体步态计分基于走路、走楼梯、跑步或单腿跳进行测量。

E12.如E1至E11中任一项所述的方法，其中所述施用减少所述人类的关节疼痛。

E13.如E1至E12中任一项所述的方法，其中所述关节选自由以下组成的组：一个或两个肘关节、一个或两个膝关节、一个或两个踝关节、一个或两个肩关节、一个或两个髋关节、一个或两个腕关节、一个或多个手部关节、一个或多个足部关节及其任何组合。

E14.如E1至E13中任一项所述的方法，其中所述关节为肘关节。

E15.如E1至E13中任一项所述的方法，其中所述关节为膝关节。

E16.如E1至E13中任一项所述的方法，其中所述关节为踝关节。

E17.如E1至E16中任一项所述的方法，其中所述Fc区特异性结合至低亲和力免疫球蛋白γFc区受体II-b(FcγRIIB)。

E18.如E1至E17中任一项所述的方法，其中所述Fc区特异性结合至树突细胞特异性细胞内粘附分子-3-抓取型非整联蛋白(DC-SIGN)。

E19.如E1至E18中任一项所述的方法，其进一步包括识别需要所述治疗的人类。

E20.如E19所述的方法，其中所述识别包含使用成像系统。

E21.如E20所述的方法，其中所述成像系统包括放射线摄影术、磁共振成像、超声波检查术、能量多普勒音波检查术或其任何组合。

E22.如E21所述的方法，其中所述人类表达一个或多个与关节炎症相关联的生物标记物。

E23.如E1至E22中任一项所述的方法，其中所述凝血因子选自由以下组成的组：因子VII(FVII)、因子VIIa(FVIIa)、因子VIII(FVIII)、因子IX(FIX)、因子X(FX)、冯·维勒布兰德因子(VWF)、其特异性结合至FIX和FX的抗原结合部分或其任何组合。

E24.如E1至E23中任一项所述的方法，其中所述嵌合蛋白包含FVIII-Fc。

E25.如E1至E23中任一项所述的方法，其中所述嵌合蛋白包含FIX-Fc。

E26.如E1至E24中任一项所述的方法，其中所述嵌合蛋白包含因子VIII部分和VWF部分，其中所述FVIII部分包含FVIII多肽或其片段，其中所述VWF部分包含VWF多肽或其片段，其中所述FVIII部分连接至第一Fc区，其中所述VWF部分连接至第二Fc区，并且其中所述第一Fc区和所述第二Fc区彼此缔合。

E27.如E23、E24和E26中任一项所述的方法，其中所述FVIII多肽包括全长成熟FVIII。

E28.如E23、E24和E26中任一项所述的方法，其中所述FVIII多肽包括B结构域缺失FVIII。

E29.如E28所述的方法，其中所述B结构域缺失FVIII包含FVIII的所有或部分所述B结构域的缺失。

E30.如E28或E29所述的方法，其中所述B结构域缺失FVIII包含成熟FVIII的氨基酸残基746至1648的缺失。

E31.如E23、E24和E25至E30中任一项所述的方法，其中所述VWF多肽包含含有VWF的D'结构域和D3结构域的VWF片段。

E32.如E1至E31中任一项所述的方法，其中所述嵌合蛋白进一步包含半衰期延长部分。

E33.如E32所述的方法，其中所述半衰期延长部分包含白蛋白或其片段、白蛋白结合部分、PAS序列、HAP序列、转铁蛋白或其片段、聚乙二醇(PEG)、聚唾液酸、羟乙基淀粉(HES)、其衍生物或其任何组合。

E34.如E32或E33所述的方法，其中所述半衰期延长部分被***在所述凝血因子内。

E35.如E32或E33所述的方法，其中所述半衰期延长部分被***在所述凝血因子与所述Fc区之间。

E36.如E24和E26至E35中任一项所述的方法，其中包含FVIII和Fc区的所述嵌合蛋白的有效量为约20IU/kg至约300IU/kg。

E37.如E36所述的方法，其中包含FVIII-Fc的所述嵌合蛋白的有效量为约20IU/kg至约275IU/kg、约20IU/kg至约250IU/kg、约20IU/kg至约200IU/kg、约20IU/kg至约175IU/kg、约20IU/kg至约150IU/kg、约20IU/kg至约125IU/kg、约20IU/kg至约100IU/kg、约20IU/kg至约90IU/kg、约20IU/kg至约80IU/kg、约20IU/kg至约70IU/kg、约20IU/kg至约60IU/kg、约20IU/kg至约50IU/kg、约20IU/kg至约40IU/kg、约20IU/kg至约30IU/kg、约30IU/kg至约100IU/kg、约40IU/kg至约100IU/kg、约50IU/kg至约100IU/kg、约60IU/kg至约100IU/kg、约70IU/kg至约100IU/kg、约80IU/kg至约100IU/kg、约90IU/kg至约100IU/kg、约100IU/kg至约200IU/kg、约150IU/kg至约200IU/kg、约200IU/kg至约300IU/kg、约225IU/kg至约300IU/kg、约250IU/kg至约300IU/kg、约275IU/kg至约300IU/kg或约25IU/kg至约75IU/kg。

E38.如E36或E37所述的方法，其中包含FVIII-Fc的所述嵌合蛋白的有效量为约25IU/kg至约65IU/kg。

E39.如E24和E26至E38中任一项所述的方法，其中包含FVIII-Fc的所述嵌合蛋白以以下给药间隔施用：约两日、约三日、约四日、约五日、约六日、约七日、约八日、约九日、约十日、约11日、约12日、约13日、约14日、约15日、约16日、约17日、约18日、约19日、约20日、约21日、约22日、约23日或约24日。

E40.如E24和E26至E38中任一项所述的方法，其中包含FVIII-Fc的所述嵌合蛋白以以下给药间隔施用：约1至约14日、约1至约13日、约1至约12日、约1至约11日、约1至约10日、约1至约9日、约1至约8日、约1至约7日、约1至约6日、约1至约5日、约1至约4日、约1至约3日、约1至约2日、约2至约14日、约3至约14日、约4至约14日、约5至约14日、约6至约14日、约7至约14日、约8至约14日、约9至约14日、约10至约14日、约11至约14日、约12至约14日、约13至约14日或约5至约10日。

E41.如E24和E26至E40中任一项所述的方法，其中包含FVIII-Fc的所述嵌合蛋白以约3日至约5日的给药间隔施用。

E42.如E25所述的方法，其中包含FIX-Fc的所述嵌合蛋白的有效量为约20IU/kg至约100IU/kg。

E43.如E25或E42所述的方法，其中包含FIX-Fc的所述嵌合蛋白的有效量为约20IU/kg至约100IU/kg、约30IU/kg至约100IU/kg、约40IU/kg至约100IU/kg、约50IU/kg至约100IU/kg、约60IU/kg至约100IU/kg、约70IU/kg至约100IU/kg、约80IU/kg至约100IU/kg、约90IU/kg至约100IU/kg、约20IU/kg至约90IU/kg、约20IU/kg至约80IU/kg、约20IU/kg至约70IU/kg、约20IU/kg至约60IU/kg、约20IU/kg至约50IU/kg、约20IU/kg至约40IU/kg或约20IU/kg至约30IU/kg。

E44.如E25和E42至E44中任一项所述的方法，其中包含FIX-Fc的所述嵌合蛋白的有效量为约50IU/kg至E100IU/kg。

E45.如E25和E42至E44中任一项所述的方法，其中包含FIX-Fc的所述嵌合蛋白以以下给药间隔施用：约三日、四日、五日、六日、七日、八日、九日、十日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日、25日、26日、27日或E28日。

E46.如E25和E42至E45中任一项所述的方法，其中包含FIX-Fc的所述嵌合蛋白以以下给药间隔施用：约1至约21日、约1至约20日、约1至约19日、约1至约18日、约1至约17日、约1至约16日、约1至约15日、约1至约14日、约1至约13日、约1至约12日、约1至约11日、约1至约10日、约1至约9日、约1至约8日、约1至约7日、约1至约6日、约1至约5日、约1至约4日、约1至约3日、约1至约2日、约2至约21日、约3至约21日、约4至约21日、约5至约21日、约6至约21日、约7至约21日、约8至约21日、约9至约21日、约10至约21日、约11至约21日、约12至约21日、约13至约21日、约14至约21日、约15至约21日、约16至约21日、约17至约21日、约18至约21日、约19至约21日、约20至约21日、约5至约10日、约10至约15日、约15至约20日。

E47.如E25和E42至E46中任一项所述的方法，其中包含FIX-Fc的所述嵌合蛋白以以下给药间隔施用：约7日、约8日、约9日、约10日、约11日、约12日、约13日或约14日。

E48.如E1至E32中任一项所述的方法，其中所述嵌合蛋白包含FVIII部分、VWF部分、第一Fc区和第二Fc区；其中所述FVIII部分包含FVIII多肽或其片段；其中所述VWF部分包含VWF多肽或其片段；其中所述FVIII部分连接至所述第一Fc区；其中所述VWF部分连接至所述第二Fc区；并且其中所述第一Fc区和所述第二Fc区彼此缔合。

E49.如E1至E47中任一项所述的方法，其中所述嵌合蛋白的所述Fc区有助于所述嵌合蛋白定位至所述关节。

E50.如E1至E49中任一项所述的方法，其中所述人类小于6岁。

E51.如E1至E49中任一项所述的方法，其中所述人类为6岁至小于12岁。

E52.如E1至E49中任一项所述的方法，其中所述人类为12岁或更大年龄。

E53.如E1至E52中任一项所述的方法，其中所述凝血因子分布至血浆区室外以及血浆区室中的组织。

附图说明

图1A-1F示出FVIII-Fc研究(图1A和1B)和基线时具有目标关节的儿童的FVIII-Fc研究(图1C-1F)的受试者的研究前(图1A、1C和1E)和研究中中值(图1B、1D和1F)(IQR)年度化出血率(ABR)。图1C-1D示出儿童的FVIII-Fc研究的组合数据，而图1E-1F示出基于受试者的年龄分层(小于6岁和在6岁与小于12岁之间)的相同数据。

图2A-2B示出从FVIII-Fc研究基线至延伸研究第2年(图2A；x轴)和至延伸研究第3年(图2B；x轴)的总计修改的血友病关节健康计分(mHJHS；y轴)中的平均变化。图2B将基线时存在(是；三角形)和不存在(否；圆形)目标关节区别开。

图3A-3C示出针对接受研究前预防性治疗的受试者和接受研究前发病期(按需)治疗的受试者的从FVIII-Fc研究基线至延伸研究第2年(图3A；x轴)和延伸研究第3年(图3B)以及从儿童的FVIII-Fc研究至延伸第2年(图3C；x轴)的总mHJHS(y轴)的平均变化。

图4示出针对FVIII-Fc研究基线时具有目标关节的受试者(方形)和FVIII-Fc研究基线时不具有目标关节的受试者(菱形)的从FVIII-Fc研究基线至第2年(x轴)的总mHJHS(y轴)的平均变化。

图5示出针对以下受试者的从FVIII-Fc研究基线至第2年(x轴)的总mHJHS(y轴)的平均变化：FVIII-Fc研究基线时mHJHS计分的损害的四分位数最低(Q1；≥1-10)(菱形)，FVIII-Fc研究基线时mHJHS计分的损害的四分位数第二低(Q2；≥10-22)(方形)；FVIII-Fc研究基线时mHJHS计分的损害的四分位数第二高(Q3；≥22-34)(三角形)，以及FVIII-Fc研究基线时mHJHS计分的损害的四分位数最高(Q4；≥34-37)(菱形)。

图6示出针对FVIII-Fc研究基线时具有目标关节的受试者的从FVIII-Fc研究基线至第2年(x轴)的总mHJHS(y轴)的平均变化。

图7示出针对承重关节(菱形)和非承重目标关节(方形)的从FVIII-Fc研究基线至第2年(x轴)的总mHJHS(y轴)的平均变化。

图8示出针对肿胀(菱形)、活动范围(方形)和强度(三角形)的从FVIII-Fc研究基线至第2年(x轴)的mHJHS(y轴)的平均变化。

图9示出针对关节不稳定性(深灰色方形)、肿胀(黑色三角形)、肌肉萎缩(浅灰色方形)、关节疼痛(浅灰色菱形)、捻发声(黑色方形)和强度(浅灰色圆形)的FVIII-Fc研究患者的mHJHS(y轴)的平均(SEM)变化。示出了各mHJHS测量值的总基线(BL)计分。

图10A-10B示出rFIXFc研究的受试者的研究前(图10A)和研究中中值(图10B)(IQR)年度化出血率(ABR)。图10B进一步示出总体研究中ABR(深色圆形)、总体目标关节ABR(灰色菱形)和目标关节自发性ABR(灰色三角形)。WP＝每周预防；IP＝个体化间隔预防；并且MP＝修改的预防(图10A-10B)。

图11为示出在至少十二个月的连续追踪时间的情况下从开始追踪起的十二个月内尚未经历关节手术的那些受试者(n＝37)中解决和未解决的可评估目标关节(踝关节、膝关节、肘关节、髋关节、腕关节和肩关节)的数目的图形表示。各目标关节的数目(n)叠加在相关数据上，其中总计93个目标关节得到评估。解决(100％)和未解决(0％)的目标关节的百分比示出于x轴下方。

图12A-12C为施用¹²⁵I-SIB标记的FIX(图12A)、¹²⁵I-SIB标记的FIXFc(图12B)或¹²⁵I-SIB标记的糖聚乙二醇化FIX(图12C)的小鼠的单光子发射断层摄影术(SPECT)图像。图12D-12G示出在各种时间点施用¹²⁵I-SIB标记的FIX、¹²⁵I-SIB标记的FIXFc或¹²⁵I-SIB标记的糖聚乙二醇化FIX的小鼠的直接比较。热图指示每只小鼠中¹²⁵I-SIB标记的相对浓度(％ID/g)(图12A-12G)。

图13A-13B为示出在施用¹²⁵I-SIB标记的FIX、¹²⁵I-SIB标记的FIXFc或¹²⁵I-SIB标记的糖聚乙二醇化FIX之后膝关节(图13A)和肩关节(图13B)中随时间推移，图12A-12G中所示的小鼠中¹²⁵I-SIB标记定位的强度的图。收集右膝和左膝以及右肩和左肩的数据，将其组合以得到所示的数据(分别为图13A和13B)。

图14A为示出与未标记FIX和FIXFc相比并且如通过显色分析或单级分析所测量，经标记FIX和经标记FIXFc的相对活性的图。图14B为示出HemB小鼠中经标记和未标记FIX分子的药代动力学的图。

图15A-15F为示出肘关节(屈曲：图15A；和伸展：图15B)、膝关节(屈曲：图15C；和伸展：图15D)和踝关节(跖屈：图15E；和背屈：图15F)的活动范围的图，其中修改的血友病关节健康计分(HJHS)和屈曲/伸展程度叠加。

图16为流程图，其概述用于研究rFVIIIFc对FcγR结合、内化、信号传导和细胞因子产生的影响、以及基因表达变化、以及随后在体外T细胞上的相互作用和影响的方法。

图17A-17C为在用辣根过氧化物酶免疫复合物(HRP-IC；阳性对照)、IgG1、重组FVIII(rFVIII)或rFVIII Fc融合蛋白(rFVIIIFc)处理之后Fcγ受体CD16(图17A)、CD32(图17B)和CD64(图17C)的相对巨噬细胞和树突细胞表面表达水平的图形表示。星号(*)指示显著性程度(n＝3；*＝P≤0.05，**＝P≤0.01，***＝P≤0.005，与其他处理相比的HRP-IC的显著性未示出)。

图18A-18C为示出在用rFVIII或rFVIIIFc处理之后相对信号传导的图形表示。图18A示出如通过Syk磷酸化所测量，用HRP-IC、IgG1、rFVIII或rFVIIIFc处理15分钟的THP-1单核细胞系(“THP-1”)、单核细胞、外周血单核细胞来源的巨噬细胞(“巨噬细胞”)和外周血单核细胞来源的树突细胞中的信号传导。图18B示出用rFVIIIFc(“WT”)、突变rFVIIIFc(其不能结合至新生Fc受体)(“FcRn突变体”)或突变rFVIIIFc(其不能结合至FcγR)(“FcgR突变体”)处理的巨噬细胞中的相对Syk磷酸化。图18C示出在用HRP-IC、IgG1、rFVIII或rFVIIIFc处理之后二十四小时巨噬细胞中促炎性细胞因子白介素1b(IL-1b)、IL-6、IL-8、IL-10和肿瘤坏死因子α(TNFa)的相对产生。

图19示出在用rFVIII或rFVIIIFc处理之后一分钟、五分钟和三十分钟含Src同源区2结构域的磷酸酶-1(SHP1)、pSHP2、磷脂酰肌醇-3,4,5-参磷酸5-磷酸酶1(SHIP1)和pSHIP2的相对磷酸化状态。星号(*)指示显著性程度(n＝3；**P≤0.01，***P≤0.005)。

图20A-20M为用rFVIII或rFVIIIFc处理之后致耐受性巨噬细胞的基因表达模式的图形表示。图20A-20B为维恩图，其示出用IgG1、rFVIII或rFVIIIFc处理六小时的单核细胞来源的巨噬细胞(n＝3)中显著下调的基因分布(图20A)和显著上调的基因分布(图20B)。图20C-20G为示出在用rFVIII或rFVIIIFc处理之后，如通过定量PCR所测量，各种NRF2和脂质代谢途径基因的相对表达的图，所述基因诸如血红素氧化酶1(Hmox1；图20C)、过氧化体增殖物活化受体γ(proliferator-activated receptor gamma，PPARγ；图20D)、脂蛋白脂肪酶(LPL；图20E)、早期生长反应2(EGR2；图20F)和溶质载体有机阴离子转运体家族成员4A1(SLCO4A1；图20G)；处理之后6小时(图20I)和12小时(图20J)的CD206；以及精氨酸酶1(ARG1；图20L)。星号(*)指示显著性程度(n＝8；*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.005；图20C-20G)。图20K和20M为示出通过流式细胞术收集的表达CD206的细胞数的图。此外，发现rFVIIIFc处理的巨噬细胞展现特征性M2样表型(图20I-20M)。具体而言，用rFVIIIFc处理的巨噬细胞具有比6小时(图20I)之后和24小时(图20J)之后用rFVIII处理的细胞高的相对CD206(也称为甘露糖受体C型1；MRC1)表达，并且用rFVIIIFc处理的巨噬细胞具有比24小时之后用rFVIII处理的细胞高的相对ARG1表达(图20M)。

图21A为图解用于确定rFVIIIFc处理对T细胞分化的作用的方法的流程图。图21B为将巨噬细胞或树突细胞用IgG1(对照)、rFVIII或rFVIIIFc处理24小时并然后与原初CD4阳性T细胞进行共培养之后六日调控性T细胞的百分比的图形表示。图21C为将原初CD4阳性T细胞在用IgG1、rFVIII或rFVIIIFc预处理的巨噬细胞或树突细胞的条件培养基中培养之后调控性T细胞的百分比的图形表示。

图22为提出的rFVIIIFc调控性T细胞分化机制的图解。

图23为提出的rFIXFc对巨噬细胞的作用的图解。

具体实施方式

本公开提供治疗患有血友病的人类关节的可逆性血友病性关节病的方法，其包括向所述人类施用有效量的包含凝血因子和Fc区的嵌合蛋白或包含凝血因子和Fc区的组合物。本文所公开的嵌合蛋白也可用于治疗患有血友病的人类关节的滑膜炎、微出血、一个或多个关节的炎症、血管重塑或其任何组合。在某些实施方案中，本发明的方法改善患有血友病的人类关节的周围软组织。

I.定义

应注意，术语“一(个/种)”实体是指一个或多个(种)所述实体；例如，“一个核苷酸序列”应理解为表示一个或多个核苷酸序列。因此，术语“一个(种)”、“一个或多个(种)”和“至少一个(种)”在本文中可互换使用。

此外，“和/或”在本文中使用时应视为对两个指定特征或组分中的每一者在存在或不存在另一者的情况下的具体公开。因此，如本文中在诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”意图包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，如诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”意图涵盖以下方面中的每一者：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。

应理解，当在本文中用语言“包含”描述各方面时，也提供以“由...组成“和/或“实质上由...组成”的术语描述的其他相似方面。

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本公开所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。例如，the Concise Dictionary of Biomedicineand Molecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC Press；The Dictionary ofCell and Molecular Biology,第3版,1999,Academic Press；和the Oxford DictionaryOf Biochemistry And Molecular Biology,Revised,2000,Oxford University Press，向技术人员提供本公开所使用的许多术语的大体解释。

单位、前缀和符号均以其国际单位制(Système International de Unites，(SI))公认形式表示。数字范围包括限定所述范围的数字在内。除非另外指明，否则氨基酸序列为从左至右以氨基至羧基取向书写。本文中提供的标题不限制本公开的各种方面，所述方面可通过参考整个说明书得出。因此，即将在下文定义的术语通过参照说明书全文进行更完整地定义。

术语“约”在本文中用于意指近似、大致、大约或在...左右。当术语“约”与数字范围结合使用时，其通过使边界扩展高于和低于所陈述的数字来修饰所述范围。因此，“约10-20”意指“约10至约20”。一般而言，术语“约”可通过例如向上或向下(升高或降低)10％的变化修饰高于或低于所述值的数值。

如本文所用的“施用”意指经由药学上可接受的途径向受试者给予药学上可接受的组合物，例如本文所公开的嵌合蛋白。施用途径可为静脉内，例如静脉内注射和静脉内输注。其他施用途径包括例如皮下、肌肉内、经口、经鼻和肺部施用。嵌合蛋白和杂合蛋白可作为包含至少一种赋形剂的药物组合物的一部分施用。在一些实施方案中，所述组合物(例如，所述嵌合蛋白)通过基因疗法向人类施用，例如，其中向人类施用一种或多种编码所述凝血因子和/或所述Fc区的多核苷酸，并且所述凝血因子和/或所述Fc区在所述人类中表达。

如本文所用的“治疗(Treat/treatment/treating)”是指例如减轻疾病或病状的严重性；减少疾病病程的持续时间；改善或消除与疾病或病状相关联的一种或多种症状；向患有疾病或病状的受试者提供有益效应，不一定治愈所述疾病或病状，但不包括防治或预防血友病性关节病或其症状。在一个实施方案中，术语“治疗”意指改善受试者的血友病关节健康计分(HJHS)或修改的HJHS(mHJHS)。在一些实施方案中，总体HJHS或mHJHS得到改善。在一些实施方案中，一个或多个目标关节的个别计分得到改善。在一些实施方案中，术语“治疗”意指改善受试者的生活质量(QoL)计分。在某些实施方案中，QoL计分分析关于以下的受试者的安排：运动和休闲、身体健康、处理血友病、计划生育、感觉(关于血友病)未来、伴侣和***、治疗、(自己的)观点、工作和学习或其任何组合。在其他实施方案中，术语“治疗”意指减轻一种或多种微出血的效应和/或严重性。在另一个实施方案中，术语“治疗”意指减轻一个或多个目标关节的肿胀和/或炎症和/或疼痛。在另一个实施方案中，术语“治疗”意指减轻一个或多个目标关节的血管重塑。

如本文所用的“预防(Prevent/preventing)”是指减少或减轻特定结果的发生或严重性。在一些实施方案中，预防结果通过预防性治疗达成。

如本文所用的术语“相当”意指由使用例如嵌合多肽产生的比较速率或水平等于、实质上等于或类似于参考速率或水平。如本文所用的术语“类似”意指比较速率或水平与参考速率或水平(例如，基本上由两个Fc部分和加工的FVIII组成或由其组成的嵌合多肽的FXa产生速率，其中所述加工的FVIII融合至两个Fc部分的一个Fc)相差不大于10％或不大于15％。术语“实质上相等”意指比较速率或水平与参考速率或水平相差不大于0.01％、0.5％或1％。

如本文所用的止血障碍意指特征在于由于形成纤维蛋白凝块的能力受损或不能形成纤维蛋白凝块而有自发出血或由于创伤而出血的倾向的基因遗传性或获得性病状。此类病症的实例包括血友病。三种主要形式为A型血友病(因子VIII缺乏症)、B型血友病(因子IX缺乏症或“克雷司马斯病(Christmas disease)”)和C型血友病(因子XI缺乏症，轻度出血倾向)。其他止血障碍包括例如冯·维勒布兰德氏病；因子XI缺乏症(PTA缺乏症)；因子XII缺乏症；纤维蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子X或因子XIII缺乏症或结构异常；伯纳德-苏里尔综合征(Bernard-Soulier syndrome)，其为一种GPIb缺陷症或缺乏症。VWF的受体GPIb可为有缺陷的并且导致缺乏初级凝块形成(初级止血)和流血倾向增加、以及格兰茨曼和内格利血小板无力症(thrombasthenia of Glanzman and Naegeli)(格兰茨曼血小板无力症)。在肝衰竭(急性和慢性形式)中，由肝产生的凝血因子存在不足；这可增加流血风险。

如本文所用的“血浆浓度对时间曲线下面积(AUC)”与药理学技术的术语相同，并且基于施用之后FVIII的吸收速率和程度。AUC在指定时间段(诸如12、18、24、36、48或72小时)内确定，或使用基于曲线斜率进行的外推来无限确定。除非本文另外指定，否则确定AUC为无限。AUC的确定可在单一受试者中进行，或在受试者群体中进行，其后计算平均值。

术语“促凝血活性”意指本发明的凝血因子(例如，FVIII或FIX蛋白)能够取代天然凝血因子(例如，天然FVIII或FIX)参与血液中的凝血级联。例如，当本发明的重组FIX蛋白可以在因子VIII(FVIII)存在下将因子X(FX)转化成活化因子X(FXa)时具有促凝血活性，如例如在显色分析中所测试。在另一个实施方案中，FIX活性为产生因子X酶(tenase)复合物的能力。在其他实施方案中，FIX活性为产生凝血酶(或凝块)的能力。

对免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或区域的氨基酸编号所进行的参考全部基于Kabat等人1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,美国公共***(U.S.Department of Public Health),Bethesda；MD，其以全文引用的方式并入本文中。(已从包括人类的若干哺乳动物物种分离出FcRn受体。已知人类FcRn、大鼠FcRn和小鼠FcRn的序列(Story等人,J.Exp.Med.180:2377(1994)，其以全文引用方式并入本文。)Fc可包含免疫球蛋白中具有或不具有免疫球蛋白铰链区的CH2结构域和CH3结构域。WO 2004/101740和WO 2006/074199中提供示例性Fc变体，所述专利以全文引用的方式并入本文中。

如本文所用的“杂合”多肽和蛋白意指嵌合多肽与第二多肽的组合。杂合物中的嵌合多肽和第二多肽可经由蛋白质-蛋白质相互作用(诸如电荷-电荷或疏水性相互作用)彼此缔合。杂合物中的嵌合多肽和第二多肽可经由二硫键或其他共价键彼此缔合。杂合物描述于WO 2004/101740和WO 2006/074199中，所述专利各自以全文引用的方式并入本文中。也参见美国专利第7,404,956号和第7,348,004号，所述专利各自均以全文引用的方式并入本文中。第二多肽可为同一嵌合多肽的第二拷贝或其可为不相同的嵌合多肽。

如本文所用，在蛋白质序列中“对应于...的氨基酸”、“对应于...的位点”或“等效氨基酸”通过对准以使第一蛋白质序列(例如，FVIII或FIX序列)与第二蛋白质序列(例如，第二FVIII或第二FIX序列)之间的同一性或相似性最大化来识别。用于识别第二蛋白质序列中的等效氨基酸的编号基于用于识别第一蛋白质序列中的对应氨基酸的编号。

如本文所用，术语“***位点”是指多肽(通常为成熟多肽；例如成熟FVIII或成熟FIX多肽)或其片段、变体或衍生物中紧靠可***异源部分的位置上游的位置。以编号指定“***位点”，所述编号是指定蛋白序列中由***位点所对应的氨基酸的编号，所述氨基酸紧靠***位置的N末端方向。例如，短语“EGF2结构域在对应于给定序列的氨基酸105的***位点处包含异源部分”指示异源部分位于对应于所述序列的氨基酸105和氨基酸106的两个氨基酸之间。然而，本领域技术人员将能够容易地识别指定蛋白质的任何变体中的对应位置，并且本公开不限于仅在本文具体公开的变体中进行的***。相反，本文所公开的***可在任何相关变体或其具有活性的片段中对应于本文所公开的变体的位置处进行。

如本文所用，短语“紧靠氨基酸的下游”是指紧接于氨基酸的末端羧基的位置。类似地，短语“紧靠氨基酸的上游”是指紧接于氨基酸的末端氨基的位置。因此，如本文所用的短语“在***位点的两个氨基酸之间”是指异源部分(例如，半衰期延长部分)***在两个相邻氨基酸之间所处的位置。

如本文所用的术语“***”、“被***”、“***至...中”或语法相关术语是指相对于指定蛋白质(例如，FVIII或FIX蛋白)中相似位置，异源部分(例如，半衰期延长部分)在融合多肽中的位置。本领域技术人员应理解如何识别与其他多肽序列(例如，其他FVIII和FIX变体)对应的***位置。如本文所用，所述术语是指本文所公开的重组多肽的特征，并且不指示、暗示或意指制备融合多肽的任何方法或过程。例如，对于本文提供的融合多肽，短语“将异源部分***紧邻FIX多肽的残基105下游的EGF2结构域中”意指所述融合多肽在紧邻对应于特定FIX变体中的氨基酸105的氨基酸的下游包含异源部分，其例如由对应于FIX变体的氨基酸105和106的氨基酸所界定。

“融合“或“嵌合”蛋白包括第一氨基酸序列连接于在自然界中其未天然连接的第二氨基酸序列。通常存在于各别蛋白质中的氨基酸序列可一起形成融合多肽，或通常存在于同一蛋白质中的氨基酸序列可以新排列安置在融合多肽中，所述融合多肽例如为本发明的FVIII结构域或FIX结构域与Ig Fc结构域的融合物。融合蛋白例如通过化学合成，或通过产生并翻译以所需关系编码肽区的多核苷酸来产生。融合蛋白可进一步包含通过共价非肽键或非共价键与第一氨基酸序列缔合的第二氨基酸序列。

术语“异源”和“异源部分”意指多核苷酸、多肽或其他部分源于与其相比较的实体不同的实体。例如，异源多肽可为合成多肽，或源于不同物种、个体的不同细胞类型或不同个体的相同或不同类型的细胞。在一个方面中，异源部分为与另一多肽融合以产生融合多肽或蛋白质的多肽。在另一方面中，异源部分为与多肽或蛋白质结合的非多肽，诸如PEG。

如本文所用，术语“连接”和“融合”是指第一氨基酸序列或核苷酸序列分别共价或非共价接合至第二氨基酸序列或核苷酸序列。第一氨基酸或核苷酸序列可直接接合或相邻于第二氨基酸或核苷酸序列，或者间插序列可将第一序列共价接合于第二序列。术语“连接”不仅意指第一氨基酸序列在C末端或N末端融合于第二氨基酸序列，而且还包括将整个第一氨基酸序列(或第二氨基酸序列)***第二氨基酸序列(或相应地第一氨基酸序列)中的任何两个氨基酸中。在一个实施方案中，第一氨基酸序列通过肽键或接头连接至第二氨基酸序列。第一核苷酸序列可通过磷酸二酯键或接头连接于第二核苷酸序列。接头可为肽或多肽(用于多肽链)或核苷酸或核苷酸链(用于多个核苷酸链)或任何化学部分(用于多肽与多核苷酸链两者)。术语“连接”也通过连字符(-)加以指示。

如本文所用，术语“与…缔合”是指第一条氨基酸链与第二条氨基酸链之间形成的共价键或非共价键。在一个实施方案中，术语“与…缔合”意指共价非肽键或非共价键。此缔合可由冒号，即(：)指示。在另一个实施方案中，所述缔合意指除肽键之外的共价键。例如，氨基酸半胱氨酸包含可与第二半胱氨酸残基上的硫醇基形成二硫键或二硫桥的硫醇基。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1区与CL区通过二硫键缔合并且两条重链通过两个二硫键在对应于239和242的位置处缔合，所述位置为使用Kabat编号系统(位置226或229，EU编号系统)。共价键的实例包括但不限于肽键、金属键、氢键、二硫键、ζ键、π键、δ键、糖苷键、抓氢键、弯曲键、偶极键、π反向键、双键、三键、四键、五键、六键、共轭、超共轭、芳香性、哈普托数(hapticity)或反键作用。非共价键的非限制性实例包括离子键(例如阳离子π键或盐键)、金属键、氢键(例如二氢键、二氢复合物、低屏障氢键或对称氢键)、范德华力(van derWalls force)、伦敦分散力(London dispersion force)、机械键(mechanical bond)、卤素键、亲金作用(aurophilicity)、嵌入、堆积作用、熵力(entropic force)或化学极性。

如本文所用，术语“裂解位点”或“酶促裂解位点”是指由酶识别的位点。某些酶促裂解位点包括细胞内加工位点。在一个实施方案中，多肽具有由在凝血级联期间活化的酶裂解的酶促裂解位点，因此此类位点的裂解发生在凝块形成的部位处。示例性此类位点包括例如由凝血酶、因子XIa或因子Xa识别者。其他酶促裂解位点为在本领域中已知的。

如本文所用，术语“加工位点”或“细胞内加工位点”是指多肽中一种类型的酶促裂解位点，其为在所述多肽翻译之后起作用的酶的靶标。在一个实施方案中，此类酶在自高尔基体腔(Golgi lumen)转运至反面高尔基体(trans-Golgi)区室期间起作用。细胞内加工酶在蛋白质从细胞分泌之前裂解多肽。此类加工位点的实例包括例如由内肽酶的PACE/弗林蛋白酶(furin)(其中PACE为成对碱性氨基酸裂解酶(Paired basic Amino acid CleavingEnzyme)的首字母缩略词)家族所靶向的那些位点。此类酶定位于高尔基体膜并且在序列基序Arg-[任何残基]-(Lys或Arg)-Arg的羧基末端侧上裂解蛋白质。如本文所用，“弗林蛋白酶”酶家族包括例如PCSK1(也称为PC1/Pc3)、PCSK2(也称为PC2)、PCSK3(也称为弗林蛋白酶或PACE)、PCSK4(也称为PC4)、PCSK5(也称为PC5或PC6)、PCSK6(也称为PACE4)、或PCSK7(也称为PC7/LPC、PC8或SPC7)。其他加工位点为本领域中已知的。

在包含多于一个加工或裂解位点的构建体中，应了解此类位点可为相同或不同。

如本文所用，“可加工接头”是指包含至少一个在本文中其他地方描述的细胞内加工位点的接头。

如本文所用的“基线”为在施用剂量之前受试者中给定分析物(例如，凝血因子(例如，FVIII或FIX))的最低测量血浆水平。血浆水平可在给药之前的两个时间点测量：在筛检访视时和即将给药之前。或者，(a)治疗前凝血因子活性<1％、不具有可检测凝血因子抗原并具有无意义基因型的受试者的基线可定义为0％，(b)治疗前凝血因子活性<1％并具有可检测凝血因子抗原的受试者的基线可设置为0.5％，(c)治疗前凝血因子活性在1-2％之间的受试者的基线为C_min(在整个PK研究期间的最低活性)，并且(d)治疗前凝血因子活性≥2％的受试者的基线可设置为2％。

如本文所用的“等效剂量”意指与用国际单位表述相同的凝血因子活性(例如，FVIII活性或FIX活性)的剂量，其与所述多肽的分子量无关。例如，一个国际单位(IU)的FVIII活性大致对应于一毫升正常人类血浆中的FVIII的量。若干分析可用于测量凝血因子活性，包括欧洲药典显色底物分析和单级凝血分析。

如本文所用，“给药间隔”意指向受试者施用的多次剂量之间逝去的时间量。给药间隔的比较可在单一受试者中或在受试者群体中进行，并且接着可计算在所述群体中获得的平均值。

如本文所用的“受试者”意指人类个体。受试者可为当前正罹患出血病症或预期有此治疗需要的患者。在一些实施方案中，受试者先前从未用凝血因子进行治疗(即，所述受试者为先前未治疗受试者或先前未治疗患者)。在一些实施方案中，所述受试者为胎儿，并且所述方法包含向胎儿的母亲施用组合物(例如，嵌合多肽)，并且向受试者的施用从母亲跨胎盘发生。在一些实施方案中，受试者为儿童或成人。在一些实施方案中，受试者为小于一岁、小于两岁、小于三岁、小于四岁、小于五岁、小于六岁、小于七岁、小于八岁、小于九岁、小于十岁、小于十一岁或小于十二岁的儿童。在一些实施方案中，儿童小于一岁。在某些实施方案中，受试者小于6岁。在其他实施方案中，受试者为6岁与小于12岁之间。在其他实施方案中，受试者为12岁或更大年龄。在一些实施方案中，儿童或成人受试者产生出血病症，其中出血病症的症状为在一岁之后发作。在一些实施方案中，向受试者施用组合物(例如，嵌合多肽)足以预防、抑制或减少针对凝血因子的选自以下的免疫反应的产生：体液免疫反应、细胞介导的免疫反应、或体液免疫反应和细胞介导的免疫反应两者。

如本文所用(可互换)的“治疗剂量”、“剂量”、“有效剂量”或“给药量”意指实现如本文所述的治疗目标的剂量。在一些实施方案中，“治疗剂量”意指与治疗之前的HJHS、mHJHS或QoL计分相比，改善HJHS、mHJHS或QoL计分的剂量。在一些实施方案中，“治疗剂量”意指与治疗之前关节的肿胀、炎症和/或疼痛水平相比，减轻受试者的一个或多个关节的肿胀、炎症和/或疼痛的剂量。在一些实施方案中，“治疗剂量”意指与治疗之前微出血的效应和/或严重性相比，减轻一种或多种微出血的效应和/或严重性的剂量。在另一个实施方案中，“治疗剂量”意指与治疗之前的血管重塑相比，减轻一个或多个目标关节的血管重塑的剂量。

本发明中还包括多肽的片段或变体及其任何组合。术语“片段”或“变体”当指代本公开的方法中所用的多肽时包括保留参考多肽的至少一些特性(例如，对FVIII或FIX变体的Fc变体或凝血活性)的任何多肽。除在本文中其他地方讨论的特异性抗体片段之外，多肽的片段也包括蛋白水解片段以及缺失片段，但不包括天然存在的全长多肽(或成熟多肽)。本公开的方法中使用的多肽结合结构域或结合分子的变体包括如上所述的片段以及氨基酸序列由于氨基酸取代、缺失或***而改变的多肽。变体可为天然存在的或非天然存在的。非天然存在的变体可使用本领域已知的诱变技术来产生。变异多肽可包含保守性或非保守性氨基酸取代、缺失或添加。本文所公开的一个特定FIX变体为R338L FIX(Padua)变体。参见例如，Simioni,P.等人,“X-Linked Thrombophilia with a Mutant Factor IX(FactorIX Padua),”NEJM 361:1671-75(2009年10月)，其以全文引用的方式并入本文中。

“保守性氨基酸取代”为氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中加以定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，如果多肽中的氨基酸被来自同一侧链家族的另一氨基酸置换，则所述取代被认为是保守的。在另一个实施方案中，可将一连串氨基酸用侧链家族成员的顺序和/或组成不同的结构上相似的氨基酸串保守地置换。

术语两个多核苷酸或多肽序列之间的“序列同一性百分比”是指在比较窗口上由所述序列共享的相同匹配位置数，其考虑到为进行两个序列的最佳比对必须引入的添加或缺失(即间隙)。匹配位置为靶序列和参考序列二者中存在相同核苷酸或氨基酸的任何位置。靶序列中存在的间隙不做计数，因为间隙不是核苷酸或氨基酸。同样，参考序列中存在的间隙不做计数，因为对靶序列核苷酸或氨基酸计数，而不对来自参考序列的核苷酸或氨基酸计数。

通过以下方式来计算序列同一性百分比：测定两个序列中存在相同氨基酸残基或核酸碱基的位置的数目以产生匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数并且将结果乘以100，以得到序列同一性百分比。两个序列之间序列的比较和序列同一性百分比的测定可使用供在线使用与下载两者的可易于得到的软件完成。适合软件程序可从各种来源获得，并且可用于比对蛋白质和核苷酸序列。一种适于测定序列同一性百分比的程序为bl2seq，其为可从美国政府的国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)BLAST网站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)获得的BLAST程序套件的一部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法进行两个序列之间的比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。其他适合程序为例如Needle、Stretcher、Water或Matcher，其为生物信息程序的EMBOSS套件的一部分，并且也可获自欧洲生物信息研究所(EBI)的www.ebi.ac.uk/Tools/psa。

与多核苷酸或多肽参考序列比对的单个多核苷酸或多肽靶序列内的不同区域可各自具有其自身的序列同一性百分比。应注意，将序列同一性百分比值舍入至最接近的十分位。举例而言，将80.11、80.12、80.13和80.14向下舍入至80.1，而将80.15、80.16、80.17、80.18和80.19向上舍入至80.2。也注意，长度值将始终为整数。

本领域技术人员将理解，用于计算序列同一性百分比的序列比对的产生不限于唯一地由原始序列数据驱动的二进制序列-序列比较。序列比对可来源于多重序列比对。一种产生多序列比对的适合程序为ClustalW2，其可获自www.clustal.org。另一种适合程序为MUSCLE，其可获自www.drive5.com/muscle/。ClustalW2和MUSCLE可替代地获自例如EBI。

也应理解，序列比对可通过将序列数据与异质来源的数据整合产生，所述异质来源的数据诸如结构数据(例如，结晶蛋白结构)、功能数据(例如，突变位置)或系统发生数据。整合异类数据以产生多重序列比对的适合程序为T-Coffee，其获自www.tcoffee.org并且可替代地获自例如EBI。也应了解用于计算序列同一性百分比的最终比对可自动或手动策划。

多核苷酸变体可在编码区、非编码区或两者中含有改变。在一个实施方案中，多核苷酸变体含有产生沉默取代、添加或缺失，但不改变所编码多肽的性质或活性的改变。在另一个实施方案中，核苷酸变体由于遗传密码的简并性而由沉默取代产生。在其他实施方案中，以任何组合取代、缺失或添加5-10、1-5、或1-2个氨基酸的变体。多核苷酸变体可出于多种原因，例如为了优化特定宿主的密码子表达(使人类mRNA中的密码子变成其他密码子，例如细菌宿主诸如大肠杆菌(E.coli))而产生。

天然存在的变体称为“等位基因变体”并且是指占据生物体的染色体上给定基因座的基因的若干替代形式之一(Genes II,Lewin,B.编,John Wiley&Sons,New York(1985))。这些等位基因变体可在多核苷酸和/或多肽水平上变化并且包括在本公开中。或者，非天然存在的变体可通过诱变技术或通过直接合成来产生。

使用蛋白质工程改造和重组DNA技术的已知方法，可产生变体以改善或改变多肽的特征。例如，可从分泌蛋白质的N末端或C末端缺失一个或多个氨基酸而不实质性损失生物功能。Ron等人,J.Biol.Chem.268:2984-2988(1993)(以全文引用方式并入本文)报导甚至在缺失3、8或27个氨基端氨基酸残基之后仍具有肝素结合活性的变体KGF蛋白。类似地，在从干扰素γ的羧基末端缺失8-10个氨基酸残基之后，此蛋白质展现活性增高多达十倍。(Dobeli等人,J.Biotechnology 7:199-216(1988)，其以全文引用方式并入本文。)

此外，充足证据显示变体常保留与天然存在的蛋白质的生物活性类似的生物活性。例如，Gayle和同事(J.Biol.Chem.268:22105-22111(1993)，其以全文引用方式并入本文)对人类细胞激素IL-1a进行了广泛的突变分析。他们使用随机诱变来产生超过3,500种个别IL-1a突变体，每个变体在分子总长度上具有平均2.5个氨基酸变化。检查每个可能的氨基酸位置处的多个突变。研究者发现“[大多数]分子可在对[结合或生物活性]的影响极小的情况下进行改变”。(参见摘要。)实际上，在检查的3,500个以上核苷酸序列中，仅23个独特氨基酸序列产生活性显著不同于野生型的蛋白质。

如上文所述，多肽变体包括例如修饰的多肽。修饰包括例如乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价连接黄素、共价连接血红素部分、共价连接核苷酸或核苷酸衍生物、共价连接脂质或脂质衍生物、共价连接磷脂酰肌醇、交联、环化、二硫键形成、去甲基、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化(Mei等人,Blood 116:270-79(2010)，其以全文引用的方式并入本文中)、蛋白水解处理、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转移-RNA介导的向蛋白质添加氨基酸(诸如精氨酰化)以及泛素化。在一些实施方案中，在任何方便位置处修饰FVIII，例如聚乙二醇化。在一些实施方案中，在FVIII的表面暴露的氨基酸(例如表面暴露半胱氨酸)处将FVIII聚乙二醇化，其可为工程改造的半胱氨酸。同上。在一些实施方案中，修饰的FVIII(例如，聚乙二醇化FVIII)为嵌合或融合FVIII。

术语“下游”是指位于参考核苷酸序列的3'方向的核苷酸序列。“下游”也可指位于参考肽序列的C末端的肽序列。

术语“上游”是指位于参考核苷酸序列的5'方向的核苷酸序列。“上游”也可指位于参考肽序列的N末端的肽序列。

如本文所用，术语“调控区”是指位于编码区的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)，并且影响所缔合的编码区的转录、RNA加工、稳定性或翻译的核苷酸序列。调控区可包含启动子、翻译前导序列、内含子、聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应物结合位点和茎-环结构。如果编码区意图在真核细胞中表达，则聚腺苷酸化信号和转录终止序列通常将位于编码序列的3'方向。

编码基因产物(例如多肽)的多核苷酸可包括与一个或多个编码区可操作地缔合的启动子和/或其他转录或翻译控制元件。除启动子之外的其他转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏子和转录终止信号，也可与编码区可操作地缔合以引导基因产物表达。

本领域技术人员已知多个转录控制区。所述转录控制区包括但不限于，在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，诸如但不限于，来自巨细胞病毒(立即早期启动子与内含子A的组合)、猿猴病毒40(早期启动子)和逆转录病毒(诸如劳斯肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其他转录控制区包括源于脊椎动物基因，诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β-球蛋白的那些控制区，以及能够控制真核细胞中的基因表达的其他序列。其他适合的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子，以及淋巴因子诱导性启动子(例如，可由干扰素或白介素诱导的启动子)。

类似地，本领域普通技术人员已知多种翻译控制元件。所述元件包括但不限于，核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子和源自于细小核糖核酸病毒的元件(特别是内部核糖体进入位点，或IRES，又称为CITE序列)。

如本文所用，术语“表达”是指多核苷酸藉以产生基因产物(例如RNA或多肽)的过程。

“载体”是指用于将核酸克隆和/或转移至宿主细胞中的任何媒介物。载体可为可与另一个核酸区段连接以使所连接区段复制的复制子。“复制子”是指在体内充当自主复制单元，即能够在自身控制下复制的任何遗传元件(例如质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒)。术语“载体”包括用于体外、离体或体内将核酸引入细胞中的病毒载体和非病毒载体。本领域中已知且使用许多载体，包括例如质粒、修饰的真核病毒或修饰的细菌病毒。将多核苷酸***适合载体中可通过将适当多核苷酸片段连接至具有互补粘性末端的所选载体中来达成。

术语“质粒”是指染色体外元件，其常携带不为细胞的重要代谢的部分的基因，并且通常呈环状双链DNA分子形式。此类元件可为源于任何来源的具有单链或双链DNA或RNA的线性、环状或超螺旋自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中多种核苷酸序列已接合或重组成能够将启动子片段和所选基因产物的DNA序列连同适当3'未翻译序列一起引入细胞中的独特构造。

可使用的真核病毒载体包括但不限于腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体和痘病毒(例如牛痘病毒)载体、杆状病毒载体或疱疹病毒载体。非病毒载体包括质粒、脂质体、带电荷脂质(细胞转染剂)、DNA-蛋白质复合物和生物聚合物。

“克隆载体”是指一种“复制子”，其为依序复制并且包含复制起点的单位长度的核酸(诸如质粒、噬菌体或粘粒)，另一个核酸区段可与其连接以达成所连接区段的复制。某些克隆载体能够在一个细胞类型(例如细菌)中复制并且在另一细胞类型(例如真核细胞)中表达。克隆载体通常包含一种或多种可用于选择包含载体的细胞的序列和/或一个或多个用于***相关核酸序列的多个克隆位点。

术语“表达载体”是指被设计成使***的核酸序列能够在***宿主细胞中之后表达的载体。***的核酸序列为以与如上所述的调控区可操作缔合的方式设置。

通过本领域中熟知的方法将载体引入宿主细胞中，所述方法例如转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂质体转染(溶酶体融合)、使用基因枪、或DNA载体转运体。

“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物是指不在天然环境中的多肽。不要求特定纯化水平。例如，分离的多肽可仅从其原生或天然环境移除。出于本发明的目的，在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质被认为是分离的，已通过任何适合技术分离、分馏或部分地或实质上纯化的天然或重组多肽也被认为是分离的。

如本文所用，术语“宿主细胞“”是指带有或能够带有重组核酸的细胞或细胞群体。宿主细胞可为原核细胞(例如，大肠杆菌(E.coli))，或者可替代地，宿主细胞可为真核细胞，例如真菌细胞(例如，酵母细胞，诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))和各种动物细胞，诸如昆虫细胞(例如，Sf-9)或哺乳动物细胞(例如，HEK293F、CHO、COS-7、NIH-3T3)。

如本文所用的“稳定状态分布体积(Vss)”具有与药理学中所用的术语相同含义，其为药物分布于其中的外观空间(体积)。Vss＝在稳定状态下体内药物的量除以血浆浓度。

II.本发明的方法

本公开是基于融合至Fc区的凝血因子可用于逆转血友病性关节病的发现。先前已知血友病性关节病一旦发展便为不可逆的，因为软组织变化仅可通过MRI显现。当前已知的针对罹患血友病性关节病的个体的选择包括手术或硬化剂以去除肥大滑膜。硬化剂(放射性或化学材料)可阻碍进一步软骨和骨退化；但是，它不能逆转血友病性关节病。当控制滑膜肥大的其他努力失败时，膝关节和髋关节的关节造形术已成功地减轻了活动疼痛和活动丧失。Hilgartner M.,Current Opinion in Pediatrics:February 2002,V14,第1期,第46-49页。

因此本公开提供治疗患有血友病的人类关节的血友病性关节病的方法，其包括向所述人类施用有效量的包含凝血因子和Fc区的组合物(例如，嵌合蛋白)或编码所述嵌合蛋白的多核苷酸。血友病性关节病的治疗可部分地或完全地逆转血友病性关节病(例如，血友病性关节病的一个或多个症状)。因此，在一个实施方案中，本公开提供一种治疗患有血友病的人类的方法，所述人类已经发展了血友病性关节病，例如，滑膜炎。

一般而言，血友病性关节病是指发生于罹患血友病的人类受试者中呈长期结果或反复出血至受试者关节中的关节疾病。自发性出血至一个或多个关节中在血友病患者中是常见的。在6个月时间段内若干次连续出血的关节常称为“目标关节”，并且此类关节常进展成血友病性关节病。

血友病性关节病可呈现有各种症状，包括但不限于滑膜增生、慢性炎症(包括滑膜炎)、纤维化、含铁血黄素沉着病、关节下囊肿形成、疼痛、活动范围减小、肌肉萎缩、关节僵直、骨质疏松、软骨退化伴关节空间塌陷及其任何组合。血友病性关节病包括各种阶段：(i)第I阶段，包括软组织肿胀，但无骨骼异常；(ii)第II阶段，包括骨骺的过度生长和骨质疏松，维持关节完整性。不存在骨囊肿，并且不存在关节软骨空间狭窄。放射学第II阶段平行于亚急性血友病性关节病的临床阶段；(iii)第III阶段，包括最小至中度关节空间狭窄伴软骨下囊肿。扩大至膝盖的髁间切迹和尺骨滑车切迹。在膝盖中可有髌骨变方。关节软骨仍保留并且血友病性关节病仍为可逆的；(iv)第IV阶段，包括关节软骨破坏伴重度关节空间狭窄。第III阶段中可见的其他骨性变化更明显；以及(v)第V阶段，包括关节空间全部丧失伴关节的纤维性关节强直。关节结构与重度骨骺不规则肥大有显著的不一致。

本公开表明使用包含凝血因子和Fc区的组合物(例如，嵌合蛋白)的治疗能够减轻和/或改善可逆性血友病性关节病的症状。在一些实施方案中，组合物(例如，嵌合蛋白)可治疗血友病性关节病的一个或多个阶段，例如，第I、II和/或III阶段。如本文所用，“可逆性”血友病性关节病为血友病性关节病的可在治疗之后部分或完全恢复至其原始的健康状态的表现。相反，“不可逆性”血友病性关节病为血友病性关节病的永久的且在治疗之后将得不到改善的表现。因此，本发明方法可改善、减轻或改善(或部分地或完全地逆转)血友病性关节病的一个或多个症状，例如，滑膜增生、慢性炎症(包括滑膜炎)、含铁血黄素沉着病、关节下囊肿形成、疼痛、活动范围减小、肿胀、血管重塑或其任何组合。

使用本公开的方法治疗的血友病性关节病(可逆性)可影响体内的任何关节。在一些实施方案中，关节为载荷关节，例如选自由以下组成的组的关节：一个或两个膝关节、一个或两个踝关节、一个或两个髋关节、一个或多个足部关节及其任何组合。在另一个实施方案中，关节为非载荷关节，例如,，选自由以下组成的组的关节：一个或两个肘关节、一个或两个肩关节、一个或两个腕关节、一个或多个手部关节或其任何组合。在另一个实施方案中，关节为膝关节。

在一些实施方案中，所述可逆性血友病性关节病包括滑膜炎。滑膜炎是指关节周围的滑膜炎症。在一些实施方案中，滑膜炎为体内任何关节的滑膜炎。在一些实施方案中，滑膜炎呈现为关节肿胀，并且本公开的方法减轻关节肿胀。在一些实施方案中，滑膜炎呈现为关节疼痛，并且本公开的方法减轻关节疼痛。在其他实施方案中，滑膜炎呈现为关节的活动范围减小，并且本发明的方法增加关节的活动范围。

在其他实施方案中，可逆性血友病性关节病包括关节中微出血。在一些实施方案中，可逆性血友病性关节病为微出血的结果。微出血是指一个或多个关节中非常少量的出血，其可在反复发生之后引起血友病性关节病。在一些实施方案中，可逆性血友病性关节病包括急性关节出血。在一些实施方案中，可逆性血友病性关节病为急性关节出血的结果。急性关节出血是指一个或多个关节中更大量的出血事件。

在某些实施方案中，可逆性血友病性关节病包括一个或多个关节的炎症。在一些实施方案中，炎症为在体内任何关节中。在一些实施方案中，炎症呈现为关节肿胀，并且本公开的方法减轻关节肿胀。在一些实施方案中，炎症呈现为关节疼痛，并且本公开的方法减轻关节疼痛。在其他实施方案中，炎症呈现为关节活动范围减小，并且本发明的方法增加关节活动范围。在某些实施方案中，所述方法进一步提供在施用有效量的包含凝血因子和Fc区的组合物或嵌合蛋白之前测量一个或多个关节中的炎症。在一些实施方案中，所述方法进一步提供在施用有效量的包含凝血因子和Fc区的组合物或嵌合蛋白之后测量一个或多个关节中的炎症。

在其他实施方案中，血友病性关节病通过与关节炎症和/或关节损伤相关联的一个或多个生物标记物的表达来证明。在一些实施方案中，人类中一个或多个生物标记物上调，指示关节炎症和/或关节损伤增加。在一些实施方案中，人类中一个或多个生物标记物下调，指示关节炎症和/或关节损伤增加。在一些实施方案中，需要治疗的人类基于与对使用本公开的方法进行的治疗的反应性增加相关联的一个或多个生物标记物的表达来识别。

在一些实施方案中，本发明方法增加凝血因子至一个或多个目标关节的定位。在某些实施方案中，包含凝血因子和Fc区的组合物或嵌合蛋白在施用之后定位至目标关节比单独施用凝血因子多。在某些实施方案中，包含凝血因子和Fc区的组合物或嵌合蛋白在施用之后保持定位至一个或多个目标关节所持续时间段比单独施用凝血因子长。

在其他实施方案中，本发明方法进一步包括识别展现可逆血友病性关节病的一个或多个标记物的受试者，并且然后施用包含凝血因子和Fc区的组合物或嵌合蛋白。

在一些实施方案中，本发明的方法预防或减少患有血友病的人类关节的血管重塑的发生。与血友病性关节病相关联的常见要素为关节(尤其是目标关节)周围的血管的重塑。血管重塑的特征可在于血管生成增加和微出血至关节中的发生增加。在一些实施方案中，本公开提供一种预防性治疗或减少患有血友病的人类关节的血管重塑的发生的方法，其包括向所述人类施用有效量的包含凝血因子和Fc区的组合物或嵌合蛋白。在其他实施方案中，本公开提供一种逆转现存的与患有血友病的人类关节的血友病性关节病相关联的血管重塑的方法，其包括向所述人类施用有效量的包含凝血因子和Fc区的组合物或嵌合蛋白。在一些实施方案中，血管重塑为在体内任何关节中。在某些实施方案中，血管重塑为在目标关节中。在其他实施方案中，血管重塑为在除目标关节之外的关节中。在某些实施方案中，血管重塑为在载荷关节中，例如选自由以下组成的组的关节：一个或两个膝关节、一个或两个踝关节、一个或两个髋关节、一个或多个足部关节及其任何组合。在另一个实施方案中，血管重塑为在非载荷关节中，例如选自由以下组成的组的关节：一个或两个肘关节、一个或两个肩关节、一个或两个腕关节、一个或多个手部关节或其任何组合。在另一个实施方案中，血管重塑为在膝关节中。在一些实施方案中，血管重塑为在肌肉中。在一些实施方案中，血管重塑为在脾和/或肝中。

在某些实施方案中，本发明方法改善患有血友病的人类关节的周围软组织。血友病性关节病的另一常见病理学为关节软组织的过度增殖。在一些实施方案中，通过本公开的方法改善的软组织为在体内任何关节中。在某些实施方案中，通过本公开的方法改善的软组织为在目标关节中。在其他实施方案中，通过本公开的方法改善的软组织为在除目标关节之外的关节中。

在一些实施方案中，本发明的方法减轻与关节软组织的过度增殖相关联的一个或多个症状的严重性。在一些实施方案中，关节软组织的过度增殖呈现为关节肿胀，并且本公开的方法减轻关节肿胀。在一些实施方案中，关节软组织的过度增殖呈现为关节疼痛，并且本公开的方法减轻关节疼痛。在其他实施方案中，关节软组织的过度增殖呈现为关节活动范围减小，并且本发明的方法增加关节活动范围。

本文所公开的方法可对已得到治疗并且已显示血友病性关节病减轻的受试者进行实践以预防一个或多个关节的血友病性关节病的进一步发展。在一些实施方案中，本公开的方法应用于受试者以治疗现存的一个或多个关节的血友病性关节病并预防一个相同或不同关节的进一步血友病性关节病的发展。

在一些实施方案中，本公开的方法允许凝血因子分布至血浆区室外以及血浆区室中的组织。

本公开的方法改善患有血友病的人类的一个或多个关节的关节健康。关节健康可使用本领域中已知的任何度量测量。在一些实施方案中，关节健康使用血友病关节健康计分(HJHS)系统测量(参见Feldman等人,“Hemophilia Joint Health Score(HJHS)2.1”，可在http://www.wfh.org/en/page.aspx？pid＝885(2016年11月18日最后一次访问)获得，其以全文引用的方式并入本文)。HJHS测量最常受血友病的出血影响的关节(膝关节、踝关节和肘关节)的关节健康(在身体结构和功能(即损害)领域中)。尽管其主要被设计用于具有轻度关节损害的4-18岁患有血友病的儿童(例如，在预防的情况下治疗)，但是它可应用于任何群体。在一些实施方案中，HJHS测量患有血友病的人类的左肘和右肘关节、左膝和右膝关节以及左踝和右踝关节中每一者的肿胀、(肿胀的)持续时间、肌肉萎缩、活动时捻发声、屈曲丧失、伸展丧失、关节疼痛和强度。在一些实施方案中，每个参数被分配数值计分。在一个特定实施方案中，标准HJHS 2.1版用于测量关节健康。在一些实施方案中，肿胀计分为0至3，其中0为无肿胀，并且3为重度肿胀。在一些实施方案中，肿胀的持续时间计分为0至1，其中0为无肿胀或肿胀少于6个月，并且1为肿胀多于或等于6个月。在一些实施方案中，肌肉萎缩计分为0至2，0为无萎缩，并且2为重度萎缩。在一些实施方案中，活动时捻发声计分为0至2，0为无活动时捻发声，并且2为重度活动时捻发声。在一些实施方案中，屈曲丧失计分为0至3，0为小于5°屈曲丧失，并且3为大于20°屈曲丧失。在一些实施方案中，伸展丧失计分为0至3，0为小于5°伸展丧失，并且3为大于20°伸展丧失。在一些实施方案中，关节疼痛计分为0至2，其中0为通过活动有效范围无疼痛，并且2为通过活动有效范围疼痛。在一些实施方案中，整体步态被计分，其中0反映出所有技能均在正常限度内；1、2和3分别反映出1、2和3个技能不在正常限度内；并且4反映出所有技能均不在正常限度内。在某些实施方案中，整体步态计分基于走路、走楼梯、跑步和/或单腿跳进行测量。在一些实施方案中，所述计分被组合以产生总计分。在其他实施方案中，一个或多个关节的个别计分被评估为一个或多个关节的健康的指示。

在其他实施方案中，修改的HJHS系统用于测量关节健康。在一些实施方案中，mHJHS与标准HJHS 2.1版的不同之处在于，与标准HJHS(范围，0-124)相比，关节疼痛和步态的反应选项被压缩成较少类别，增加了不稳定性评定，并且总计分较小(范围，0-116；0指示正常关节功能，116指示重度疾病)。排除在2周内出血之后的计分。最近一次观察的结转(last observation carry forward)输入经历手术介入的关节的计分。为了评估逐年变化，在此事后分析中包括在4个时间点(rFVIIIFc关键3期试验基线、rFVIIIFc延伸研究基线、rFVIIIFc延伸研究第1年和延伸研究第2年)具有mHJHS数据的rFVIIIFc延伸研究受试者。使用描述统计学概述从rFVIIIFc关键3期试验基线至rFVIIIFc延伸研究第2年的mHJHS计分变化(负值指示改善)。针对以下概述从rFVIIIFc关键3期试验基线至追踪访视的mHJHS计分变化：(1)总计分(范围，0-116；通过研究前方案(预防期对发病期)；通过基于初始mHJHS的功能损害的严重性；并且通过基线时目标关节的存在；(2)目标关节(范围，0-19：单一目标关节的所有问题的总和)；(3)承重(例如，踝和膝)和非承重(例如，肘)关节(范围，0-38：单一位置右关节和左关节的总和)；以及(4)个别分量(活动范围(范围，0-36；所有关节的问题“伸展丧失[踝背屈]”和“屈曲丧失[踝跖屈]”的组合)；肿胀(范围，0-24：所有关节的问题“肿胀”和“肿胀持续时间”的组合)；以及强度(范围，0-6：所有关节的总和))。

在一些实施方案中，对6个关节单独进行关节计分(左踝-LA、右踝-RA、左肘-LE、右肘-RE、左膝-LK、右膝-RK)。在一些实施方案中，肿胀根据以下进行计分：0＝无；1＝轻度；2＝中度；3＝重度。在一些实施方案中，肿胀持续时间根据以下进行计分：0＝无肿胀或≤6个月；1＝>6个月。在一些实施方案中，肌肉萎缩根据以下进行计分：0＝无；1＝轻度；2＝重度。在一些实施方案中，活动时捻发声根据以下进行计分：0＝不存在；1＝存在。在一些实施方案中，屈曲丧失(包括踝跖屈丧失)根据以下进行计分：0＝无；1＝轻度；2＝中度；3＝重度。在一些实施方案中，伸展丧失(包括踝背屈丧失)根据以下进行计分：0＝无；1＝轻度；2＝中度；3＝重度。在一些实施方案中，不稳定性根据以下进行计分：0＝无；1＝显著病理性关节松弛。在一些实施方案中，关节疼痛根据以下进行计分：0＝不疼痛，贯穿活动范围或活动范围端部；1＝存在。在一些实施方案中，强度根据以下进行计分：0＝正常(抵抗重力和最大抵抗力保持位置)；1＝最小下降(抵抗重力和中等抵抗力而不是最大抵抗力保持位置)；2＝轻度下降(抵抗重力或最小抵抗力保持位置)；3＝中度下降(消除重力时能够移动关节)；4＝重度下降(痕量或无肌肉收缩)。在某些实施方案中，对于计分在膝关节和肘关节处的屈曲丧失和伸展丧失，以下适用：无＝大约0-5度；轻度＝大约5-10度；中度＝大约11-20度；并且重度＝大约>20度。

在一些实施方案中，步态被计分一次(范围为0-2)，其中0＝走路或走上/下楼梯不困难；1＝走路不困难，但走楼梯困难；并且2＝走路和走楼梯均困难。

在某些实施方案中，根据以下类别和标度对6个关节(左踝-LA、右踝-RA、左肘-LE、右肘-RE、左膝-LK、右膝-RK)单独进行关节计分(每个关节的范围为0-19并且所有六个关节的范围为0-114)：肿胀(0＝无；1＝轻度；2＝中度；3＝重度)；0肿胀持续时间(0＝无肿胀或≤6个月；1＝>6个月)；肌肉萎缩(0＝无；1＝轻度；2＝重度)；活动时捻发声(0＝不存在；1＝存在)；屈曲丧失，包括踝跖屈丧失(0＝无；1＝轻度；2＝中度；3＝重度)；伸展丧失，包括踝背屈丧失(0＝无；1＝轻度；2＝中度；3＝重度)；不稳定性(0＝无；1＝显著病理性关节松弛)；关节疼痛(0＝不疼痛，贯穿活动范围或活动范围端部；1＝存在)；强度(0＝正常(抵抗重力和最大抵抗力保持位置)；1＝最小下降(抵抗重力和中等抵抗力而不是最大抵抗力保持位置)；2＝轻度下降(抵抗重力或最小抵抗力保持位置)；3＝中度下降(消除中立时能够移动关节)；4＝重度下降(痕量或无肌肉收缩)；其中，对于计分膝关节和肘关节的屈曲丧失和伸展丧失，以下适用：无＝大约0-5度；轻度＝大约5-10度；中度＝大约11-20度；并且重度＝大约>20度。

在一些实施方案中，本公开提供一种治疗患有血友病的人类关节的可逆性血友病性关节病的方法，其包括向所述人类施用有效量的包含凝血因子和Fc区的组合物或嵌合蛋白，其中所述施用相对于所述施用之前HJHS计分改善所述人类的HJHS计分。在一些实施方案中，HJHS计分为总HJHS计分，其包括测量的所有关节计分加上整体步态计分的和。在一些实施方案中，HJHS计分为总HJHS计分，其包括测量的所有关节计分但无整体步态计分的和。在其他实施方案中，HJHS计分为针对一个或两个肘关节、一个或两个膝关节、一个或两个踝关节或其任何组合。在一个特定实施方案中，HJHS计分为针对肘关节。在另一个实施方案中，HJHS计分为针对膝关节。在另一个实施方案中，HJHS计分为针对踝关节。在另一个实施方案中，HJHS计分反映整体步态。

在一些实施方案中，本公开提供一种治疗患有血友病的人类关节的可逆性血友病性关节病的方法，其包括向所述人类施用有效量的包含凝血因子和Fc区的组合物或嵌合蛋白，其中所述施用减轻所述人类的关节疼痛。在一些实施方案中，相对于施用之前的关节疼痛，关节疼痛减轻。在某些实施方案中，所述方法进一步提供在施用有效量的包含凝血因子和Fc区的组合物或嵌合蛋白之前测量一个或多个关节中的关节疼痛。在一些实施方案中，所述方法进一步提供在施用有效量的包含凝血因子和Fc区的组合物或嵌合蛋白之后测量一个或多个关节中的关节疼痛。

在某些实施方案中，在人类的一个或多个关节中观察到本发明方法的效应。在一些实施方案中，在至少一个关节中观察到本发明方法的效应。在一些实施方案中，在至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个关节中观察到本发明方法的效应。

在一些实施方案中，本公开的方法进一步包括识别需要治疗的人类，例如，识别患有血友病性关节病的受试者。血友病性关节病可使用本领域中已知的任何方法检测和/或监测。在一些实施方案中，成像系统用于检测和/或监测受试者的血友病性关节病。在一些实施方案中，成像系统包括本领域中已知用于表征关节的任何成像系统。例如，在某些实施方案中，所述成像系统包括放射线摄影术、磁共振成像、超声波检查术、能量多普勒音波检查术或其任何组合。

在一些实施方案中，受试者先前用未融合至Fc部分的凝血因子蛋白治疗。此凝血因子可为全长或成熟凝血因子。在一些实施方案中，此凝血因子可为KOGENATEHELIXATE /REFACTOHEMOFIL-MONARC-MONOCLATE-HUMATE- KOATE- 和HYATE:

II.A.嵌合蛋白

本文公开的治疗可逆性血友病性关节病的方法一般是包含凝血因子和Fc区的可适用嵌合蛋白或组合物，其中所述凝血因子可为任何已知的凝血因子、其片段或其变体，并且其中所述Fc区可为任何已知的Fc区、其片段或其变体。在一些实施方案中，所述组合物包含含有凝血因子和Fc区的嵌合蛋白。在一些实施方案中，凝血因子选自由以下组成的组：因子VII(FVII)、因子VIIa(FVIIa)、因子VIII(FVIII)、因子IX(FIX)、因子(FX)、冯·维勒布兰德因子(VWF)或其任何组合。因此，关于FVIIIFc和FIXFc嵌合多肽及其用途的本公开同样适用于包含凝血因子部分和Fc区的其他嵌合多肽。任何凝血因子、或其任何片段、或其任何变体均可用于本公开的方法。

不受理论约束，据信融合至凝血因子的Fc区适用于治疗可逆性血友病性关节病。血友病的炎症在出血至关节中期间发生。已显示，TNF-α(涉及血友病性关节病的炎性细胞因子)诱导NF-κB信号传导并且从而上调人类单核细胞中的FcRn表达(Liu等人,J Immunol,2007.179(5):第2999-3011页)。FcRn因此可在炎症部位处上调，使含Fc蛋白通过结合至受体Fc受体定位于炎症部位以作为调控炎性过程的一部分。融合至凝血因子的Fc区也可与抑制性Fc受体相互作用，抑制Fc受体可造成免疫调节和炎性途径的下调。例如，rFVIIIFc可阻断Fc新生受体(FcRn)并活化Fcγ受体(FcγR)，引起促炎性和抗炎性分子的水平改变。因此，在一些实施方案中，嵌合蛋白的Fc区有助于嵌合蛋白定位于关节，例如，炎症和/或损伤和/或损害部位。

在其他实施方案中，凝血因子可为凝血因子模拟物。凝血因子模拟物可显示一种或多种凝血因子活性。例如，抗体或其抗体结合部分可通过结合至因子IX和因子X起到类似FVIII的作用。如果抗体或其抗原结合部分含有Fc区，则此类抗体或其抗原结合部分可用于本方法。在另一个实施方案中，凝血因子为具有FVIII活性的肽。

在此方面，本公开大体上提供一种治疗有需要的受试者的可逆性血友病性关节病的方法，其包括向所述受试者施用包含凝血因子部分和Fc部分的嵌合多肽。

II.A.1.因子VIII

除非另外规定，否则如本文所用的“因子VIII”，在本申请书通篇缩写为“FVIII”，意指在凝血中发挥正常作用的功能性FVIII多肽。因此，术语FVIII包括具有功能性的变体多肽。“FVIII蛋白”可与FVIII多肽(或蛋白)或FVIII互换使用。FVIII功能的实例包括但不限于活化凝血的能力、充当因子IX的辅因子的能力、或在Ca²⁺和磷脂存在下与因子IX形成因子X酶(tenase)复合物的能力，所述复合物然后将因子X转化成活化形式的Xa。FVIII蛋白可为人类、猪、狗、大鼠或鼠类FVIII蛋白。此外，来自人类与其他物种的FVIII之间的比较已鉴别可能是功能所需要的保守性残基(Cameron等人,Thromb.Haemost.79:317-22(1998)；US6,251,632)。已知全长多肽和多核苷酸序列，也已知许多功能性片段、突变体和修饰形式。各种FVIII氨基酸和核苷酸序列公开于例如美国公开第2015/0158929A1号、第2014/0308280A1号和第2014/0370035A1号以及国际公开第WO 2015/106052A1号中，所述公开各自以全文引用的方式并入本文。FVIII多肽包括例如全长FVIII、全长FVIII减去N末端Met、成熟FVIII(减去信号序列)、在N末端具有另一个Met的成熟FVIII和/或B结构域全部或部分缺失的FVIII。FVIII变体包括B结构域缺失，无论是部分还是全部缺失。

在一些实施方案中，本公开的嵌合蛋白或组合物的FVIII包括B结构域缺失FVIII。如本文所用，FVIII的“B结构域”与本领域中已知的通过内部氨基酸序列同一性和凝血酶的蛋白水解裂解位点定义的B结构域相同，例如，成熟人类FVIII的残基Ser741-Arg1648。相对于成熟人类FVIII，其他人类FVIII结构域由以下氨基酸残基定义：A1，残基Ala1-Arg372；A2，残基Ser373-Arg740；A3，残基Ser1690-Ile2032；C1，残基Arg2033-Asn2172；C2，成熟FVIII的残基Ser2173-Tyr2332。除非另外指出，否则如本文所用的不指代任何SEQ ID编号的序列残基编号对应于无信号肽序列(19个氨基酸)的FVIII序列。A3-C1-C2序列(也称为FVIII重链)包含残基Ser1690-Tyr2332。其余序列(残基Glu1649-Arg1689)通常指代为FVIII轻链活化肽。猪、小鼠和狗FVIII的包括B结构域在内的所有结构域的边界位置也为本领域中已知的。在一个实施方案中，缺失FVIII的B结构域(“B结构域缺失FVIII”或“BDDFVIII”)。BDD FVIII的实例为(重组BDD FVIII)。在一个特定实施方案中，所述B结构域缺失FVIII变体包含成熟FVIII的氨基酸残基746至1648的缺失。

“B结构域缺失FVIII”可具有公开于美国专利第6,316,226号、第6,346,513号、第7,041,635号、第5,789,203号、第6,060,447号、第5,595,886号、第6,228,620号、第5,972,885号、第6,048,720号、第5,543,502号、第5,610,278号、第5,171,844号、第5,112,950号、第4,868,112号和第6,458,563号以及国际公开第WO 2015106052A1号(PCT/US2015/010738)中的全部或部分缺失。在一些实施方案中，本公开的方法中所用的B结构域缺失FVIII序列包含在美国专利第6,316,226号(也在US 6,346,513中)的第4栏第4行至第5栏第28行和实施例1-5处公开的任一缺失。在另一个实施方案中，B结构域缺失因子VIII为S743/Q1638B结构域缺失因子VIII(SQ BDD FVIII)(例如，具有从氨基酸744至氨基酸1637的缺失的因子VIII，例如，具有成熟FVIII的氨基酸1-743和氨基酸1638-2332的因子VIII)。在一些实施方案中，本公开的方法中所用的B结构域缺失FVIII具有在美国专利第5,789,203号(以及US 6,060,447、US 5,595,886和US 6,228,620)的第2栏第26-51行和实施例5-8处公开的缺失。在一些实施方案中，B结构域缺失因子VIII具有以下文献中描述的缺失：美国专利第5,972,885号的第1栏第25行至第2栏第40行；美国专利第6,048,720号的第6栏第1-22行和实施例1；美国专利第5,543,502号的第2栏第17-46行；美国专利第5,171,844号的第4栏第22行至第5栏第36行；美国专利第5,112,950号的第2栏第55-68行、图2和实施例1；美国专利第4,868,112号的第2栏第2行至第19栏第21行和表2；美国专利第7,041,635号的第2栏第1行至第3栏第19行、第3栏第40行至第4栏第67行、第7栏第43行至第8栏第26行、和第11栏第5行至第13栏第39行；或美国专利第6,458,563号的第4栏第25-53行。在一些实施方案中，B结构域缺失FVIII缺失大部分B结构域，但仍然含有体内将初级翻译产物蛋白水解加工成两条多肽链所必需的B结构域氨基末端序列，如WO 91/09122中所公开。在一些实施方案中，在缺失氨基酸747-1638，即实际上完全缺失B结构域的情况下构建B结构域缺失FVIII。HoebenR.C.等人J.Biol.Chem.265(13):7318-7323(1990)。B结构域缺失因子VIII也可含有FVIII的氨基酸771-1666或氨基酸868-1562的缺失。Meulien P.等人Protein Eng.2(4):301-6(1988)。作为本发明的一部分的其他B结构域缺失包括以下缺失：氨基酸982至1562或760至1639(Toole等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1986)83,5939-5942))、797至1562(Eaton等人Biochemistry(1986)25:8343-8347))、741至1646(Kaufman(PCT公开申请第WO 87/04187号))、747-1560(Sarver等人,DNA(1987)6:553-564))、741至1648(Pasek(PCT申请第88/00831号))、或816至1598或741至1648(Lagner(Behring Inst.Mitt.(1988)第82期:16-25,EP 295597))。在一个特定实施方案中，所述B结构域缺失FVIII包含成熟FVIII的氨基酸残基746至1648的缺失。在另一个特定实施方案中，所述B结构域缺失FVIII包含成熟FVIII的氨基酸残基745至1648的缺失。

在其他实施方案中，BDD FVIII包括含有B结构域的保留一个或多个N-连接糖基化位点的片段的FVIII多肽，所述位点例如对应于全长FVIII序列的氨基酸序列的残基757、784、828、900、963或任选地943。B结构域片段的实例包括如Miao,H.Z.等人,Blood 103(a):3412-3419(2004)、Kasuda,A等人,J.Thromb.Haemost.6:1352-1359(2008)和Pipe,S.W.等人,J.Thromb.Haemost.9:2235-2242(2011)中公开的B结构域的226个氨基酸或163个氨基酸(即保留B结构域的前226个氨基酸或163个氨基酸)。在其他实施方案中，BDD FVIII进一步包含在残基309处的点突变(从Phe至Ser)以改善BDD FVIII蛋白的表达。参见Miao,H.Z.等人,Blood 103(a):3412-3419(2004)。在其他实施方案中，BDD FVIII包括含有一部分B结构域，但不含有一个或多个弗林蛋白酶裂解位点(例如Arg1313和Arg 1648)的FVIII多肽。参见Pipe,S.W.等人,J.Thromb.Haemost.9:2235-2242(2011)。在一些实施方案中，BDDFVIII包括含有在对应于成熟全长FVIII的氨基酸765至1652中的缺失的单链FVIII(也称为rVIII-单链和)。参见美国专利第7,041,635号。可在任何FVIII序列中进行每个前述缺失。

已知大量功能性FVIII变体，也如上文和下文所讨论。此外，已在血友病患者中识别出出FVIII的数百个非功能性突变，并且已确定，与取代基的性质相比，此类突变对于FVIII功能的作用更多是由于其处于FVIII的3维结构内(Cutler等人,Hum.Mutat.19:274-8(2002))，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中。此外，来自人类与其他物种的FVIII之间的比较已识别出可能为功能所需要的保守性残基(Cameron等人,Thromb.Haemost.79:317-22(1998)；US 6,251,632)，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中。

在一些实施方案中，包含FVIII和Fc区的组合物或嵌合蛋白的有效量等效于无Fc区的FVIII的有效量。在某些实施方案中，所述有效量为约10IU/Kg至约300IU/kg。在一些实施方案中，所述有效量为约20IU/Kg至约300IU/kg。在一些实施方案中，所述有效量为约20IU/kg至约250IU/kg、约20IU/kg至约200IU/kg、约20IU/kg至约190IU/kg、约20IU/kg至约180IU/kg、约20IU/kg至约170IU/kg、约20IU/kg至约160IU/kg、约20IU/kg至约150IU/kg、约20IU/kg至约140IU/kg、约20IU/kg至约130IU/kg、约20IU/kg至约120IU/kg、约20IU/kg至约110IU/kg、约20IU/kg至约100IU/kg、约20IU/kg至约90IU/kg、约20IU/kg至约80IU/kg、约20IU/kg至约70IU/kg、约20IU/kg至约60IU/kg、约25IU/kg至约100IU/kg、约25IU/kg至约90IU/kg、约25IU/kg至约80IU/kg、约25IU/kg至约70IU/kg、约25IU/kg至约65IU/kg。在一个特定实施方案中，所述有效量为约20IU/kg至约100IU/kg。在另一个实施方案中，所述有效量为约25IU/kg至约65IU/kg。在其他实施方案中，所述有效量为约20IU/kg至约100IU/kg、约30IU/kg至约100IU/kg、约40IU/kg至约100IU/kg、约50IU/kg至约100IU/kg、约60IU/kg至约100IU/kg、约70IU/kg至约100IU/kg、约80IU/kg至约100IU/kg、约90IU/kg至约100IU/kg、约20IU/kg至约90IU/kg、约20IU/kg至约80IU/kg、约20IU/kg至约70IU/kg、约20IU/kg至约60IU/kg、约20IU/kg至约50IU/kg、约20IU/kg至约40IU/kg或约20IU/kg至约30IU/kg。

在一些实施方案中，所述有效量为约10IU/kg、约15IU/kg、约20IU/kg、约25IU/kg、约30IU/kg、约35IU/kg、约40IU/kg、约45IU/kg、约50IU/kg、约55IU/kg、约60IU/kg、约65IU/kg、约70IU/kg、约75IU/kg、约80IU/kg、约85IU/kg、约90IU/kg、约95IU/kg、约100IU/kg、约105IU/kg、约110IU/kg、约115IU/kg、约120IU/kg、约125IU/kg、约130IU/kg、约135IU/kg、约140IU/kg、约145IU/kg、约150IU/kg、约155IU/kg、约160IU/kg、约165IU/kg、约170IU/kg、约175IU/kg、约180IU/kg、约185IU/kg、约190IU/kg、约195IU/kg、约200IU/kg、约225IU/kg、约250IU/kg、约275IU/kg或约300IU/kg。在一个特定实施方案中，所述有效量为约50IU/kg。在另一个实施方案中，所述有效量为约100IU/kg。在另一个实施方案中，所述有效量为约200IU/kg。

施用包含FVIII和Fc区或其片段的组合物或嵌合蛋白时的给药间隔可比等效剂量的无Fc区的所述凝血因子所需的给药间隔长至少约一倍半。给药间隔可比等效剂量的无Fc结构域的所述FVIII所需的给药间隔长至少约一倍半至六倍、长一倍半至五倍、长一倍半至四倍、长一倍半至三倍或长一倍半至两倍。

在一些实施方案中，有效剂量的包含FVIII和Fc区的组合物或嵌合蛋白以以下给药间隔向人类施用：约两日、约三日、约四日、约五日、约六日、约七日、约八日、约九日、约十日、约11日、约12日、约13日、约14日、约15日、约16日、约17日、约18日、约19日、约20日、约21日、约22日、约23日或约24日。在一些实施方案中，有效剂量的包含FVIII和Fc区的组合物或嵌合蛋白以以下给药间隔向人类施用：约25日、约26日、约27日、约28日、约29日、约30日、约45日或约60日。

在一些实施方案中，包含FVIII和Fc区的组合物或嵌合蛋白以以下给药间隔施用：约1至约14日、约1至约13日、约1至约12日、约1至约11日、约1至约10日、约1至约9日、约1至约8日、约1至约7日、约1至约6日、约1至约5日、约1至约4日、约1至约3日、约1至约2日、约2至约14日、约3至约14日、约4至约14日、约5至约14日、约6至约14日、约7至约14日、约8至约14日、约9至约14日、约10至约14日、约11至约14日、约12至约14日、约13至约14日或约5至约10日。在其他实施方案中，包含FVIII和Fc区的组合物或嵌合蛋白以以下给药间隔施用：约1至约21日、约1至约20日、约1至约19日、约1至约18日、约1至约17日、约1至约16日、约1至约15日、约1至约14日、约1至约13日、约1至约12日、约1至约11日、约1至约10日、约1至约9日、约1至约8日、约1至约7日、约1至约6日、约1至约5日、约1至约4日、约1至约3日、约1至约2日、约2至约21日、约3至约21日、约4至约21日、约5至约21日、约6至约21日、约7至约21日、约8至约21日、约9至约21日、约10至约21日、约11至约21日、约12至约21日、约13至约21日、约14至约21日、约15至约21日、约16至约21日、约17至约21日、约18至约21日、约19至约21日、约20至约21日、约5至约10日、约10至约15日、约15至约20日。在某些实施方案中，包含FVIII和Fc区的组合物或嵌合蛋白以约2至约6日的给药间隔施用。在另一个实施方案中，包含FVIII和Fc区的嵌合蛋白以约3至约5日的给药间隔施用。

在一个实施方案中，所述有效剂量为25-65IU/kg(25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、62、64或65IU/kg)，并且所述给药间隔为每3-5、3-6、3-7、3、4、5、6、7或8或更多日一次、或每周三次、或每周不多于三次。在另一个实施方案中，所述有效剂量为65IU/kg，并且所述给药间隔为每周一次、或每6-7日一次。只要是必要的，所述剂量可重复施用(例如，至少10、20、28、30、40、50、52、或57周，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年)。在一个特定实施方案中，所述有效剂量为约25-65IU/kg，并且所述给药间隔为每3-5日一次。

包含FVIII和Fc区的组合物或嵌合蛋白可被配制以用于任何适当施用方式，包括例如局部(例如，经皮或眼部)、经口、经颊、经鼻、经***、经直肠或胃肠外施用。

如本文所用的术语胃肠外包括皮下、皮内、血管内(例如，静脉内)、肌肉内、经脊椎、颅内、鞘内、眼内、眼周、眶内、滑膜内和腹膜内注射以及任何类似注射或输注技术。组合物也可为例如悬浮液、乳液、持续释放制剂、乳膏、凝胶或散剂。组合物可用传统黏合剂和载剂(诸如三酸甘油酯)调配成栓剂。

在一个实例中，药物制剂为液体制剂，例如缓冲等张水溶液。在另一实例中，药物组合物具有生理性或接近于生理性的pH值。在其他实例中，水性制剂具有生理性或接近于生理性的容积渗透浓度和盐度。其可含有氯化钠和/或乙酸钠。

在一些实施方案中，本发明的方法中所用的包含FVIII和Fc区的嵌合蛋白为配制于包含以下的药物组合物中：(a)嵌合多肽；(b)一种或多种选自蔗糖、海藻糖、棉子糖、精氨酸或其混合物的稳定剂；(c)氯化钠(NaCl)；(d)L-组氨酸；(e)氯化钙；以及(f)聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在某些实施方案中，所述药物组合物包含：(a)50IU/ml至2500IU/ml嵌合多肽；(b)10mg/ml至25mg/ml蔗糖；(c)8.8mg/ml至14.6mg/ml氯化钠(NaCl)；(d)0.75mg/ml至2.25mg/ml L-组氨酸；(e)0.75mg/ml至1.5mg/ml二水合氯化钙；以及(f)0.08mg/ml至0.25mg/ml聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些实例中，本公开的方法中所用的药物组合物为冻干的。

在一些实施方案中，所述药物组合物不包含免疫细胞。在一些实施方案中，所述药物组合物不包含细胞。

II.A.2.因子IX

人类因子IX(FIX)为一种丝氨酸蛋白酶，其为凝血级联的固有路径中的重要组分。如本文所用，“因子IX”或“FIX”是指凝血因子蛋白及其物种和序列变体，并且包括但不限于人类FIX前体多肽的461个氨基酸的单链序列(“前原”)、成熟人类FIX的415个氨基酸的单链序列和R338L FIX(Padua)变体。FIX包括具有凝血FIX的典型特征的任何形式的FIX分子。如本文所用，“因子IX”和“FIX”意图涵盖包含结构域Gla(含有γ-羧基谷氨酸残基的区域)、EGF1和EGF2(含有与人表皮生长因子同源的序列的区域)、活化肽(“AP”，由成熟FIX的残基R136-R180形成)和C末端蛋白酶域(“Pro”)，或本领域中已知的所述结构域的同义词，或可为保持天然蛋白质的至少一部分生物活性的截短片段或序列变体。

FIX或序列变体已经克隆，如美国专利第4,770,999号和第7,700,734号中所描述，并且编码人类因子IX的cDNA已经被分离，表征并克隆至表达载体中(参见例如，Choo等人,Nature 299:178-180(1982)；Fair等人,Blood 64:194-204(1984)；以及Kurachi等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.79:6461-6464(1982))。一个特定FIX变体为由Simioni等人,2009表征的R338L FIX(Padua)变体，其包含功能获得突变，所述突变与Padua变体活性相对于天然FIX有近8倍增加相关。FIX变体也可包括具有一个或多个保守性氨基酸取代的任何FIX多肽，所述一个或多个取代不会影响FIX多肽的FIX活性。

在一些实施方案中，FIX包括凝血因子IX(重组)、白蛋白融合蛋白(也称为rIX-FP和)。

FIX多肽为55kDa，以由以下三个区构成的前体多肽原链形式合成：具有28个氨基酸的信号肽(氨基酸1至28)、谷氨酸残基γ-羧基化所需要的18个氨基酸的前肽(氨基酸29至46)和415个氨基酸的成熟因子IX。前肽为在γ-羧基谷氨酸结构域N末端的18个氨基酸残基的序列。前肽结合维生素K依赖性γ羧化酶，并且接着通过内源蛋白酶，最可能是PACE(成对碱性氨基酸裂解酶，又称为弗林蛋白酶(furin)或PCSK3)从FIX的前体多肽裂解。在不发生γ羧基化的情况下，Gla结构域无法结合钙以呈现将蛋白质锚定于带负电的磷脂表面所需要的正确构象，由此使因子IX没有功能。即使其被羧基化，Gla结构域也取决于前肽的裂解而获得适当功能，因为保留的前肽干扰Gla结构域与钙和磷脂最佳结合所需要的构象变化。在人体中，所得成熟因子IX为由肝细胞以无活性酶原形式分泌至血流中，所述酶原为含有约17重量％碳水化合物的415个氨基酸残基的单链蛋白质(Schmidt,A.E.等人(2003)Trends Cardiovasc Med,13:39)。

成熟FIX由若干结构域构成，所述结构域在N末端至C末端配置中为：GLA结构域、EGF1结构域、EGF2结构域、活化肽(AP)结构域和蛋白酶(催化)结构域。短接头将EGF2结构域与AP结构域相连接。FIX含有分别由R145-A146和R180-V181形成的两个活化肽。活化后，单链FIX变为具有2条链的分子，其中所述两条链通过二硫键连接。凝血因子可通过置换其活化肽引起活化特异性改变来进行工程改造。在哺乳动物中，成熟FIX必须由活化因子XI活化以得到因子IXa。在FIX活化成FIXa之后，蛋白酶结构域提供FIX的催化活性。活化因子VIII(FVIIIa)为完整表达FIXa活性的特定辅因子。

在其他实施方案中，FIX多肽包含血浆源性因子IX的Thr148等位基因形式并且具有与内源因子IX类似的结构和功能特征。

已知许多功能性FIX变体。国际公开第WO 02/040544 A3号在第4页第9-30行和第15页第6-31行公开了对肝素抑制作用展现较高抗性的突变体。国际公开第WO 03/020764A2号在表2和表3(第14-24页)中和在第12页第1-27行公开了T细胞免疫原性降低的FIX突变体。国际公开第WO 2007/149406 A2号在第4页第1行至第19页第11行公开了展现增加的蛋白质稳定性、增加的体内和体外半衰期和增加的对蛋白酶的抗性的功能性突变FIX分子。WO2007/149406 A2也在第19页第12行至第20页第9行公开了嵌合和其他变体FIX分子。国际公开第WO 08/118507 A2号在第5页第14行至第6页第5行公开了展现增加的凝血活性的FIX突变体。国际公开第WO 09/051717 A2号在第9页第11行至第20页第2行公开了具有使半衰期和/或回收率增加的增加数目的N-连接和/或O-连接糖基化位点的FIX突变体。国际公开第WO 09/137254 A2号也在第2页第[006]段至第5页第[011]段和第16页第[044]段至第24页第[057]段公开了糖基化位点数目增加的FIX突变体。国际公开第WO 09/130198 A2号在第4页第26行至第12页第6行公开了具有使半衰期增加的增加数目的糖基化位点的功能性突变FIX分子。国际公开第WO 09/140015 A2号在第11页第[0043]段至第13页第[0053]段公开了可用于聚合物(例如PEG)缀合的Cys残基的数目增加的功能性FIX突变体。2011年7月11日提交并在2012年1月12日以WO 2012/006624公开的国际申请第PCT/US2011/043569号中所述的FIX多肽也以全文引用的方式并入本文中。

此外，已在血友病受试者中识别出数百种FIX非功能性突变，其中许多突变公开于国际公开第WO 09/137254 A2号第11-14页的表5中。此类非功能性突变不包括在本发明中，但提供有关哪些突变很可能或不太可能产生功能性FIX多肽的额外指导。

因子IX凝血活性以国际单位(IU)表示。一个IU的FIX活性大约对应于一毫升正常人类血浆中FIX的量。若干分析可用于测量因子IX活性，包括单级凝血分析(部分活化凝血激酶时间；aPTT)、凝血酶产生时间(TGA)和旋转式血栓弹力分析仪本发明涵盖与FIX序列具有同源性的序列、天然序列片段(诸如来自人类、非人类灵长类动物、哺乳动物，包括家养动物)和保持FIX的至少一部分生物活性或生物功能和/或可用于预防、治疗、介导或改善凝血因子相关疾病、缺乏症、病症或病状(例如与外伤、手术或凝血因子缺乏症相关的出血事件)的非天然序列变体。与人类FIX具有同源性的序列可通过标准同源性搜索技术，诸如NCBI BLAST发现。

在一些实施方案中，包含FIX和Fc区的组合物或嵌合蛋白的有效量等效于无Fc区的FIX的有效量。在某些实施方案中，所述有效量为约0.1IU/kg至约500IU/kg。在一些实施方案中，所述有效量为约10IU/Kg至约400IU/kg。在一些实施方案中，所述有效量为约20IU/Kg至约300IU/kg。在一些实施方案中，所述有效量为约20IU/kg至约275IU/kg、约20IU/kg至约250IU/kg、约20IU/kg至约225IU/kg、约20IU/kg至约200IU/kg、约20IU/kg至约175IU/kg、约20IU/kg至约150IU/kg、约20IU/kg至约100IU/kg、约20IU/kg至约90IU/kg、约20IU/kg至约80IU/kg、约20IU/kg至约70IU/kg、约20IU/kg至约60IU/kg、约20IU/kg至约50IU/kg、约20IU/kg至约40IU/kg、约20IU/kg至约30IU/kg、约30IU/kg至约100IU/kg、约40IU/kg至约100IU/kg、约50IU/kg至约100IU/kg、约60IU/kg至约100IU/kg、约70IU/kg至约100IU/kg、约80IU/kg至约100IU/kg、约90IU/kg至约100IU/kg、约100IU/kg至约200IU/kg、约150IU/kg至约200IU/kg或约25IU/kg至约75IU/kg。在一个特定实施方案中，所述有效量为约20IU/kg至约100IU/kg。

在一些实施方案中，所述有效量为约10IU/kg、约15IU/kg、约20IU/kg、约25IU/kg、约30IU/kg、约35IU/kg、约40IU/kg、约45IU/kg、约50IU/kg、约55IU/kg、约60IU/kg、约65IU/kg、约70IU/kg、约75IU/kg、约80IU/kg、约85IU/kg、约90IU/kg、约95IU/kg、约100IU/kg、约105IU/kg、约110IU/kg、约115IU/kg、约120IU/kg、约125IU/kg、约130IU/kg、约135IU/kg、约140IU/kg、约145IU/kg、约150IU/kg、约155IU/kg、约160IU/kg、约165IU/kg、约170IU/kg、约175IU/kg、约180IU/kg、约185IU/kg、约190IU/kg、约195IU/kg或约200IU/kg。在一个特定实施方案中，所述有效量为约50IU/kg。在另一个实施方案中，所述有效量为约100IU/kg。

施用包含FIX和Fc区或其片段的组合物或嵌合蛋白时的给药间隔可比等效剂量的无Fc区的所述FIX所需要的给药间隔长至少约一倍半。给药间隔可比等效剂量的无Fc结构域的所述FIX所需要的给药间隔长至少约一倍半至六倍、长一倍半至五倍、长一倍半至四倍、长一倍半至三倍或长一倍半至两倍。在一些实施方案中，给药间隔比等效剂量的无Fc结构域的FIX所需要的给药间隔长至少约一倍半、两倍、两倍半、三倍、三倍半、四倍、四倍半、五倍、五倍半或六倍。给药间隔可为约每三日、四日、五日、六日、七日、八日、九日、十日、十一日、十二日、十三日或十四日或更长时间。给药间隔可为至少约一日半至五日、一日半、2日、3日、4日或5日或更长时间。对于按需治疗，所述嵌合多肽或杂合物的给药间隔为约每24-36、24-48、24-72、24-96、24-120、24-144、24-168、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71或72小时或更长时间一次。

在一些实施方案中，有效剂量的包含FIX和Fc区的组合物或嵌合蛋白以以下给药间隔向人类施用：约两日、约三日、约四日、约五日、约六日、约七日、约八日、约九日、约十日、约11日、约12日、约13日、约14日、约15日、约16日、约17日、约18日、约19日、约20日、约21日、约22日、约23日或约24日。在一些实施方案中，有效剂量的包含FVIII和Fc区的组合物或嵌合蛋白以以下给药间隔向人类施用：约25日、约26日、约27日、约28日、约29日、约30日、约45日或约60日。在某些实施方案中，有效剂量包含FVIII和Fc区的组合物或嵌合蛋白以以下给药间隔向人类施用：约7日、约8日、约9日、约10日、约11日、约12日、约13日或约14日。在一个特定实施方案中，有效剂量的包含FVIII和Fc区的组合物或嵌合蛋白以约2日(例如，约48小时)的给药间隔向人类施用。在另一个实施方案中，有效剂量的包含FVIII和Fc区的组合物或嵌合蛋白以约7日的给药间隔向人类施用。在另一个实施方案中，有效剂量的包含FVIII和Fc区的组合物或嵌合蛋白以约10日的给药间隔向人类施用。在一些实施方案中，有效剂量的包含FVIII和Fc区的组合物或嵌合蛋白以每6-10小时的给药间隔向人类施用。在某些实施方案中，有效剂量的包含FVIII和Fc区的组合物或嵌合蛋白以每日的给药间隔向人类施用。

在一些实施方案中，包含FVIII和Fc区的组合物或嵌合蛋白以以下给药间隔施用：约1至约21日、约1至约20日、约1至约19日、约1至约18日、约1至约17日、约1至约16日、约1至约15日、约1至约14日、约1至约13日、约1至约12日、约1至约11日、约1至约10日、约1至约9日、约1至约8日、约1至约7日、约1至约6日、约1至约5日、约1至约4日、约1至约3日、约1至约2日、约2至约21日、约3至约21日、约4至约21日、约5至约21日、约6至约21日、约7至约21日、约8至约21日、约9至约21日、约10至约21日、约11至约21日、约12至约21日、约13至约21日、约14至约21日、约15至约21日、约16至约21日、约17至约21日、约18至约21日、约19至约21日、约20至约21日、约5至约10日、约10至约15日、约15至约20日。

在一个实施方案中，有效剂量为可维持1-50IU/dL(例如，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50IU/dL)循环FIX的剂量。在另一个实施方案中，有效剂量为50IU/kg，并且给药间隔为每周一次。在另一个实施方案中，给药间隔为100IU/kg，并且给药间隔为每10日一次。只要是必要的，所述剂量可重复施用(例如，至少10、20、28、30、40、50、52、或57周，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年)。

包含FIX和Fc区的组合物或嵌合蛋白可被配制以供用于任何适当施用方式，包括例如局部(例如，经皮或眼部)、经口、经颊、经鼻、经***、经直肠或胃肠外施用。

如本文所用的术语胃肠外包括皮下、皮内、血管内(例如，静脉内)、肌肉内、经脊椎、颅内、鞘内、眼内、眼周、眶内、滑膜内和腹膜内注射以及任何类似注射或输注技术。组合物也可为例如悬浮液、乳液、持续释放制剂、乳膏、凝胶或散剂。组合物可用传统粘合剂和载剂(诸如三酸甘油酯)配制成栓剂。

在一个实例中，药物制剂为液体制剂，例如缓冲等张水溶液。在另一个实例中，药物组合物具有生理性或接近于生理性的pH值。在其他实例中，水性制剂具有生理性或接近于生理性的容积渗透浓度和盐度。其可含有氯化钠和/或乙酸钠。

在一些实施方案中，本发明的方法中所用的包含FIX和Fc区的嵌合蛋白为配制于包含以下的药物组合物中：(a)嵌合多肽；(b)包含蔗糖和甘露醇的碳水化合物混合物；(c)氯化钠(NaCl)；(d)L-组氨酸；以及(e)聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在某些实施方案中，所述药物组合物包含：(a)约25IU/ml与约700IU/ml之间的因子IX多肽；(b)约10mg/ml与约20mg/ml之间的蔗糖；(c)约20mg/ml与约40mg/ml之间的甘露醇；(d)约3mg/ml与约4mg/ml之间的NaCl；(e)约3mg/ml与约6mg/ml之间的L-组氨酸；(f)约0.08mg/ml与约0.2mg/ml之间的聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80；或(g)其任何组合。在一些实例中，本公开的方法中所用的药物组合物为冻干的。

在一些实施方案中，所述药物组合物不包含免疫细胞。在一些实施方案中，所述药物组合物不包含细胞。

II.A.3Fc

本公开的组合物或嵌合蛋白包括结合至FcRn、FcγRIIB和/或DC-SIGN的Fc结构域或其部分。在一些实施方案中，Fc结构域融合至凝血因子，例如，作为包含凝血因子和Fc区的嵌合蛋白的一部分。在其他实施方案中，Fc结构域融合至除凝血因子之外的多肽，其中所述组合物包含(1)凝血因子和(2)包含Fc结构域和另一种多肽的嵌合蛋白。在一些实施方案中，Fc结构域与凝血因子共施用。Fc结构域或其一部分可改善嵌合蛋白的药代动力学或药效动力学性质。在某些实施方案中，Fc结构域或其一部分延长融合至所述Fc结构域或其一部分的分子的半衰期。在一些实施方案中，嵌合蛋白的Fc区有助于嵌合蛋白定位至关节。

如本文所用，如本文所用的术语“Fc结构域”或“Fc区”意指多肽中对应于天然Ig的Fc结构域的功能性部分，即，如通过其两条重链的相应Fc结构域的二聚缔合所形成。天然Fc结构域与另一Fc结构域形成均二聚体。相反，如本文所用的术语“遗传融合Fc区”或“单链Fc区”(scFc区)是指合成二聚Fc区，其包含在单一多肽链内遗传连接的Fc结构域(即，在单一邻接遗传序列中编码)。

在一个实施方案中，“Fc区”是指单一Ig重链的一部分，其在恰好在木瓜蛋白酶裂解位点(即IgG中的残基216，将重链恒定区的第一残基看作114)上游的铰链区中开始并且在抗体的C末端处结束。因此，完全Fc结构域至少包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域。

根据Ig同种型，Ig恒定区的Fc区可包括CH2、CH3和CH4结构域以及铰链区。包含Ig的Fc区的嵌合蛋白对嵌合蛋白赋予若干希望的性质，包括增强的稳定性、增加的血清半衰期(参见Capon等人,1989,Nature 337:525)以及结合至Fc受体，诸如新生儿Fc受体(FcRn)(美国专利第6,086,875号、第6,485,726号、第6,030,613号；WO 03/077834；US2003-0235536A1)，所述专利均以全文引用的方式并入本文中。

在一些实施方案中，Fc区特异性结合至FcRn。已从包括人类的若干哺乳动物物种分离FcRn受体。已知人类FcRn、猴FcRn、大鼠FcRn和小鼠FcRn的序列(Story等人1994,J.Exp.Med.180:2377)。FcRn受体在相对较低的pH下结合IgG(但不结合其他Ig类别，诸如IgA、IgM、IgD和IgE)，以内腔至浆膜方向跨细胞主动转运IgG，并且然后在间隙液中存在的相对较高pH值下释放IgG。其在成人上皮组织(美国专利第6,485,726号、第6,030,613号、第6,086,875号；WO 03/077834；US2003-0235536A1)上表达，所述组织包括肺和肠上皮(Israel等人1997,Immunology 92:69)、肾近端管状上皮(Kobayashi等人2002,Am.J.Physiol.Renal Physiol.282:F358)以及鼻上皮、***表面和胆系表面中。

适用于本发明中的Fc区涵盖可特异性结合FcRn、FcγRIIB和/或DC-SIGN的分子，包括完整IgG、IgG的Fc片段、以及包含FcRn受体的完全结合区的其他片段。已描述IgG的Fc部分的结合至FcRn、FcγRIIB和/或DC-SIGN的区域。

在一个特定实施方案中，所述Fc区特异性结合至低亲和力免疫球蛋白γFc区受体II-b(FcγRIIB)。FcγRIIB为抑制性Fc受体，其控制炎性反应的方面。具体而言，FcγRIIB的活化抑制引起炎症的活化信号。因此，实际上，FcγRIIB的活化抑制炎症。

在另一个实施方案中，所述Fc区特异性结合至树突细胞特异性细胞内粘附分子-3-抓取型非整联蛋白(DC-SIGN)。DC-SIGN(也称为CD209)为大多数骨髓来源细胞(包括某些单核细胞、树突细胞和巨噬细胞)表达的C型凝集素受体。小鼠中的研究已透露DC-SIGN的活化可抑制炎症。参见Nimerjahn,第5章,Molecular and Cellular Pathways Involved inthe Anti-inflammatory Activity of IgG,Molecular Mechanisms of AntibodyActivity,New York,NY2013:113-138。

特异性结合是指两个分子在生理条件下形成相对稳定的复合物。特异性结合的特征在于高亲和力和低至中等结合量，如与通常具有低亲和力和中等至高结合量的非特异性结合相区分。通常，当亲和力常数KA高于10⁶M^-1或高于10⁸M^-1时，结合被认为是特异性结合。必要时，可通过改变结合条件来降低非特异性结合而不实质上影响特异性结合。适当结合条件诸如分子浓度、溶液的离子强度、温度、允许结合时间、阻断剂(例如血清白蛋白、奶酪蛋白)浓度等可由熟练技术人员使用常规技术加以优化。

在某些实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含一个或多个截短Fc区，尽管如此，所述Fc区仍足以对Fc区赋予FcRn、FcγRIIB和/或DC-SIGN结合性质。例如，Fc区的结合FcRn、FcγRIIB和/或DC-SIGN的部分(即FcRn、FcγRIIB和/或DC-SIGN结合部分)包含IgG1的约氨基酸282-438(EU编号)，其中主要接触位点为CH2结构域的氨基酸248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314以及CH3结构域的氨基酸残基385-387、428和433-436。因此，本发明的Fc区可包含FcRn、FcγRIIB和/或DC-SIGN结合部分或由FcRn、FcγRIIB和/或DC-SIGN结合部分组成。FcRn、FcγRIIB和/或DC-SIGN结合部分可源于包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的任何同种型的重链。在一个实施方案中，使用来自具有人类同种型IgG1的抗体的FcRn、FcγRIIB和/或DC-SIGN结合部分。在另一个实施方案中，使用来自具有人类同种型IgG4的抗体的FcRn、FcγRIIB和/或DC-SIGN结合部分。

在另一个实施方案中，“Fc区”包括Fc结构域或源于Fc结构域的氨基酸序列。在某些实施方案中，Fc区包含以下至少一者：铰链(例如上、中和/或下铰链区)结构域(抗体Fc区的约氨基酸216-230，根据EU编号)、CH2结构域(抗体Fc区的约氨基酸231-340，根据EU编号)、CH3结构域(抗体Fc区的约氨基酸341-438，根据EU编号)、CH4结构域、或其变体、部分或片段。在其他实施方案中，Fc区包含完全Fc结构域(即铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域)。在一些实施方案中，Fc区包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：融合于CH3结构域(或其部分)的铰链结构域(或其部分)、融合于CH2结构域(或其部分)的铰链结构域(或其部分)、融合于CH3结构域(或其部分)的CH2结构域(或其部分)、融合于铰链结构域(或其部分)与CH3结构域(或其部分)两者的CH2结构域(或其部分)。在其他实施方案中，Fc区缺乏CH2结构域的至少一部分(例如CH2结构域的全部或一部分)。在一个特定实施方案中，Fc区包含以下或由以下组成：对应于EU编号221至447的氨基酸。

在本文中表示为F、F1或F2的Fc区可从许多不同来源获得。在一个实施方案中，多肽的Fc区源于人类Ig。然而，应了解Fc区可源于另一种哺乳动物物种的Ig，所述物种包括例如啮齿动物(例如小鼠、大鼠、兔或天竺鼠)或非人灵长类动物(例如黑猩猩、猕猴)物种。此外，Fc结构域或其部分的多肽可源于任何Ig类别(包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE)和任何Ig同种型(包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)。在另一个实施方案中，使用人类同种型IgG1。

在某些实施方案中，Fc变体赋予由包含所述野生型Fc结构域的Fc区赋予的至少一种效应功能的变化(例如，Fc区结合至Fc受体(例如，结合至FcγRI或FcγRIII的降低或结合至FcRn或FcγRII的改善)、补体蛋白(例如C1q)或其他Fc结合配偶体(例如，结合至DC-SIGN的改善)，或触发抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、吞噬作用或补体依赖性细胞毒性(CDCC)的能力改善或降低)。在其他实施方案中，Fc变体提供工程改造的半胱氨酸残基。

本发明的Fc区可采用本领域认可的已知会赋予效应功能和/或FcR结合变化(例如增强或降低)的Fc变体。具体而言，本发明的结合分子可包含例如在以下公开的一个或多个氨基酸位置处的变化(例如，取代)：国际PCT公开WO88/07089A1、WO96/14339A1、WO98/05787A1、WO98/23289A1、WO99/51642A1、WO99/58572A1、WO00/09560A2、WO00/32767A1、WO00/42072A2、WO02/44215A2、WO02/060919A2、WO03/074569A2、WO04/016750A2、WO04/029207A2、WO04/035752A2、WO04/063351A2、WO04/074455A2、WO04/099249A2、WO05/040217A2、WO04/044859、WO05/070963A1、WO05/077981A2、WO05/092925A2、WO05/123780A2、WO06/019447A1、WO06/047350A2和WO06/085967A2；美国专利公开第US2007/0231329号、第US2007/0231329号、第US2007/0237765号、第US2007/0237766号、第US2007/0237767号、第US2007/0243188号、第US2007/0248603号、第US2007/0286859号、第US20080057056号；或美国专利5,648,260；5,739,277；5,834,250；5,869,046；6,096,871；6,121,022；6,194,551；6,242,195；6,277,375；6,528,624；6,538,124；6,737,056；6,821,505；6,998,253；7,083,784；7,404,956和7,317,091，其各自以引用方式并入本文。在一个实施方案中，可在一个或多个公开的氨基酸位置处进行具体变化(例如本领域中公开的一个或多个氨基酸的特定取代)。在另一个实施方案中，可在一个或多个公开的氨基酸位置处进行不同变化(例如本领域中公开的一个或多个氨基酸位置的不同取代)。

Fc区可根据充分认可的程序(诸如定点诱变及其类似程序)进行修饰以产生将由FcRn、FcγRIIB和/或DC-SIGN结合的修饰的Fc片段或部分。此类修饰包括保持或甚至增强与FcRn、FcγRIIB和/或DC-SIGN结合的远离FcRn、FcγRIIB和/或DC-SIGN接触位点的修饰以及在接触位点内的修饰。例如，可取代人类IgG1Fc(Fcγ1)中的以下单一氨基酸残基而不显著损失Fc对FcRn、FcγRIIB和/或DC-SIGN的结合亲和力：P238A、S239A、K246A、K248A、D249A、M252A、T256A、E258A、T260A、D265A、S267A、H268A、E269A、D270A、E272A、L274A、N276A、Y278A、D280A、V282A、E283A、H285A、N286A、T289A、K290A、R292A、E293A、E294A、Q295A、Y296F、N297A、S298A、Y300F、R301A、V303A、V305A、T307A、L309A、Q311A、D312A、N315A、K317A、E318A、K320A、K322A、S324A、K326A、A327Q、P329A、A330Q、P331A、E333A、K334A、T335A、S337A、K338A、K340A、Q342A、R344A、E345A、Q347A、R355A、E356A、M358A、T359A、K360A、N361A、Q362A、Y373A、S375A、D376A、A378Q、E380A、E382A、S383A、N384A、Q386A、E388A、N389A、N390A、Y391F、K392A、L398A、S400A、D401A、D413A、K414A、R416A、Q418A、Q419A、N421A、V422A、S424A、E430A、N434A、T437A、Q438A、K439A、S440A、S444A和K447A，其中例如P238A表示野生型脯氨酸在位置编号238处被丙氨酸取代。

例如，一个具体实施方案并入N297A突变，从而移除高度保守的N-糖基化位点。除丙氨酸之外，其他氨基酸也可在以上指定的位置处取代野生型氨基酸。突变可逐一引入Fc中，从而产生多于一百个不同于天然Fc的Fc区。另外，两个、三个或更多个这些个别突变的组合可一起引入，从而产生数百个以上的Fc区。此外，本发明的构建体的一个Fc区可被突变并且所述构建体的另一Fc区完全不突变，或其两者均可被突变，但突变不同。

在一个实施方案中，Fc结构域或其部分为多肽，包括美国专利第5,739,277号的SEQ ID NO:3并且任选地进一步包括选自美国专利第5,739,277号的SEQ ID NO:11、1、2和31的序列。

在某些实施方案中，Fc结构域或其部分为半糖基化。例如，包含两个Fc区的嵌合蛋白可含有第一糖基化Fc区(例如糖基化CH2区)和第二无糖基化Fc区(例如无糖基化CH2区)。在一个实施方案中，接头可***在糖基化Fc区与无糖基化Fc区之间。在另一个实施方案中，Fc区为完全糖基化的，即所有Fc区均为糖基化的。在其他实施方案中，Fc区可为无糖基化的，即没有Fc部分被糖基化。

在某些实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含对Fc结构域或其部分的氨基酸取代(例如Fc变体)，其改变Fc结构域的抗原非依赖性效应功能，特定言之，改变蛋白质的循环半衰期。

本发明中使用的Fc区也可包含本领域认可的改变嵌合蛋白的糖基化的氨基酸取代。例如，嵌合蛋白的连接于FVIII蛋白或FIX蛋白的Fc区可包含具有导致糖基化(例如N-连接或O-连接糖基化)降低的突变的Fc区，或可包含野生型Fc部分的改变的糖形式(例如低海藻糖或无海藻糖聚糖)。

在一个实施方案中，本发明的未加工嵌合蛋白可包含遗传学融合的Fc区(即scFc区)，所述Fc区具有二个或更多个独立地选自本文所述的Ig恒定区或其部分的其组成型Ig恒定区或其部分。在一个实施方案中，二聚Fc区的Fc区为相同的。在另一个实施方案中，至少两个Fc区为不同的。例如，本发明蛋白质的Fc区包含相同数目的氨基酸残基，或它们可在长度方面相差一个或多个氨基酸残基(例如约5个氨基酸残基(例如1、2、3、4或5个氨基酸残基)、约10个残基、约15个残基、约20个残基、约30个残基、约40个残基或约50个残基)。在其他实施方案中，本发明蛋白质的Fc区可在序列的一个或多个氨基酸位置处不同。例如，至少两个Fc区可在约5个氨基酸位置(例如1、2、3、4或5个氨基酸位置)、约10个位置、约15个位置、约20个位置、约30个位置、约40个位置、或约50个位置处不同。

在一些实施方案中，本公开的方法中使用的嵌合蛋白包含多于一条多肽链。在一些实施方案中，嵌合蛋白包含两条多肽链。在某些实施方案中，第一多肽链包含凝血因子和第一Fc区，并且第二多肽链包含第二Fc区。在某些实施方案中，第一Fc区和第二Fc区通过共价键缔合。在一个实施方案中，第一Fc区和第二Fc区通过肽键缔合。在另一个实施方案中，第一Fc区和第二Fc区通过二硫键缔合。

在一个特定实施方案中，嵌合蛋白包含因子VIII部分和冯·维勒布兰德因子(VWF)部分，其中所述FVIII部分包含FVIII多肽或其片段，其中所述VWF部分包含VWF多肽或其片段，其中所述FVIII部分连接至第一Fc区，其中所述VWF部分连接至第二Fc区，并且其中所述第一Fc区和所述第二Fc区彼此缔合。在某些实施方案中，VWF部分包含VWF的D'和D3结构域。在一个实施方案中，第一多肽、第二多肽或第一多肽和第二多肽两者进一步包含一个或多个半衰期延长部分。

本公开的方法中使用的用于产生嵌合蛋白的Fc区或其部分可从许多不同来源获得。在一些实施方案中，Fc区或其部分源于人类Ig。然而，应了解Fc区或其部分可源于另一种哺乳动物物种的Ig，所述物种包括例如啮齿动物(例如小鼠、大鼠、兔、天竺鼠)或非人灵长类动物(例如黑猩猩、猕猴)物种。此外，Fc区或其部分可源于任何Ig类别(包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE)和任何Ig同种型(包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)。在一个实施方案中，使用人类同种型IgG1。

多种Fc区基因序列(例如人类Fc基因序列)可以公开可得的保藏物形式获得。可选择具有特定效应功能(或缺乏特定效应功能)或具有降低免疫原性的特定修饰的Fc序列。许多抗体和抗体编码基因序列已经公开并且可使用本领域认可的技术从此类序列获得适合Fc区序列。使用任一前述方法获得的遗传物质可然后被改变或合成以获得本公开的方法中使用的嵌合蛋白。应进一步了解，本发明的范围涵盖恒定区DNA序列的等位基因、变体和突变。

Fc或其部分的序列可例如使用选择来扩增相关结构域的聚合酶链反应和引物来克隆。为了从抗体克隆Fc区或其部分的序列，可从杂交瘤、脾或淋巴细胞分离mRNA，逆转录成DNA，并且通过PCR扩增抗体基因。PCR扩增方法详述于美国专利第4,683,195号；第4,683,202号；第4,800,159号；第4,965,188号中；以及例如“PCR Protocols:A Guide to Methodsand Applications”Innis等人编,Academic Press,San Diego,CA(1990)；Ho等人1989.Gene 77:51；Horton等人1993.Methods Enzymol.217:270中。PCR可通过共同恒定区引物或通过基于公开的重链和轻链DNA和氨基酸序列的更具特异性引物来启始。如上所讨论，PCR也可用于分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在此情况下，可通过共同引物或较大同源探针(诸如小鼠恒定区探针)来筛选文库。适用于扩增抗体基因的众多引物组为本领域中已知的，例如基于纯化抗体的N末端序列(Benhar和Pastan.1994.ProteinEngineering7:1509)；cDNA末端的快速扩增物(Ruberti,F.等人1994.J.Immunol.Methods173:33)；抗体前导序列(Larrick等人1989Biochem.Biophys.Res.Commun.160:1250)的5'引物。抗体序列的克隆进一步描述于Newman等人,1995年1月25日提交的美国专利第5,658,570号中，所述专利以引用的方式并入本文中。

II.B.半衰期延长部分

在一些实施方案中，本公开的方法中使用的嵌合蛋白进一步包含一个或多个半衰期延长部分。凝血因子的半衰期可通过本领域技术人员已知的任何方法来确定，例如检测血浆FVIII活性水平的FVIII活性分析(显色分析或单级凝血aPTT分析)或检测血浆FVIII/FIX抗原水平的FVIII/FIX ELISA。在一个特定实施方案中，凝血因子的凝血活性的半衰期通过单级凝血分析确定。在一个更具体实施方案中，在小鼠(HemA小鼠或FVIII和冯·维勒布兰德因子双重敲除(DKO)小鼠)中确定凝血因子的凝血活性的半衰期。

在某些方面中，使本发明的凝血因子的半衰期增加的异源部分包括但不限于异源多肽诸如白蛋白、免疫球蛋白Fc区、XTEN序列、人类绒毛膜促性腺素的β亚基的C末端肽(CTP)、PAS序列、HAP序列、转铁蛋白、白蛋白结合部分或这些多肽的任何片段、衍生物、变体或组合。在其他相关方面中，半衰期延长部分可包括诸如聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、聚唾液酸或这些部分的任何衍生物、变体或组合的非多肽部分的连接位点。在某些实施方案中，所述半衰期延长部分包含白蛋白或其片段、白蛋白结合部分、PAS序列、HAP序列、转铁蛋白或其片段、聚乙二醇(PEG)、聚唾液酸、羟乙基淀粉(HES)、其衍生物或其任何组合。在一些实施方案中，半衰期延长部分不包含XTEN。在其他实施方案中，半衰期延长部分包含XTEN。

在其他实施方案中，本发明的嵌合蛋白与一种或多种聚合物缀合。聚合物可为水溶性的或非水溶性的。聚合物可共价或非共价连接至凝血因子、Fc或与凝血因子或Fc缀合的其他部分。聚合物的非限制性实例可为聚(环氧烷)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉或聚(丙烯酰基吗啉)。其他类型的例如聚合物缀合FVIII公开于美国专利第7,199,223号中，所述专利以全文引用的方式加以公开。

在某些方面中，本发明的嵌合蛋白可包含一个、两个、三个或更多个各自可为相同或不同分子的半衰期延长部分。

在一些实施方案中，半衰期延长部分融合至嵌合多肽的N末端或C末端。在一些实施方案中，半衰期延长部分融合至凝血因子的N末端或C末端。在一些实施方案中，半衰期延长部分融合至Fc的N末端或C末端。在某些实施方案中，半衰期延长部分***在嵌合蛋白的凝血因子内。

在一些实施方案中，嵌合蛋白包含FVIII或其部分，并且半衰期延长部分***在FVIII内的美国专利公开第2015-0158929 A1号和/或国际公开第WO 2015106052 A1号中所公开的一个或多个位置处，所述公开以全文引用的方式并入本文中。在一个特定实施方案中，半衰期延长部分***在FVIII的B结构域(或其片段)内。在一个特定实施方案中，半衰期延长部分***在FVIII内的紧邻成熟FVIII的氨基酸残基745的下游。

在其他实施方案中，嵌合蛋白包含FIX或其部分，并且半衰期延长部分***在FIX内的国际申请第PCT/US16/045401号中所公开的一个或多个位置处。在一个特定实施方案中，半衰期延长部分***在FIX内紧邻选自由以下组成的组的氨基酸残基下游的***位点处：成熟Padua FIX的氨基酸103、氨基酸105、氨基酸142、氨基酸149、氨基酸162、氨基酸166、氨基酸174、氨基酸224、氨基酸226、氨基酸228、氨基酸413。在一个实施方案中，嵌合蛋白包含FIX和Fc区，其中FIX包含***在FIX的活化多肽(AP)结构域内的半衰期延长部分。在一个特定实施方案中，嵌合蛋白包含FIX和Fc区，其中FIX包含***在FIX内紧邻成熟PaduaFIX的氨基酸残基166下游的半衰期延长部分。

II.B.1.白蛋白

在某些方面中，本公开的方法中使用的嵌合蛋白包含至少一种白蛋白多肽或其片段、变体或衍生物。人血清白蛋白(HAS或HA)为呈全长形式的609个氨基酸的蛋白质，其负责显著比例的血清渗透压并且也充当内源性和外源性配体的载体。如本文所用的术语“白蛋白”包括全长白蛋白或其功能性片段、变体、衍生物或类似物。白蛋白或其片段或变体的实例公开于美国专利公开第2008/0194481A1号、第2008/0004206 A1号、第2008/0161243 A1号、第2008/0261877 A1号或第2008/0153751 A1号或PCT申请公开第2008/033413 A2号、第2009/058322 A1号或第2007/021494 A2号中，所述公开以全文引用的方式并入本文中。

白蛋白结合多肽(ABP)可包括但不限于可结合白蛋白的细菌白蛋白结合结构域、白蛋白结合肽或白蛋白结合抗体片段。如Kraulis等人,FEBS Lett.378:190-194(1996)和Linhult等人,Protein Sci.11:206-213(2002)所公开，来自链球菌蛋白G的结构域3为细菌白蛋白结合结构域的实例。白蛋白结合肽的实例公开于Dennis等人,J.Biol.Chem.2002,277:35035-35043(2002)。白蛋白结合抗体片段的实例公开于Muller和Kontermann,Curr.Opin.Mol.Ther.9:319-326(2007)；Roovers等人,Cancer Immunol.Immunother.56:303-317(2007)；以及Holt等人,Prot.Eng.Design Sci.,21:283-288(2008)中，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中。

在某些方面中，本公开的方法中使用的嵌合蛋白包含非多肽小分子、其可结合至白蛋白的变体或衍生物的至少一个连接位点。例如，嵌合蛋白可包含一个或多个有机白蛋白结合部分。此类白蛋白结合部分的实例为如由Trussel等人,Bioconjugate Chem.20:2286-2292(2009)公开的2-(3-顺丁烯二酰亚氨基丙酰氨基)-6-(4-(4-碘苯基)丁酰氨基)己酸酯(“Albu”标签)。

II.B.2.XTEN

在某些方面中，本公开的方法中使用的嵌合蛋白包含至少一种XTEN多肽或其片段、变体或衍生物。如此处所用，“XTEN序列”是指具有非天然存在、实质上非重复、主要包含小亲水性氨基酸的序列的长度延长的多肽，所述序列在生理条件下具有较低程度的二级或三级结构或无二级或三级结构。作为嵌合蛋白配偶体，XTEN可充当载体，从而例如当与嵌合蛋白的凝血因子融合或***至其中时，赋予某些希望的药代动力学、物理化学和药物性质。所述希望的性质包括但不限于增强的药代动力学参数和可溶性特征。

与本公开的方法中使用的嵌合蛋白的凝血因子融合或***至其中的XTEN序列可赋予重组蛋白一种或多种以下有利性质：构象可挠性、增强的水溶性、高度蛋白酶抗性、低免疫原性、与哺乳动物受体的低结合作用或增加的流体动力学(或斯托克斯(Stokes))半径。在某些方面中，XTEN序列可增加药代动力学性质，诸如较长的半衰期(例如，体内半衰期)或增加的曲线下面积(AUC)，以使嵌合蛋白与无XTEN的嵌合蛋白相比在体内停留并具有促凝血活性持续增加的时间段。

可***至本发明的重组FVIII蛋白中的XTEN序列的实例公开于例如美国专利公开第2010/0239554 A1号、第2010/0323956 A1号、第2011/0046060 A1号、第2011/0046061 A1号、第2011/0077199 A1号或第2011/0172146 A1号，或国际专利公开第WO 2010091122 A1号、第WO 2010144502 A2号、第WO 2010144508 A1号、第WO 2011028228 A1号、第WO2011028229 A1号、第WO 2011028344 A2号或第WO 2015106052 A1号中，所述公开各自以全文引用的方式并入本文中。

II.B.3.VWF或其片段

在某些方面中，本公开的方法中使用的嵌合蛋白包含至少一种VWF多肽或其片段、变体或衍生物。VWF(也称为F8VWF)为一种存在于血浆中并且在内皮(在怀布尔-帕拉德体(Weibel-Palade body)中)、巨核细胞(血小板的α-颗粒)和内皮下***中组成性产生的大型多聚糖蛋白。基本VWF单体为2813个氨基酸的蛋白质。每个单体含有多个具有特定功能的特定结构域，即D'/D3结构域(其结合因子VIII)、A1结构域(其结合血小板GPIb受体、肝素和/或可能的胶原蛋白)、A3结构域(其结合胶原蛋白)、C1结构域(其中RGD结构域在此结构域活化时结合血小板整联蛋白αIIbβ3)、以及在蛋白质的C末端的“半胱氨酸结(cysteineknot)”结构域(所述VWF与血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子-β(TGFβ)和β-人类绒毛膜促性腺素(βHCG)共有所述结构域)。

在一个实施方案中，VWF多肽为VWF片段。如本文所用的术语“VWF片段”包括但不限于能够抑制内源性VWF结合FVIII的包含D'结构域和D3结构域的功能性VWF片段。在一个实施方案中，本公开的方法中使用的嵌合蛋白包含凝血因子、Fc区和VWF片段，其中所述凝血因子包含FVIII，并且其中所述VWF片段结合FVIII蛋白。在另一个实施方案中，VWF片段阻断FVIII蛋白上的VWF结合位点，从而抑制FVIII蛋白与内源性VWF的相互作用。VWF片段包括保留VWF的这些活性的衍生物、变体、突变体或类似物。在某些实施方案中，VWF片段包含VWF的D'结构域和D3结构域。

人类VWF的2813个单体氨基酸的序列在基因库中报导为登录号NP_000543.2。编码人类VWF的核苷酸序列在基因库中报导为登录号NM_000552.3。

在某些实施方案中，本文适用的VWF蛋白可进一步被修饰以改善其与FVIII的相互作用，例如改善对FVIII的结合亲和力。在其他实施方案中，适用于本发明的VWF蛋白可具有其他修饰，例如蛋白质可被聚乙二醇化、糖基化、羟乙基淀粉化或聚唾液酸化。适用于本公开的方法中的示例性VWF序列提供于例如美国公开第US 2015/0023959 Al号、第US 2015/0266943 A1号和第US 2015/0158929号中。在某些实施方案中，VWF蛋白或其片段融合至FcRn结合配偶体或与FcRn结合配偶体共同施用。在一些实施方案中，VWF蛋白或其片段融合至Fc或与Fc或包含Fc的多肽共同施用。在一些实施方案中，VWF蛋白或其片段融合至白蛋白或与白蛋白或包含白蛋白的多肽共同施用。

II.B.4.CTP

在某些方面中，本公开的方法中使用的嵌合蛋白包含人类绒毛膜促性腺素的β亚基的至少一个C末端肽(CTP)或其片段、变体或衍生物。已知CTP肽增加所述蛋白的半衰期。参见，例如，美国专利第5,712,122号，其以全文引用的方式并入本文中。非限制性示例性CTP肽公开于美国专利申请公开第US 2009/0087411 A1号中，其以引用方式并入。

II.B.5.PAS

在某些方面中，本公开的方法中使用的嵌合蛋白包含至少一种PAS肽或其片段、变体或衍生物。如本文所用的PAS肽或PAS序列意指主要包含丙氨酸和丝氨酸残基或主要包含丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸残基的氨基酸序列，所述氨基酸序列在生理条件下形成无规卷曲构象。因此，PAS序列为包含丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸、基本上由其组成、或由其组成的可用作嵌合蛋白中的异源部分的一部分的构建嵌段、氨基酸聚合物或序列盒。当除丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸以外的残基作为次要组分添加于PAS序列中时，氨基酸聚合物也可形成无规卷曲构象。“次要组分”意指除丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸以外的氨基酸可在某种程度上添加于PAS序列中，例如氨基酸的至多约12％，即PAS序列的100个氨基酸中有约12个那些氨基酸，至多约10％、至多约9％、至多约8％、约6％、约5％、约4％、约3％，即约2％或约1％。不同于丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸的氨基酸可选自由以下组成的组：Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr和Val。在生理条件下，PAS肽形成无规卷曲构象并且因此可介导本发明重组蛋白的体内和/或体外稳定性增强，并且具有促凝血活性。

PAS肽的非限制性实例公开于例如美国专利公开第2010/0292130 A1号；PCT申请公开第WO 2008/155134 A1号；以及欧洲颁布专利EP2173890。

II.B.6.HAP

在某些方面中，本公开的方法中使用的嵌合蛋白包含至少一种均氨基酸聚合物(HAP)肽或其片段、变体或衍生物。HAP肽可包含甘氨酸重复序列，其长度为至少50个氨基酸、至少100个氨基酸、120个氨基酸、140个氨基酸、160个氨基酸、180个氨基酸、200个氨基酸、250个氨基酸、300个氨基酸、350个氨基酸、400个氨基酸、450个氨基酸或500个氨基酸。HAP序列能够延长融合于或连接至HAP序列的部分的半衰期。HAP序列的非限制性实例包括但不限于(Gly)_n、(Gly₄Ser)_n或S(Gly₄Ser)_n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一个实施方案中，n为20、21、22、23、24、25、26、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40。在另一个实施方案中，n为50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200。参见，例如，Schlapschy M等人,ProteinEng.Design Selection,20:273-284(2007)。

II.B.7.转铁蛋白

在某些方面中，本公开的方法中使用的嵌合蛋白包含至少一种转铁蛋白肽或其片段、变体或衍生物。任何转铁蛋白均可与本公开的方法中使用的嵌合蛋白融合。举例而言，野生型人类Tf(Tf)为一种大致75kDa(不考虑糖基化)的679个氨基酸的蛋白质，具有似乎由基因复制产生的两个主要结构域N(约330个氨基酸)和C(约340个氨基酸)。参见基因库登录号NM001063、XM002793、M12530、XM039845、XM 039847和S95936(www.ncbi.nlm.nih.gov)，其全部以全文引用的方式并入本文中。

转铁蛋白通过转铁蛋白受体(TfR)介导的胞吞作用来转运铁。在铁释放至内体区室(endosomal compartment)中并且Tf-TfR复合物再循环至细胞表面之后，Tf释放回细胞外空间以进行下一铁转运循环。Tf具有超过14-17天的长半衰期(Li等人,TrendsPharmacol.Sci.23:206-209(2002))。已对转铁蛋白融合蛋白的半衰期延长进行研究，靶向以用于癌症治疗的递送、经口递送和胰岛素原的持续活化(Brandsma等人,Biotechnol.Adv.,29:230-238(2011)；Bai等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:7292-7296(2005)；Kim等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.,334:682-692(2010)；Wang等人,J.ControlledRelease 155:386-392(2011))。

II.B.8.PEG

在某些方面中，本公开的方法中使用的嵌合蛋白包含非多肽异源部分或其片段、变体或衍生物的至少一个连接位点。例如，本公开的方法中使用的嵌合蛋白可包括连接至凝血因子和/或Fc区中的一个或多个氨基酸残基的一个或多个聚乙二醇(PEG)部分。

蛋白质的聚乙二醇化可以是指在蛋白质与至少一个聚乙二醇(PEG)分子之间形成缀合物。可购得在多种分子量和平均分子量范围内的PEG。PEG平均分子量范围的典型实例包括但不限于约200、约300、约400、约600、约1000、约1300-1600、约1450、约2000、约3000、约3000-3750、约3350、约3000-7000、约3500-4500、约5000-7000、约7000-9000、约8000、约10000、约8500-11500、约16000-24000、约35000、约40000、约60000和约80000道尔顿。这些平均分子量仅作为实例提供并且不意图以任何方式具有限制性。

本公开的方法中使用的嵌合蛋白可被聚乙二醇化以包含单个或多个(例如，2-4个)PEG部分。聚乙二醇化可通过本领域中已知的任一种聚乙二醇化反应进行。用于制备聚乙二醇化蛋白质产物的方法一般将包括(i)使多肽与聚乙二醇(诸如PEG的反应性酯或醛衍生物)在使本发明的肽连接至一个或多个PEG基团的条件下反应；以及(ii)获得反应产物。一般而言，反应的最佳反应条件将基于已知参数和所需结果根据具体情况来确定。

存在许多可本领域技术人员可利用的PEG连接方法，例如Malik F等人,Exp.Hematol.20:1028-35(1992)；Francis,Focus on Growth Factors 3(2):4-10(1992)；欧洲专利公开第EP0401384号、第EP0154316号和第EP0401384号；以及国际专利申请公开第WO92/16221号和第WO95/34326号。作为非限制性实例，FVIII变体可含有半胱氨酸取代，并且半胱氨酸可进一步缀合至PEG聚合物。参见Mei等人,Blood 116:270-279(2010)和美国专利第7,632,921号，其以全文引用的方式并入本文中。

II.B.9.HES

在某些方面中，本公开的方法中使用的嵌合蛋白包含至少一种羟乙基淀粉(HES)聚合物。HES为天然存在的支链淀粉的衍生物并由体内的α-淀粉酶降解。HES展现有利的生物性质并且在临床上用作血容量补充剂并用于血液稀释疗法中。参见例如Sommermeyer等人,Krankenhauspharmazie 8:271-278(1987)；和Weidler等人,Arzneim.-Forschung/DrugRes.41:494-498(1991)。

HES主要通过分子量分布和取代度来表征。HES的平均分子量(重均分子量)为1至300kD、2至200kD、3至100kD或4至70kD。对于羟乙基，羟乙基淀粉可进一步展现0.1至3、0.1至2、0.1至0.9或0.1至0.8的摩尔取代度，以及2至20范围内的C2:C6取代比率。平均分子量为约130kD的HES为来自Fresenius的为一种例如用于容量置换的人工胶体，所述容量置换用于血容量过低(hypovolaemia)的治疗和预防的治疗适应症中。存在许多可本领域技术人员可利用的HES连接方法，例如上述相同PEG连接方法。

II.B.10.PSA

在某些方面中，本公开的方法中使用的嵌合蛋白包含至少一种聚唾液酸(PSA)聚合物。PSA为由某些细菌菌株和在哺乳动物的某些细胞中产生的唾液酸的天然存在的未分支聚合物。参见例如Roth J.等人,(1993),Polysialic Acid:From Microbes to Man,RothJ.,Rutishauser U.,Troy F.A.编(Verlag,Basel,Switzerland),第335-348页。PSA可通过有限酸水解或通过用神经氨酸苷酶(neuraminidase)消化或通过分离天然细菌源性形式的聚合物来以从n＝约80个或80个以上唾液酸残基至n＝2的各种聚合度产生。存在许多可本领域技术人员可利用的PSA连接方法，例如上述相同PEG连接方法。在某些方面中，活化PSA也可连接至凝血因子内(例如，FVIII或FIX上)或Fc区内的半胱氨酸氨基酸残基。参见例如美国专利第5846951号。

II.B.11.清除受体

在某些方面中，本公开的方法中使用的嵌合蛋白的半衰期可被延长，其中所述嵌合蛋白的凝血因子包含FVIII和FVIII清除受体的至少一个片段、或其FVIII结合片段、变体或衍生物。***诸如低密度脂蛋白相关蛋白受体LRP1的清除受体或其片段的可溶性形式可阻断FVIII与清除受体的结合并且从而延长其半衰期，例如体内半衰期。LRP1为一种参与多种蛋白质(包括FVIII)的由受体介导的清除中的600kDa完整膜蛋白。参见例如Lenting等人,Haemophilia 16:6-16(2010)。其他合适的FVIII清除受体为例如LDLR(低密度脂蛋白受体)、VLDLR(极低密度脂蛋白受体)和巨蛋白(megalin)(LRP-2)或其片段。参见例如Bovenschen等人,Blood 106:906-912(2005)；Bovenschen,Blood 116:5439-5440(2010)；Martinelli等人,Blood 116:5688-5697(2010)。

III.多核苷酸、载体和宿主细胞

在一些方面中，本公开提供一种治疗患有血友病的人类关节的可逆性血友病性关节病的方法，其包括向所述人类施用有效量的编码凝血因子和/或Fc区(例如，编码包含凝血因子和Fc区的嵌合蛋白)的多核苷酸或多核苷酸组。在一些实施方案中，所述多核苷酸或所述多核苷酸组是处于表达载体或表达载体组内。在某些实施方案中，表达载体或表达载体组是处于一个或多个宿主细胞内。

本公开的方法中使用的编码凝血因子和/或Fc区(例如，编码包含凝血因子和Fc区的嵌合蛋白)的多核苷酸可为单个核苷酸序列、两个核苷酸序列、三个核苷酸序列或更多个核苷酸序列。在一个实施方案中，单个核苷酸序列编码包含凝血因子(例如，FVIII或FIX多肽)和Fc区的嵌合蛋白。在另一个实施方案中，多核苷酸包含两个核苷酸序列，第一核苷酸序列编码凝血因子(例如，FVIII)并且第二核苷酸序列编码Fc区。在另一个实施方案中，多核苷酸包含两个核苷酸序列，第一核苷酸序列编码凝血因子(例如，FVIII或FIX)和Fc区并且第二核苷酸序列编码第二Fc区。在某些实施方案中，编码的Fc结构域在表达后形成共价键。

在一些实施方案中，多核苷酸被密码子优化。

如本文所用，表达载体是指含有在引入适当宿主细胞中时***的编码序列转录和翻译所必需的元件，或在RNA病毒载体的情况下复制和翻译所必需的元件的任何核酸构建体。表达载体可包括质粒、噬菌粒、病毒及其衍生物。

如本文所用的基因表达控制序列为有助于与其可操作地连接的编码核酸的高效转录和翻译的任何调控性核苷酸序列，诸如启动子序列或启动子-增强子组合。基因表达控制序列可例如为哺乳动物或病毒启动子，诸如组成性或诱导性启动子。组成性哺乳动物启动子包括但不限于以下基因的启动子：次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、腺苷脱氨酶、丙酮酸激酶、β-肌动蛋白启动子和其他组成性启动子。在真核细胞中组成性起作用的示例性病毒启动子包括例如来自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒(例如SV40)、***状瘤病毒、腺病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)、巨细胞病毒、莫罗尼白血病病毒(Moloney leukemia virus)的长末端重复序列(LTR)和其他反转录病毒的启动子，以及单纯性疱疹病毒的胸苷激酶启动子。本领域普通技术人员已知其他组成性启动子。可用作本发明的基因表达序列的启动子也包括诱导性启动子。诱导性启动子在诱导剂存在下表达。例如，诱导金属硫蛋白启动子以促进在某些金属离子存在下的转录和翻译。其他诱导性启动子为本领域普通技术人员已知的。

出于本发明的目的，可采用众多表达载体系统。此类表达载体通常在宿主生物体中可复制，呈游离体或作为宿主染色体DNA的整体部分。表达载体可包括表达控制序列，包括但不限于启动子(例如天然缔合或异源启动子)、增强子、信号序列、剪接信号、增强子元件和转录终止序列。优选的是，表达控制序列为在能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子。表达载体也可利用来源于动物病毒，诸如牛***瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)、巨细胞病毒(CMV)或SV40病毒的DNA元件。其他表达载体涉及使用具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统。

通常，表达载体含有选择标记物(例如氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性或新霉素抗性)以允许检测用所需DNA序列转化的细胞(参见例如，Itakura等人,美国专利第4,704,362号)。将DNA整合至染色体中的细胞可通过引入一个或多个允许选择转染宿主细胞的标记物来进行选择。标记物可向具有生物杀灭剂抗性(例如抗生素)或对重金属诸如铜具有抗性的营养缺陷型宿主提供原营养。可选择标记物基因可直接连接至待表达的DNA序列，或通过共转化引入所述细胞中。

适用于本公开的方法中使用的嵌合蛋白的优化表达的载体的实例为NEOSPLA(美国专利第6,159,730号)。所述载体含有巨细胞病毒启动子/增强子、小鼠β球蛋白主要启动子、SV40复制起点、牛生长激素聚腺苷酸化序列、新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2、二氢叶酸还原酶基因和前导序列。已发现，所述载体在并入可变区和恒定区基因、在细胞中转染随后在含G418的培养基中选择并进行甲胺喋呤扩增后以极高水平表达抗体。载体系统也在美国专利第5,736,137号和第5,658,570号中教导，所述专利各自以全文引用的方式并入本文中。此系统提供高表达水平，例如>30pg/细胞/日。其他示例性载体系统公开于例如美国专利第6,413,777号中。

在其他实施方案中，本发明的多肽使用多顺反子构建体表达。在此类表达系统中，可从单个多顺反子构建体产生多个所关注基因产物，诸如多聚体结合蛋白质的多个多肽。此类系统有利地使用内部核糖体入口位点(IRES)以在真核宿主细胞中提供相对较高水平的多肽。相容性IRES序列公开于美国专利第6,193,980号，所述专利也并入本文中。

更一般而言，一旦制备出编码多肽的载体或DNA序列，就可将所述表达载体引入适当宿主细胞中。即，宿主细胞可被转化。将质粒引入宿主细胞中可通过如以上所讨论的本领域技术人员熟知的各种技术实现。转化的细胞在适于产生嵌合蛋白的条件下生长，并且针对嵌合蛋白合成进行分析。示例性分析技术包括酶联免疫吸附剂分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)或荧光活化细胞分选器分析(FACS)、免疫组织化学及其类似技术。

现已详细描述本发明，通过参考以下实施例将更明确地了解本发明，所述实施例仅出于说明目的包括于此并且不意图限制本发明。

实施例1

rFVIIIFc预防在患有目标关节和重度A型血友病的小儿、青少年和成人受试者中的长期功效

对于患有血友病的人来说，频繁出血至同一关节(目标关节)中可导致血友病性关节病(慢性关节疾病)。rFVIIIFc已开发为与常规FVIII产品相比延长因子VIII(FVIII)的半衰期(Peters等人,J.Thromb.Haemost.11(1):132-41(2013))。完成的rFVIIIFc关键3期试验(ClinicalTrials.gov识别符：NCT01181128；Mahlangu等人,Blood123(3):317-25(2014))和儿童rFVIIIFc关键3期试验(NCT01458106；Young等人,J.Thromb.Haemost.13(6):967-77(2015))研究分别确立了rFVIIIFc在患有重度A型血友病的成人/青少年(12岁或更大年龄的患者)和儿童(小于12岁的患者)中的安全性和功效。在正在进行的rFVIIIFc延伸研究(NCT01454739；Nolan等人,Haemophilia 22(1):72-80(2016))中评估rFVIIIFc的长期安全性和功效。

此研究的目标为报导至第二rFVIIIFc延伸研究中期数据截止为止(2014年12月8日)，进入rFVIIIFc关键3期试验和儿童rFVIIIFc关键3期试验时rFVIIIFc和QOL在具有目标关节的受试者中的持久功效的累积数据。

方法

对在进入亲代研究(parent study)(即，rFVIIIFc关键3期试验或儿童rFVIIIFc关键3期试验)时具有≥1个目标关节(在6个月时间段中具有≥3个出血事件的主要关节(参见World Federation of Hemophilia,Guidelines for the Management of Hemophilia第2版,Blackwell Publishing:Montréal,Canada(2012)))、具有可使用的研究前(即，亲代研究前)和研究中数据(目标关节，具体的和整体的)的受试者进行评估。rFVIIIFc延伸研究中有4个治疗组(表1)。

表1：rFVIIIFc延伸研究治疗方案

≥12岁的受试者可参与rFVIIIFc延伸研究中的任何治疗方案，而＜12岁的受试者仅可参与个体化预防和修改的预防治疗方案。

此后在亲代研究的累积持续时间内至第二rFVIIIFc延伸研究中期数据截止对具有目标关节的受试者的结果进行分析。结果包括ABR、目标关节出血事件的数目和解决方案以及预防剂量和给药频率。对连续追踪时间≥12个月并且自从追踪期开始尚未经历目标关节的重大手术(即，置换或去除)的受试者进行目标关节解决方案的分析。如果在连续12个月时间段期间目标关节有≤2个自发性出血事件，则临床上认为目标关节被解决(Blanchette等人,J Thromb Haemost.12(11):1935-39(2014))。

在≥17岁、在研究期间具有≥1个解决的目标关节并且在rFVIIIFc关键3期试验基线和rFVIIIFc延伸研究第2年具有Haem-A-QOL计分的受试者中通过Haem-A-QOL指数评定QOL测量。在儿童rFVIIIFc关键3期试验的受试者中，通过加拿大学血友病结果-儿童生活评定工具(Canadian Hemophilia Outcomes–Kids Life Assessment Tool，CHO-KLAT)测量QOL。

结果

研究群体

在rFVIIIFc关键3期试验的在基线时具有目标关节的113名受试者中，具有研究前预防或发病期方案和研究中数据的111名受试者在基线时具有287个目标关节(中值年龄，31.0岁；四分位数间距(IQR)，24.0-44.0岁；表2)。儿童rFVIIIFc关键3期试验的十三名受试者在基线时具有15个目标关节并且具有研究前和研究中数据(中值年龄，6.0岁；IQR，5.0-8.0岁；表2)。

表2：人口统计学和基线特征^a

IQR-四分位数间距。^a包括在进入亲代研究时具有≥1个目标关节并具有效率期的受试者。目标关节定义为发生重复出血(在连续6个月时间内向同一关节≥3次出血事件的频率)的主要关节(例如，肘关节、踝关节、膝关节、肩关节、腕关节和髋关节)。^b百分比可能由于舍入而总计不是100.0％。^c受试者的平均年龄为39.9岁。

出血率

对于成人/青少年和12岁或更年幼的儿童而言，使用rFVIIIFc预防的中值(IQR)研究中总体ABR低于研究前预防的出血率(图1A-1D)。儿童rFVIIIFc关键3期试验通过患者年龄进一步分层，并且中值研究前和研究中ABR示出于图1E和1F中。研究前，小于6岁的患者具有比6岁至＜12岁的患者低的中值(IQR)ABR(图1E)。研究中，小于6岁的患者具有比6岁至＜12岁的患者高的总体研究中ABR、总体目标关节ABR和目标关节自发性ABR(图1F)。

在rFVIIIFc关键3期试验中，46.3％个体化预防、40.7％每周预防和21.4％修改预防的受试者不具有目标关节出血事件，而儿童rFVIIIFc关键3期试验中53.8％个体化预防受试者不具有目标关节出血事件。

临床目标关节解决方案

在进行预防的在基线和12个月追踪时具有目标关节的受试者中，100％(93/93)rFVIIIFc关键3期试验和100％(7/7)儿童rFVIIIFc关键3期试验受试者有≥1个解决的目标关节(即，在连续12个月期间≤2个自发性出血事件)；并且rFVIIIFc关键3期试验和儿童rFVIIIFc关键3期试验受试者中分别解决98.3％(231/235)和100％(9/9)目标关节(基于所有出血)。

预防性因子消耗

基线时具有目标关节的rFVIIIFc关键3期试验(n＝105)和儿童rFVIIIFc关键3期试验(n＝13)预防受试者中的中值(IQR)每周预防性因子消耗分别为76.0(68.0-90.9)IU/kg和83.5(79.9-111.6)IU/kg。

消耗与亲代研究中在rFVIIIFc关键3期试验/儿童rFVIIIFc关键3期试验之前和rFVIIIFc关键3期试验/儿童rFVIIIFc关键3期试验和rFVIIIFc延伸研究期间进行预防并且具有可使用的研究前和研究中给药数据的受试者(rFVIIIFc关键3期试验，n＝79,75.0[70.0-113.8]IU/kg；儿童rFVIIIFc关键3期试验，n＝54,95.0[75.0-113.0]IU/kg)类似。

对于两个患者群体，在基线时具有目标关节的预防受试者(rFVIIIFc关键3期试验，n＝105,3.8[3.5-5.6]日；儿童rFVIIIFc关键3期试验，n＝13,3.5[3.5-3.5]日)与亲代研究中具有可使用的研究前和研究中给药数据的预防受试者(rFVIIIFc关键3期试验，n＝79,3.5[3.0-5.0]日；儿童rFVIIIFc关键3期试验，n＝54,3.5[3.5-3.5]日)之间中值(IQR)给药间隔也类似。

儿童rFVIIIFc关键3期试验数据通过患者年龄进一步分层。小于6岁的受试者的平均每周消耗在给药间隔3.5(3.5-3.5)日时为89.6(75.3-97.5；n＝6)IU/kg。对于6岁至小于12岁的患者，平均每周消耗在给药间隔3.5(3.0-3.6)日时为82.2(79.4-113.2)IU/kg。

生活质量

与rFVIIIFc关键3期试验基线相比，成人/青少年(n＝48)中在rFVIIIFc延伸研究第2年时，QOL改善18％(表3)。在儿童rFVIIIFc关键3期试验基线和rFVIIIFc延伸研究第1年自己报导CHO-KLAT计分的儿童rFVIIIFc关键3期试验受试者(n＝6)中，平均(标准偏差[SD])基线计分为85.5(12.1)；在rFVIIIFc延伸研究第1年，CHO-KLAT计分改善28％(平均[SD]改善为24.1[15.3])。

表3：基线时具有目标关节的受试者的Haem-A-QOL分析

NS，不显著

^aHaem-A-QOL计分范围为0至100，其中较高计分表示QOL中每个子计分和总计分的较高损害。

^b基于双尾成对t检验。

^c可评估48名患者的除运动和休闲(n＝33)、计划生育(n＝30)、伴侣和***(n＝45)以及工作和学习(n＝44)之外的所有结果。

结论

3期rFVIIIFc关键3期试验和儿童rFVIIIFc关键3期试验研究和正在进行的rFVIIIFc延伸研究的功效数据显示在进行长期rFVIIIFc预防的患有重度A型血友病的小儿、青少年和成人受试者中有持续低的目标关节年度化出血率(ABR)和有效的目标关节解决方案。此分析中基线时具有目标关节的受试者的每周预防性因子消耗与先前公开的rFVIIIFc关键3期试验和儿童rFVIIIFc关键3期试验研究的总体群体中的消耗一致。在以rFVIIIFc预防的目标关节解决的受试者中看到生活质量改善(QOL)，而预防性因子消耗或给药间隔无变化。

实施例2

患有重度A型血友病的受试者中用重组因子VIII Fc融合蛋白(rFVIIIFc)预防的纵向修改的血友病关节健康计分(mHJHS)结果

血友病性关节病在血友病的管理方面仍有挑战(Knobe等人,JComorbidity.2011；1(1):51-59；Simpson等人,Expert Rev Hematol.2012；5(4):459-68)。血友病关节健康计分(HJHS)为可用于检测血友病性关节病的发展的第一线工具(Oymak等人J Pediatr Hematol Oncol.2015；37(2):e80-5)。肌肉骨骼结果的改善为预防治疗A型血友病的重要量度(Blanchette等人Haemophilia 2004；10(增刊S4):97-104)。分别完成rFVIIIFc关键3期试验(Mahlangu等人Blood.2014；123(3):317-325)和儿童rFVIIIFc关键3期试验研究(Young等人J Thromb Haemost.2015；13(6):967-977)的成人/青少年和儿童中rFVIIIFc的长期安全性和功效已使用正在进行的rFVIIIFc延伸研究的中期数据来建立(Nolan等人Haemophilia.2016；22(1):72-80)。确定rFVIIIFc对肌肉骨骼结果的长期影响将需要进一步研究。

此研究的目标为使用修改的血友病关节健康计分(mHJHS)报导rFVIIIFc关键3期试验和rFVIIIFc延伸研究的纵向关节健康数据。

研究参与者和设计

分析群体包括完成rFVIIIFc关键3期试验且招募于rFVIIIFc延伸研究中达2年的成人/青少年(≥12岁)。患者可已进行研究前预防或发病期治疗。关节健康使用mHJHS在rFVIIIFc关键3期试验筛检(方案修正之后)和基线时评定，然后其后每年评定以用于rFVIIIFc延伸研究。

mHJHS与标准HJHS 2.1版的不同之处在于，与标准HJHS(范围，0-124)相比，关节疼痛和步态的反应选择被压缩成较少类别，增加了不稳定性评定，并且总计分较小(范围，0-116；0指示正常关节功能，116指示重度疾病)(参见表4)。排除在2周内出血之后的计分。最近一次观察的结转(last observation carry forward)输入经历手术介入的关节的计分。为了评估逐年变化，事后分析中包括在4个时间点(rFVIIIFc关键3期试验基线、rFVIIIFc延伸研究基线、rFVIIIFc延伸研究第1年和延伸研究第2年)具有mHJHS数据的rFVIIIFc延伸研究受试者。使用描述统计学概述从rFVIIIFc关键3期试验基线至rFVIIIFc延伸研究第2年的mHJHS计分变化(负值指示改善)。针对以下概述从rFVIIIFc关键3期试验基线至追踪访视的mHJHS计分变化：(1)总计分(范围，0-116；通过研究前方案(预防期对发病期)；初始mHJHS通过功能损害的严重性；且通过基线时目标关节的存在；(2)目标关节(范围，0-19：单一目标关节的所有问题的总和)；(3)承重(例如，踝和膝)和非承重(例如，肘)关节(范围，0-38：单一位置右和左关节的总和)；和(4)个别分量(活动范围(范围，0-36；所有关节的问题“伸展丧失[踝背屈]”和“屈曲丧失[踝跖屈]”的组合)；肿胀(范围，0-24：所有关节的问题“肿胀”和“肿胀持续时间”的组合)；以及强度(范围，0-6：所有关节的总和))。

表4-HJHS与mHJHS之间的差异

^a0＝正常关节功能；116＝重度疾病

rFVIIIFc关键3期试验基线与rFVIIIFc延伸研究第2年之间的差异使用成对t检验分析。因为此分析是专设的，所以p值未用于推断统计学显著性。对于亚群分析，仅提供描述统计学。

结果

基线特征

在此分析中包括的完成者(completer)群体(n＝47)与在rFVIIIFc关键3期试验基线时收集mHJHS并在rFVIIIFc延伸研究中招募的患者群体(n＝74)之间，基线特征为类似的(表5)。

表5：基线特征

^a在rFVIIIFc关键3期试验中招募的进行rFVIIIFc预防的74名受试者具有mHJHS计分，并且随后进入rFVIIIFc延伸研究。^b47名进行预防的患者在rFVIIIFc延伸研究中达到第2年，数据可在rFVIIIFc关键3期试验基线、rFVIIIFc延伸研究基线和第1年与第2年使用。

纵向关节健康

从rFVIIIFc关键3期试验基线至rFVIIIFc延伸研究第2年观察到mHJHS计分的连续改善，其中总计分的平均降低为从23.4至19.3(图2A)。在七十四名受试者中，二十四名受试者在延伸研究第3年进行评估，并且在延伸研究第3年看到mHJHS计分的此类改善，不管rFVIIIFc关键3期试验基线时是否存在目标关节(图2B)。平均追踪持续时间为2.8(2.5-3.3)年。观察到连续改善，不管患者的研究前治疗(图3)或rFVIIIFc关键3期试验基线时是否存在目标关节(图4)。在延伸研究第3年评估的那些患者中，用所有时间点的数据的成人/青少年的平均mHJHS总计分在基线时为25.0(平均的标准误差[SEM]，2.9)。从基线的平均(SEM)变化在延伸研究基线时为-2.0(1.2)，在延伸研究第1年为-3.8(1.5)，在延伸研究第2年为-4.5(1.6)，并且在延伸研究第3年为-5.1(1.5)(图3B)。从基线至延伸研究第3年的变化为系统计学显著的(P<0.002)。儿童rFVIIIFc关键3期试验分析群体(n＝24)也显示从基线至延伸研究第2年的统计学显著的平均(SEM)改善(-1.2[0.56]；P<0.05)(图3C)。rFVIIIFc关键3期试验基线时mHJHS计分中具有最高四分位数损害的受试者显示从基线至rFVIIIFc延伸研究第2年mHJHS总计分最大改善(图5)。从rFVIIIFc关键3期试验基线至rFVIIIFc延伸研究第2年观察到mHJHS目标关节计分的连续改善，其中改善为从基线时平均7.0至rFVIIIFc延伸研究第2年时平均5.3(图6)。从rFVIIIFc关键3期试验基线至rFVIIIFc延伸研究第2年，承重关节的mHJHS关节计分从平均8.0减小至平均6.8，并且非承重关节的mHJHS关节计分从平均6.7减小至平均4.8(图7)。对于承重(踝关节和膝关节)和非承重关节(肘关节)计分的计算，计分首先推导为一对右关节和左关节(踝关节、膝关节或肘关节)的每个关节计分的和。然后承重关节计分计算为踝关节和膝关节的计分的平均值，并且非承重关节计分与肘关节的计分相同。此外，从rFVIIIFc关键3期试验基线至rFVIIIFc延伸研究第2年也观察到肿胀、活动范围和强度的具体改善，其表示mHJHS总计分中最重要的促成因素发生变化(图8)。

在第3年承重和非承重关节均观察到从rFVIIIFc关键3期试验基线的统计学显著的平均改善(分别为-1.1[SEM,0.5；P＝0.036]和-3.0[SEM,0.8；P＝0.001])。mHJHS的显示从基线至第3年≥20％降低的个别分量为肿胀(-47％)、肌肉萎缩(-26％)、捻发声(-20％)(所有3个分量均P<0.05)和关节不稳定性(-89％)、关节疼痛(-31％)和强度(-26％)(图9)。

实施例3

患有B型血友病的成人和青少年中用rFIXFc预防的目标关节结果

在患有重度B型血友病的患者中，反复出血至关节中而无充分治疗可引起致残性(crippling)慢性关节疾病、疼痛和生活质量降低(Djambas Khayat,J Blood Med.7:275-82(2016))。用重组因子IX Fc融合蛋白(rFIXFc)的预防性治疗导致患有重度B型血友病的青少年和成人中较低的年度化出血率(ABR)和较少的自发性/创伤性出血事件(Kavakli等人,Haemophilia 22(3):381-88(2016)；Powell等人N Engl J Med.369(24):2313-23(2013)；Powell等人,Br J Haematol.168(1):124-34(2015)；Powell等人,Br JHaematol.168(1):113-232015))。除预防关节损伤和减少出血事件之外，以常规和长效rFIX的预防性治疗可使得缺工或缺课时间较少、住院较少、监测较不频繁和生活质量改善(Kavakli等人,Haemophilia 22(3):381-88(2016)；Wyrwich等人,Haemophilia 22(6):866-72(2016))。生命早期起始的预防性治疗减少出血并预防关节损伤。当生命后期起始时，一旦发生关节损伤，预防性治疗仍可显著减少出血次数，包括向关节中的出血(Fischer等人,Haemophilia20(Suppl 4):106-13(2014))。完成rFIXFc关键3期试验(NCT01027364)的患有重度B型血友病的成人/青少年可参加长期延伸研究(NCT01425723；Pasi等人,Thromb Haemost.117(3):508-18(2017))，所述研究评估rFIXFc值安全性和功效。此处报导在整个长期延伸研究中在进入rFIXFc关键3期试验时具有目标关节的受试者的纵向结果。

此研究的目标为呈现至延伸研究的第二中期数据截止为止(2015年9月11日)进入时具有目标关节的受试者的rFIXFc关键3期试验纵向数据结果。

方法

研究设计和群体

完成rFIXFc关键3期试验的患有重度B型血友病(≤2IU/dL内源FIX)的受试者参加延伸研究的以下4个治疗组中的1个治疗组：(1)每周预防(WP；20-100IU/kg每7日)；(2)个体化间隔预防(IP；100IU/kg每8-16日)；(3)修改的预防(MP；研究者可对用IP或WP未达成最佳给药的受试者进行个人化给药)；以及(4)发病期治疗(ET；基于出血事件的类型和严重性按需给药)。受试者可在参加延伸研究和研究期间的任何时间切换其治疗组。切换治疗组的受试者包括于每个治疗组的分析中持续所述治疗方案所花费的时间段，所以个别受试者可在分析中多于1个治疗组中进行计数。对在关键3期试验进入时具有≥1个目标关节(在3个月时间段中具有≥3个出血事件的主要关节)的受试者进行评估。

结果测量和统计分析

在rFIXFc关键3期试验的累积持续时间内至第二B-YOND中期数据截止为止(2015年9月11日)对结果进行分析。执行目标关节解决方案的分析。目标关节解决方案定义为在连续12个月时间段内目标关节中≤2次自发性出血(Blanchette等人,J ThrombHaemost.12(11):1935-39(2014))。

结果

具有目标关节的受试者的基线特征示出于表6。在具有研究中数据的117名rFIXFc关键3期试验受试者中，六十名受试者在基线时具有总计166个目标关节。这些受试者接受rFIXFc持续3.4(1.4-4.2)年的累积中值(四分位数间距[IQR])持续时间。

表6：基线特征。

特征	N＝60
		研究前方案
发病期	44(73.3)
		预防	16(26.7)
目标关节数
		1	20(33.3)
2	13(21.7)
		3	7(11.7)
>3	20(33.3)
		目标关节位置
膝关节	42(70.0)
		踝关节	33(55.0)
肘关节	28(46.7)
		髋关节	6(10.0)
肩关节	3(5.0)
		腕关节	3(5.0)

所有数据均为n(％)。rFIXFc，重组因子IX Fc融合蛋白。包括在进入B-LONG时具有≥1个目标关节并具有功效期(定义为根据研究的治疗方案用rFIXFc治疗受试者的所有时间间隔的和，排除手术康复期)的受试者；bA目标关节定义为其中发生反复出血(频率为在连续3个月时间段中至同一关节中≥3个出血事件)的主要关节(例如，膝关节、踝关节、肘关节、髋关节、肩关节和腕关节)。

预防性给药

平均每周给药和给药间隔概述于表7。

表7：平均rFIXFc预防性给药和给药间隔的概述

所有数据均为中值(IQR)。IP，个体化间隔预防；MP，修改的预防；rFIXFc，重组因子IX Fc融合蛋白；WP，每周预防。仅具有可使用的研究中剂量和给药间隔数据的受试者包括于此分析中。受试者包括于其所参与的持续方案的持续时间的每个治疗方案中，并且因此可出现于多于一个治疗方案中。

出血率

研究前和研究中出血数据分别示出于图10A和10B中。接受rFIXFc预防、在研究中不具有目标关节再出血的受试者为如下：WP：40名中有15名(37.5％)；IP：12名中有1名(8.3％)；MP：12名中有4名(33.3％)；ET：14名中有0名(0％)。在基线时具有目标关节的受试者中，用rFIXFc预防的研究中总体目标关节ABR低于使用研究前治疗的出血率(图10A和10B)。

目标关节解决方案

总而言之，100％(93/93)目标关节(37名受试者中)得到解决，如指示十二个月时间段内两次或更少自发性出血(图11)。

结论

在患有重度B型血友病的成人/青少年中，长期rFIXFc预防导致100％在基线时具有可评估目标关节的受试者中目标关节得到解决并且导致跨所有治疗组的低目标关节ABR。当设计治疗预防计划时，临床医师应考虑到具有目标关节的患者用rFIXFc达成的显著改善的长期结果。

实施例4

通过体内单光子发射断层摄影术(SPECT)得到的¹²⁵I标记的FIXFc、FIX和糖聚乙二醇化FIX在HemB小鼠中的生物分布

通过体内单光子发射断层摄影术(SPECT)进行体内小鼠研究以评估给药后多个时间点FIX蛋白的生物分布。FIX蛋白使用¹²⁵I标记的SIB接头在赖氨酸残基处标记。通过单一治疗相关剂量将标记的FIX蛋白施用至7-12周龄HemB小鼠。¹²⁵I-SIB-FIX作为单一剂量1mg/kg施用(n＝3)；¹²⁵I-SIB-FIXFc作为单一剂量2mg/kg施用(n＝3)，并且¹²⁵I-SIB-FIX-PEG作为单一剂量1mg/kg施用(n＝3)。

在0.5h、2.5h、20h、48h、92h、120h、168h和/或216h对标记的FIX蛋白的定位进行成像(图10A-10C)。使用感兴趣区域(ROI)安置分析关节区域(例如，右/左膝关节和右/左肩关节)、心脏(左心室)和肝的具体定位。左心室和肝ROI为安置在正确器官内的固定体积目标。膝关节ROI通过从距股骨往下大约一半至胫骨/腓骨往下一半安置围绕骨的圆筒来定义。肩关节ROI通过在肩部中心处安置均匀球形，然后对所述球形内的骨取阈值，随后使ROI膨胀(dilation)来定义。

发现标记的FIXFc在给药后30分钟(图12D)和2.5h(图12E)分布至围绕关节的区域，其持续给药后48-216h(图12F-12G)，分别表示半衰期和五倍半衰期。膝关节(图13A)和肩关节(图13B)的FIXFc定位比FIX和糖聚乙二醇化FIX至相同关节区域的定位更明显。

在向HemB小鼠施用之后，与未标记FIX蛋白相比，¹²⁵I-SIB标记不影响标记的FIX蛋白的FIX活性(图14A)，并且标记也不影响FIX蛋白的药代动力学性质(图14B)。

实施例5

基线关节评定

基线关节评定

六个关节(左踝-LA、右踝-RA、左肘-LE、右肘-RE、左膝-LK、右膝-RK)将根据以下标准以0至19的标度进行计分：肿胀、持续时间、肌肉萎缩、捻发声、屈曲丧失、伸展丧失、不稳定性、关节疼痛和强度。步态将基于走路和走楼梯以0至2的标度进行计分。总计分为所有6个关节的计分加步态计分的和(范围为0-116，其中0为正常，并且116为最重度疾病)。

筛检访视

筛检时将对人体每一侧的肘关节、膝关节和踝关节的关节疾病进行评估。关节功能应在不存在主动性出血事件的情况下评估。关节计分为零反映了正常状态。

计分细节

1.根据这些类别和标度对6个关节(LA、RA、LE、RE、LK、RK)单独进行关节计分(范围对于每个关节而言为0-19并且对于所有六个关节而言为0-114)：肿胀(0＝无；1＝轻度；2＝中度；3＝重度)；肿胀持续时间(0＝无肿胀或≤6个月；1＝>6个月)；肌肉萎缩(0＝无；1＝轻度；2＝重度)；活动时捻发声(0＝不存在；1＝存在)；屈曲丧失，包括踝跖屈丧失(0＝无；1＝轻度；2＝中度；3＝重度)；伸展丧失，包括踝背屈丧失(0＝无；1＝轻度；2＝中度；3＝重度)；不稳定性(0＝无；1＝显著病理性关节松弛)；关节疼痛(0＝不疼痛，贯穿活动范围或活动范围端部；1＝存在)；强度(0＝正常(抵抗重力和最大抵抗力保持位置)；1＝最小下降(抵抗重力和中等抵抗力而不是最大抵抗力保持位置)；2＝轻度下降(抵抗重力或最小抵抗力保持位置)；3＝中度下降(消除重力时能够移动关节)；4＝重度下降(痕量或无肌肉收缩)。对于在膝关节和肘关节计分屈曲丧失和伸展丧失，以下适用：无＝大约0-5度；轻度＝大约5-10度；中度＝大约11-20度；并且重度＝大约>20度。

2.步态将计分一次(范围为0-2)，其中0＝走路或走上/下楼梯不困难；1＝走路不困难，但走楼梯困难；以及2＝走路和走楼梯均困难。

此修改的血友病关节健康计分(HJHS)是基于患有血友病的男孩中关节计分可靠性研究中使用的计分系统(Hilliard,Funk等人,Haemophilia 12(5):518-525(2006)，其以全文引用的方式并入本文)。所述修改的血友病关节健康计分已用作在20名4-17岁男孩的组中评估肌肉骨骼结果的工具(Saulyte Trakymiene,Ingerslev等人,Haemophilia 16(3):479-486(2010)，其以全文引用的方式并入本文)。为了使计分系统适于成人血友病群体并根据国际血友病预防研究小组的最新验证研究中的注解(Feldman,Funk等人,Arthritis Care Res(Hoboken),2010，其以全文引用的方式并入本文)进行修改。

实施例6

在A型血友病中使用因子的替代疗法的主要并发症为在约30％患有重度A型血友病的患者中抑制剂(中和抗因子VIII抗体)的形成。抑制剂发展影响治疗功效以及受影响个体的生活质量。血友病研究正努力进一步理解免疫系统如何对重组因子III(rFVIII)起反应以有效根除抑制剂。延长半衰期rFVIII Fc融合蛋白(rFVIIIFc)为预防并控制出血事件的有效且耐受良好的疗法。此分子中的Fc区不仅负责增加rFVIII半衰期，还可促进抗原特异性耐受性，如临床前动物模型中所示(Krishnamoorthy S,等人,Cell Immunol.301:30-39(2016))和如免疫耐受性诱导病例报告所表明(Groomes CL,等人,Pediatr BloodCancer 63(5):922-24(2016)；Malec LM,等人,Haemophilia 22(6):e552-e554(2016)；Ragni MV,等人,Haemophilia 22(5):e462-e464(2016))。

方法

外周血来源的人类APC或THP-1单核细胞用于研究rFVIIIFc对FcγR结合、内化、信号传导和细胞因子产生的影响、以及基因表达变化、以及随后体外在T细胞上的相互作用和影响(图16)。

结果

FcγR的细胞表面表达减小指示在rFVIIIFc处理时发生内化(图17A-17C)。将单核细胞来源的巨噬细胞和树突细胞用等摩尔浓度(200nM)的辣根过氧化物酶免疫复合物(HRP-IC)(作为阳性对照)、人类免疫球蛋白G1(IgG1)(作为阴性对照)和重组因子VIII(rFVIII)或rFVIII Fc融合蛋白(rFVIIIFc)处理达24小时。Fcγ受体(FcγR)CD16(图17A)、CD32(图17B)和CD64(图17C)的细胞表面表达通过流式细胞术测量(n＝3；**P≤0.01，***P≤0.005，其他处理的HRP-IC的显著性未示出)。与用rFVIII处理之后的表面表达相比，用rFVIIIFc处理与CD16(图17A)、CD32(图17B)和CD64(图17C)的细胞表面表达减小相关。

rFVIIIFc接合FcγR并且诱导单核细胞和巨噬细胞的信号传导，而无后续促炎性细胞因子产生(图18A-18C)。将THP-1单核细胞系、单核细胞、外周血单核细胞来源的巨噬细胞和外周血单核细胞来源的树突细胞用HRP-IC、IgG1、rFVIII或rFVIIIFc处理15分钟(图18A)。使用MSD平台测量细胞溶解产物中的Syk磷酸化(n＝3-7，*P≤0.05)。在用rFVIIIFc(WT)、用突变rFVIIIFc(其不能结合至新生儿Fc受体(FcRn突变体))或用突变rFVIIIFc(其不能结合至FcγR(FcγR突变体))处理巨噬细胞之后测量Syk磷酸化(n＝4，*P≤0.05)(图18B)。通过MSD ELISA测量二十四小时处理的巨噬细胞的促炎性细胞因子产生(n＝4，显著性未示出)(图18C)。

rFVIIIFc使参与免疫调控的分子磷酸化，而非使在活化和促炎性细胞因子产生中起作用的分子磷酸化(表9和图19)。使用Proteome Profiler磷酸激酶和磷酸免疫受体阵列研究用rFVIIIFc处理十五分钟的单核细胞来源的巨噬细胞的溶解产物中的磷酸化蛋白。通过Proteome Profiler分析识别的rFVIIIFc处理的巨噬细胞中磷酸化分子的列表示出于表9中。使用MSD平台测量负责抑制性信号传导的磷酸酶的磷酸化(n＝3；**P≤0.01，***P≤0.005)(图19)。

表9：通过Proteome Profiler分析识别的rFVIIIFc处理的巨噬细胞中的磷酸化分子。

rFVIIIFc诱导致耐受性巨噬细胞的基因表达模式特征(图20A-20G)。对用IgG1、rFVIII或rFVIIIFc处理六小时的单核细胞来源的巨噬细胞(n＝3)执行显著下调的基因(图20A)和显著上调的基因(图20B)的探索性RNA测序，并且对rFVIIIFc上调的基因进行途径分析以研究这些细胞中选择性表示的分子途径，与rFVIII处理的细胞进行比较(表9)。发现NRF2和PPAR-γ途径的各种基因以及各种其他免疫调节剂为上调(图20H)。通过Q-PCR验证NRF2和脂质代谢途径的选择基因(n＝8；*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.005)(图20C-20G)。此外，发现rFVIIIFc处理的巨噬细胞展现特征性类M2表型(图20I-20M)。具体而言，用rFVIIIFc处理的巨噬细胞具有比6小时(图20I)之后和24小时(图20J)之后用rFVIII处理的细胞高的相对CD206表达，并且用rFVIIIFc处理的巨噬细胞具有比24小时之后用rFVIII处理的细胞高的相对ARG1表达(图20M)。

表9：对rFVIIIFc上调的基因进行途径分析以研究这些细胞中选择性表示的分子途径，与rFVIII处理的细胞进行比较。

rFVIIIFc处理的抗原呈递细胞影响需要APC-T细胞-细胞接触的调控性T细胞分化(图21A-21C)。将外周血单核细胞来源的巨噬细胞用IgG1、rFVIII或rFVIIIFc处理，然后与从相同供体的外周血分离的原初CD4阳性T细胞进行共培养。在共培养六日之后(图21A)，使用流式细胞术定量调控性T细胞(CD4+CD25+FoxP3+)的百分比(n＝4)(图21B)。当将原初T细胞于用IgG1、rFVIII或rFVIIIFc预处理的APC的条件培养基中培养时也定量调控性T细胞的百分比(n＝4)(图21C)。

结论

rFVIIIFc似乎通过APC上的Fcγ受体结合并诱导内化和信号传导。此信号传导不会翻译成促炎性细胞因子产生并且不活化APC(数据未示出)。免疫调节信号传导事件在rFVIIIFc处理时开始。这些事件似乎驱使巨噬细胞朝向M2样表型分化，所述表型的特征在于NRF2和PPARγ途径(图20H)的上调以及CD206和精氨酸酶1分子的上调。各种其他免疫调节剂也显示表达增加，同时至少鸟苷酸环化酶1可溶性亚基β(2GUCY1B2)、原紫质氧化酶(PPOX)和细胞因子信号传导的抑制剂3(SOCS3)显示rFVIIIFc处理的细胞中的表达减小(图20H)。这些巨噬细胞可执行先前报导的有益的免疫学效应，诸如调控性T细胞分化、FVIII免疫耐受作用和抗FVIII抑制剂减少(图22和23)。

实施例7

因子IX(FIX)的药代动力学(PK)概况与二区室模型一致，其中FIX主要分布至血浆区室外的空间(血管外空间)。我们先前已使用SPECT成像显示，B型血友病小鼠中rFIXFc和rFIX生物分布概况与FIX可分布至血浆区室外的组织，而糖聚乙二醇化rFIX由于PEG部分所施加的修饰而大部分维持在血浆区室中的假设一致。在此研究中，我们评估了非人灵长类动物(NHP)中rFIX和rFIXFc的分布。

rFIXFc和rFIX使用124I-SIB(琥珀酰亚氨基碘代苯甲酸酯)在赖氨酸残基处标记。食蟹猕猴接受约2mCi痕量剂量124I-SIB-rFIXFc(2mg/kg)或124I-SIB-rFIX(1mg/kg)的单一IV推注注射。重建全身PET/CT扫描用于得到最大强度投射(maximum-intensityprojection，MIP)图像，并且确定感兴趣区域(ROI)分析的体内生物分布。

NHP中PET成像显示124I-SIB-rFIXFc和124I-SIB-rFIX在血池、心脏、肝和肾中的早期分布。在稍后时间点，rFIXFc和rFIX均显示至肩关节以及其他骨关节(腕关节、踝关节和颚关节)的分布，其中rFIXFc显示至这些区域的显著较高分布，即使在FIX血浆水平低于检测水平的时间点也如此。体内和离体数据显示rFIXFc和rFIX的血池清除。TCA沉淀数据显示>95％放射性与FIX相关联。

NHP的rFIXFc和rFIX生物分布概况类似于在B型血友病小鼠中观察的概况，并且与FIX可分布至血浆区室外的组织的假设一致。rFIXFc至关节区域的比rFIX显著更高的分布可通过Fc介导的机制或改善的PK反映出在这些组织处的保留。尽管血管外分布在预防出血和总体保护关节健康方面的作用仍为研究领域，但此研究与小鼠中显示FIX变体的生物分布差异的观察一致，表明跨FIX变体血浆水平可能不是可比的或具有相同含义。

具体实施方案的前文描述将充分地揭示本发明的一般性质，以使得其他人通过应用本领域中的技能，在无不当实验且不背离本发明的一般概念的情况下，可轻易地针对各种应用对此类具体实施方案进行修改和/或改变。因此，基于本文呈现的教导和指导，此类改变和修改意图处于所公开实施方案的等效物的含义和范围内。应了解，本文的短语或术语是出于描述而非限制的目的，以使得本说明书的术语或短语应由本领域技术人员根据教导和指导进行解释。

从本文所公开的本发明的说明书和实践的考虑，本发明的其他实施方案对本领域技术人员而言将为显而易见的。意图将说明书和实施例被认为仅是示例性的，并且本发明的真实范围和精神通过以下权利要求书指示。

本文中公开的所有出版物、专利和专利申请案均以引用的方式并入本文中，其引用程度就如同具体且个别地指示每个个别出版物、专利或专利申请以引用的方式并入本文中一般。