阅读说明：本技术 双模板表面分子印迹材料同时脱除水溶性茶提取物中吡虫啉和啶虫脒的方法 (The method that double-template molecularly imprinted material on surface removes imidacloprid and Acetamiprid in water-soluble tea extract simultaneously ) 是由 陈静钰 王洪新 吴世嘉 魏新林 黄鑫 王力 于 2019-08-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了双模板表面分子印迹材料同时脱除水溶性茶提取物中吡虫啉和啶虫脒的方法,所述方法包括制备双模板表面分子印迹材料、制备分子印迹吸附柱、制备茶提取物水溶液、过柱处理及吸附柱循环使用等步骤。本发明所述双模板表面分子印迹材料同时脱除水溶性茶提取物中吡虫啉和啶虫脒的方法能够特异性地脱除水溶性茶提取物中的吡虫啉和啶虫脒,且对茶提取物中的茶多酚具有较小的吸附作用,对吡虫啉和啶虫脒的脱除率分别大于95％和94％,对提取物中茶多酚的损失小于14％。此外,本发明所制备的吸附柱可以通过甲醇/乙酸溶液进行洗脱,洗脱之后的吸附柱可以重新利用,因此能够很好地应用于茶提取物的制备工艺中,具有很好的应用前景。(The invention discloses double-template molecularly imprinted material on surface simultaneously remove imidacloprid and Acetamiprid in water-soluble tea extract method, the method includes preparation double-template molecularly imprinted material on surface, prepare molecular engram adsorption column, prepare tea extraction aqueous solution, cross column processing and adsorption column be recycled and etc..Double-template molecularly imprinted material on surface of the present invention removes the method for imidacloprid and Acetamiprid in water-soluble tea extract simultaneously can specifically remove imidacloprid and Acetamiprid in water-soluble tea extract, and there is lesser suction-operated to the tea polyphenols in tea extraction, 95% and 94% are respectively greater than to the removal efficiency of imidacloprid and Acetamiprid, to the losses of tea polyphenols in extract less than 14%.In addition, adsorption column prepared by the present invention can be eluted by methanol/acetic acid solution, the adsorption column after eluting can be re-used, therefore can be advantageously applied in the preparation process of tea extraction, be had a good application prospect.)

双模板表面分子印迹材料同时脱除水溶性茶提取物中吡虫啉 和啶虫脒的方法

技术领域

本发明属于食品绿色加工技术领域，涉及一种脱除茶提取物中农药残留的方法，具体为双模板表面分子印迹材料同时脱除水溶性茶提取物中吡虫啉和啶虫脒的方法。

背景技术

氯化烟碱类杀虫剂主要通过作用于昆虫中枢神经系统，而对同翅目蚜虫和半翅目飞虱起到良好的杀灭效果。其凭借独特的作用方式、低哺乳动物毒性、高杀虫活性和与其他类型杀虫剂的低交互抗性等特点，广泛应用于茶叶及其他农作物的种植过程中。在常用的氯化烟碱类杀虫剂中，吡虫啉和啶虫脒使用最为广泛且最具有代表性。吡虫啉和啶虫脒虽然毒性不高，但应用范围较广，在国内的监管力度也较为宽松，一旦出现残留在农产品中的情况，不仅会造成重大的经济损失，也会对食用者的健康产生威胁。

水溶性茶提取物，尤其是茶多酚，是茶叶深加工过程中的主要产物，具有抗癌、抗氧化、降血脂及抗动脉粥样硬化、抗HIV等功效，具有很高的药用价值和保健价值。然而在农户种植茶叶并施用吡虫啉和啶虫脒的过程中，无法避免的会有不能充分降解而残留下来的情况，残留下来的农药在茶叶深加工的过程中在茶提取物中富集，从而造成水溶性茶提取物中吡虫啉和啶虫脒残留量的超标。目前，对于在水中和蔬菜中的农药脱除研究已经取得了许多进展主要包括辐照、超声、吸附、萃取、氧化和生物降解等(CHEN C,FU X,MA T,eta1.Synthesis of dendritic silver nanostructures and their application inhydrogen peroxide eleetroreduction[J].Journal of Applied Polymer Science,2014,131.MAJEED S，nERR0D，BUHR K，et al，Uhrafihration of natural organic matterfrom water by vertically aligned carbon nanotube membrane[J].Journal ofMemberane Science,2012(403):101.)；其中，吸附法由于吸附效果好，稳定性好、回收率高，成本低廉等优势而受到了广泛的研究。袁彩霞等通过1,3,6,8,-芘四磺酸钠在介孔碳表面引入大量的磺酸基官能团，极大地提高了其在水中的溶解度，使其对牛奶中有机氯农药六六六、滴滴涕都展现出了优越的吸附性能。柴宗龙等比较了改性介孔碳、石墨烯、活性炭、碳纳米管、Fe₃O₄纳米粒子修饰碳纳米管复合材料和Fe₃O₄纳米粒子等不同吸附材料对菠菜中9种有机磷农药吸附能力，结果发现改性碳纳米管吸附效果最好，且稳定性好、回收率较高，回收率最大达到93.5％。

然而值得一提的是，超声、辐照等方法在对样品处理的过程中会对其颜色和性状造成一定的影响。而目前所用的大部分吸附剂，如活性炭、大孔树脂、介孔碳等，皆会对样品中的其他有效成分造成一定的吸附损失。因此如何在不破坏食品的外观性状，以及尽量减少其中有效成分损失的前提下，高效地对其中的农药残留进行脱除，已经成为当下的一个研究热点。

分子印迹是根据目标分子的性质和结构合成的一种对该分子有特异性吸附能力的材料，被视为一种新型特异性亲和技术，具有预定性、识别性和实用性。分子印迹材料除了稳定性好且使用寿命长之外，还具有价格低廉的特点，非常适合作为茶叶深加工过程中对农药残留的脱除材料。目前已有一些对分子印迹和农药亲和的研究。苏立强等以γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(KH-570)改性的Fe₃O₄纳米粒子为载体，以乙草胺(acetochlor)为模板分子，采用表面分子印迹技术制备乙草胺磁性分子印迹聚合物(Fe₃O₄@SiO₂@MIP)。该磁性印迹聚合物对乙草胺有较高的吸附量和良好的选择吸附性能，最大吸附量为86.61mg/g。然而，目前还没有分子印迹同时对吡虫啉和啶虫脒两种农药进行亲和的研究，也没有人尝试将其应用于水溶性茶提取物的农药脱除方面。

发明内容

解决的技术问题：为了解决现有的茶提取物水溶液中农药残留的问题，获得一种能够高效地脱除茶提取物水溶液中农药残留，尽量减少茶多酚损失，并且成本低廉且能够重复使用的方法，本发明提供了双模板表面分子印迹材料同时脱除水溶性茶提取物中吡虫啉和啶虫脒的方法。

技术方案：双模板表面分子印迹材料同时脱除水溶性茶提取物中吡虫啉和啶虫脒的方法，所述方法包括以下步骤：

第1步、制备改性硅胶载体

将100-600目的硅胶2-8g与50-200mL 6-10molL^-1盐酸搅拌18-24h，真空抽滤并洗至pH为中性后于烘箱中100-120℃干燥4-8h，以获得活化硅胶；

将2-8g活化硅胶与20-100mL无水甲苯混合于三颈烧瓶中，在氮气保护下磁力搅拌并逐滴滴加3-12mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，滴入5-10mL吡啶，混合物在80-120℃加热回流12-30h，产物过滤并依次用甲苯、丙酮、***和甲醇洗涤，然后于烘箱中80-120℃干燥4-12h，以获得氨基改性硅胶；

将2-8g氨基改性硅胶与50-200mL无水甲苯混合于三颈烧瓶中，在氮气保护下磁力搅拌5-20min，之后逐滴滴加4-16mL丙烯酰氯，继续磁力搅拌15min，然后缓慢滴加2-8mL三乙胺作为催化剂，室温下反应12-30h，产物过滤并依次用甲苯、丙酮、***和甲醇洗涤，然后于烘箱中80-120℃干燥4-12h，以获得酰基改性硅胶；

第2步、制备双模板表面分子印迹

将吡虫啉和啶虫脒共同溶解于甲苯中，加入2-8mmolα-甲基丙烯酸和400-1000mg酰基改性硅胶，均匀溶解后于0-4℃冷藏6-18h。之后继续加入12-28mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯和20-60mg偶氮二异丁腈，混合均匀后超声10-30min，通入高纯氮气10-30min，密封后于水浴锅中55-65℃聚合16-32h，获得的固体用甲醇洗涤至中性，于真空干燥箱中60℃进行干燥。干燥后的分子印迹粉末通过索氏提取法洗脱至无模板分子洗出，洗脱溶剂为甲醇-乙酸按体积比9:1混合的溶液；

第3步、制备分子印迹固相吸附柱

将500-2000mg第2步制备的双模板表面分子印迹粉末与2-8mL去超纯水混匀后，装入已装填下筛板的SPE小柱中，待所有液体流出后压入上筛板，以获得分子印迹固相吸附柱。用甲醇对吸附柱进行活化，将活化后的吸附柱放置待用；

第4步、制备添加吡虫啉和啶虫脒的茶提取物水溶液

将水溶性茶提取物配制成10-60wt％的水溶液，添加吡虫啉和啶虫脒使其浓度分别为1-20μg·mL^-1，并用0.45μm滤膜过滤，将过滤液收集备用；

第5步、过柱

将第4步制备的茶提取物水溶液通过第3步制备的活化后的分子印迹固相吸附柱，调节并控制流速，吸附柱温度控制在20-30℃，之后用2-8倍柱体积的超纯水对弱吸附于固相柱上的茶提取物进行洗脱，洗脱液与过柱液合并后进行检测，水溶性茶提取物的损失小于14％，对吡虫啉和啶虫脒的脱除率分别大于95％和94％；

第6步、循环使用

将第5步吸附有吡虫啉和啶虫脒的吸附柱通过30mL甲醇-乙酸体积比为9:1的混合溶剂，调节并控制流速为0.5-3mL·min^-1，将吸附柱中95％以上的吡虫啉和92％以上的啶虫脒洗脱，使该吸附柱循环使用。

优选的，茶提取物为茶多酚或茶氨酸。

优选的，第2步中吡虫啉和啶虫脒为0.2-0.8mmol。

优选的，第2步中甲苯用量为60-100mL。

优选的，第3步中甲醇作为活化试剂的用量为5-20mL。

优选的，第4步中水溶性茶提取物的重量百分含量为20-60wt％。

优选的，第4步中添加吡虫啉和啶虫脒的浓度分别为1-20μg·mL^-1；茶提取物水溶液体积为5-50mL。

优选的，第5步中流速控制在0.5-3mL·min^-1。

优选的，第5步中对吡虫啉的脱除率大于98％、啶虫脒的脱除率大于95％。

优选的，第6步中吸附柱中96％以上的吡虫啉和94％以上的啶虫脒能够被洗脱。

本发明所述双模板表面分子印迹材料同时脱除水溶性茶提取物中吡虫啉和啶虫脒的方法的工作原理在于：将硅胶氨基化再丙烯酰化引入双键，以吡虫啉和啶虫脒为模板分子，以α-甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，在硅胶表面接枝聚合双模板分子印迹聚合物。该双模板硅胶表面分子印迹聚合物可以生成针对吡虫啉和啶虫脒的特异性吸附空穴，对茶多酚则没有特异性吸附作用，因此对于水溶性茶提取物中的吡虫啉和啶虫脒具有良好的脱除能力。此外，吸附有吡虫啉和啶虫脒的双模板分子印迹柱可以通过甲醇/乙酸溶液进行洗脱，洗脱之后的吸附柱可以重新利用。

有益效果：本发明所述双模板表面分子印迹材料同时脱除水溶性茶提取物中吡虫啉和啶虫脒的方法能够特异性地脱除水溶性茶提取物中的吡虫啉和啶虫脒，且对茶提取物中的茶多酚具有较小的吸附作用，对吡虫啉和啶虫脒的脱除率分别大于98％和95％，对提取物中茶多酚的损失小于14％。此外，本发明所制备的吸附柱可以通过甲醇/乙酸溶液进行洗脱，洗脱之后的吸附柱可以重新利用，因此能够很好地应用于茶提取物的制备工艺中，具有很好的应用前景。

附图说明

图1是本发明所述方法的技术模拟图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1茶多酚水溶液中吡虫啉和啶虫脒的脱除

本实施例提供了一种脱除茶多酚水溶液中吡虫啉和啶虫脒的方法，该脱除方法总共分为4步，分别为茶多酚水溶液的制备及预处理、分子印迹柱的制备、过柱吸附和吸附柱再利用。具体操作方法如下：

1)茶多酚水溶液的制备及预处理是称取1.5g茶多酚固体与100mL超纯水溶液中，制备成15g·L^-1的茶多酚溶液，添加吡虫啉和啶虫脒使其浓度分别为10μg·mL^-1通过0.25μm滤膜过滤后备用。

2)分子印迹柱的制备具体是将双模板表面分子印迹粉末与5mL去超纯水混匀后，湿法装柱装入已装填下筛板的SPE小柱中，柱体积约为3mL，用10mL甲醇对吸附柱进行活化，将活化后的吸附柱放置待用。

3)然后将10mL上述步骤1)中的茶多酚水溶液通过上述2)中制备的硅胶表面分子印迹柱中，调节流速1.25mL/min，待茶多酚溶液完全通过后，用10mL超纯水洗脱残留在吸附柱中的茶多酚，合并吸附液后测量吸附前后吡虫啉，啶虫脒以及茶多酚的浓度。检测结果显示，该吸附柱对吡虫啉的吸附率为99.1％，对啶虫脒的吸附率为96.8％，对茶多酚的吸附率仅为13.7％。

4)采用30mL甲醇-乙酸(v/v,9:1)混合溶剂对上述3)中的吸附柱进行洗脱，调节并控制流速为1.25mL·min^-1合并洗脱液后对吡虫啉和啶虫脒进行检测，检测结果显示吸附在吸附柱中97.2％的吡虫啉和95.8％的啶虫脒被洗脱液洗脱。

5)循环吸附上述1)中的茶多酚水溶液8次后，其对吡虫啉和啶虫脒的吸附率仍然达到87.3％和85.4％。

实施例2大容量茶多酚水溶液中吡虫啉和啶虫脒的脱除

根据实施例1中的方法，增加茶多酚水溶液的处理量，具体操作方法如下：

1)茶多酚水溶液的制备及预处理是称取1.5g茶多酚固体与100mL超纯水溶液中，制备成15g·L^-1的茶多酚溶液，添加吡虫啉和啶虫脒使其浓度分别为10μg·mL^-1通过0.25μm滤膜过滤后备用。

2)分子印迹柱的制备具体是将双模板表面分子印迹粉末与5mL去超纯水混匀后，湿法装柱装入已装填下筛板的SPE小柱中，柱体积约为3mL，用10mL甲醇对吸附柱进行活化，将活化后的吸附柱放置待用。

3)然后将50mL上述步骤1)中的茶多酚水溶液通过上述2)中制备的硅胶表面分子印迹柱中，调节流速1.25mL/min，待茶多酚溶液完全通过后，用10mL超纯水洗脱残留在吸附柱中的茶多酚，合并吸附液后测量吸附前后吡虫啉，啶虫脒以及茶多酚的浓度。检测结果显示，该吸附柱对吡虫啉的吸附率为98.2％，对啶虫脒的吸附率为95.6％，对茶多酚的吸附率仅为3.7％。

4)采用30mL甲醇-乙酸(v/v,9:1)混合溶剂对上述3)中的吸附柱进行洗脱，调节并控制流速为1.25mL·min^-1合并洗脱液后对吡虫啉和啶虫脒进行检测，检测结果显示吸附在吸附柱中96.6％的吡虫啉和94.8％的啶虫脒被洗脱液洗脱。

5)循环吸附上述1)中的茶多酚水溶液8次后，其对吡虫啉和啶虫脒的吸附率仍然达到89.4％和85.8％。

实施例3茶氨酸水溶液中吡虫啉和啶虫脒的脱除

根据实施例1中的方法，将茶多酚水溶液改换为茶氨酸水溶液，具体操作方法如下：

1)茶氨酸水溶液的制备及预处理是称取1.5g茶氨酸固体与100mL超纯水溶液中，制备成15g·L-1的茶氨酸溶液，添加吡虫啉和啶虫脒使其浓度分别为10μg·mL-1通过0.25μm滤膜过滤后备用。

2)分子印迹柱的制备具体是将双模板表面分子印迹粉末与5mL去超纯水混匀后，湿法装柱装入已装填下筛板的SPE小柱中，柱体积约为3mL，用10mL甲醇对吸附柱进行活化，将活化后的吸附柱放置待用。

3)然后将10mL上述步骤1)中的茶氨酸水溶液通过上述2)中制备的硅胶表面分子印迹柱中，调节流速1.25mL/min，待茶氨酸溶液完全通过后，用10mL超纯水洗脱残留在吸附柱中的茶氨酸，合并吸附液后测量吸附前后吡虫啉，啶虫脒以及茶氨酸的浓度。检测结果显示，该吸附柱对吡虫啉的吸附率为98.9％，对啶虫脒的吸附率为95.8％，对茶氨酸的吸附率仅为8.6％。

4)采用30mL甲醇-乙酸(v/v,9:1)混合溶剂对上述3)中的吸附柱进行洗脱，调节并控制流速为1.25mL·min-1合并洗脱液后对吡虫啉和啶虫脒进行检测，检测结果显示吸附在吸附柱中97.3％的吡虫啉和95.3％的啶虫脒被洗脱液洗脱。

5)循环吸附上述1)中的茶氨酸水溶液8次后，其对吡虫啉和啶虫脒的吸附率仍然达到88.5％和86.0％。