阅读说明：本技术 一种从山茶花中提取花青素的方法 (A method of extracting anthocyanidin from camellia ) 是由 何安乐 李伟 黄华学 于 2019-08-23 设计创作，主要内容包括：一种从山茶花中提取花青素的方法,包括以下步骤：(1)浸提：采用低共熔溶剂的水溶液对山茶花进行浸提,过滤离心,后得浸提液；(2)超滤：将浸提液过超滤膜,收集透过液；(3)纯化浓缩：将透过液依次上吸附树脂柱Ⅰ和吸附树脂柱Ⅱ,水赶,吸附树脂柱Ⅰ采用线性解吸,吸附树脂柱Ⅱ采用梯度解吸,按解吸液中花青素的含量高低,分别收集解吸液,分别浓缩,得浓缩液；(4)结晶干燥：向浓缩液中分别加入低级醇,进行析晶,固液分离,洗晶,干燥,得不同含量范围的产品。该方法从山茶花中提取的花青素产品,花青素含量高；且整个提取工艺条件温和,具有收率高,环境友好,适宜于产业化生产等特点。(A method of from camellia extract anthocyanidin, comprising the following steps: (1) extract: camellia is extracted using the aqueous solution of eutectic solvent, filter centrifugation, after leaching liquor；(2) ultrafiltration: leaching liquor is crossed into ultrafiltration membrane, collects permeate；(3) purifying concentration: liquid successively upper adsorption resin column I and adsorption resin column II be will transmit through, water is caught up with, and adsorption resin column I is using linear desorption, adsorption resin column II uses gradient desorption, by the content height of anthocyanidin in stripping liquid, collects stripping liquid respectively, it is concentrated respectively, obtains concentrate；(4) crystallizing and drying: being separately added into lower alcohol into concentrate, carries out crystallization, is separated by solid-liquid separation, washes crystalline substance, dry, obtains the product of different content range.The anthocyanidin product that this method is extracted from camellia, anthocyanidin content are high；And entire extracting factor is mild, has high income, environmental-friendly, the features such as being suitable for industrialization production.)

一种从山茶花中提取花青素的方法

技术领域

本发明涉及一种提取花青素的方法，具体涉及一种从山茶花中提取花青素的方法。

背景技术

山茶花，又称茶花，在我国具有悠久的栽培历史，是我国十大传统名花之一。山茶花主要用于蜜源、观赏及鲜花食品等，对山茶花花青素的报道和研究甚少，花青素具有抗氧化、清除自由基及抗突变等多种生理活性，从山茶花中提取花青素，提高山茶花的综合利用效率，具有非常广阔的发展前景。

CN104761596公开了一种制备花青素苷标准品的方法，该方法以山茶花的红色新鲜花瓣(或干花瓣)为原料，室温下用酸性乙醇水溶液浸提12-24h，浸提液过滤后减压浓缩，再用酸性食用酒精和水为流动相，经大孔树脂、凝胶、填料依次进行柱层析，还通过多次反相柱层析纯化从而得到高纯度花青素苷标准物质。该方法涉及到多次制备色谱纯化工艺，故而处理量比较小，工艺要求也较高，难以实现规模化生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：克服以上不足，提供一种从山茶花中提取花青素的方法，所述方法从山茶花中提取花青素产品的收率高，得到的花青素产品的纯度也高，为综合利用山茶花提供一条新途径。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种从山茶花中提取花青素的方法，包括以下步骤：

（1）浸提：采用低共熔溶剂的水溶液对山茶花进行浸提，过滤离心后得浸提液；

（2）超滤：将浸提液过超滤膜，收集透过液；

（3）纯化浓缩：将透过液依次上吸附树脂柱Ⅰ和吸附树脂柱Ⅱ，水赶，吸附树脂柱Ⅰ采用线性解吸，吸附树脂柱Ⅱ采用梯度解吸，按解吸液中花青素的含量分别收集解吸液，分别浓缩，得浓缩液；

（4）析晶干燥：向浓缩液中分别加入低级醇，进行析晶，固液分离，洗晶，干燥，得不同含量范围的产品。

本发明从山茶花中提取的花青素产品，产品纯度高，整个提取工艺条件温和，具有收率高，环境友好，适宜于产业化生产等特点。

优选的，步骤（1）中，所述低共熔溶剂包括氢键受体和氢键供体，所述氢键受体为有机盐类。优选的，所述有机盐类为氯化胆碱或甜菜碱，更为优选的，所述有机盐类为氯化胆碱。

优选的，所述氢键供体选自苹果酸、柠檬酸、脯氨酸、酒石酸和乙二酸中的一种或多种，更为优选的，所述氢供体为柠檬酸或脯氨酸。

优选的，所述有机盐类与氢键供体的质量比为1:0.25~4，更为优选的，所述有机盐类与氢键供体的质量分数比例为1:0.5~2。

优选的，所述低共熔溶剂的水溶液中水的质量分数为20%~70%，更优选用的，所述所述低共熔溶剂的水溶液中水的质量分数为20%~40%。

低共熔溶剂是由氢键受体和氢键供体组成，具有成本低、易合成、生物可降解、高增溶及低毒性甚至无毒性等特性，是一种新型的绿色溶剂。

优选的，所述山茶花品种为红山茶、云南茶花或茶梅中的任意一种，更为优选的，所述山茶花品种为红山茶。

优选的，所述山茶花与所述低共熔溶剂的水溶液的质量比为1:20~50，更为优选的，所述所述山茶花与所述低共熔溶剂的水溶液的质量比为1:30~40。

优选的，步骤（1）中，所述浸提为多次浸提，其次数为2~5次，更为优选的，所述次数为3~4次。

优选的，所述浸提的时间为3~8h/次，更为优选的，所述浸提的时间为4~6h/次。

优选的，步骤（3）中，所述吸附树脂柱Ⅰ和吸附树脂柱Ⅱ的填料选自D101、XAD-1、XAD-7HP、DM-130、AB-8和DM-301型大孔树脂中的一种，更为优选的，所述填料为D101、XAD-1或XAD-7HP型大孔树脂。

优选的，所述吸附树脂柱Ⅰ和吸附树脂柱Ⅱ的高径比为10~3:1，更为优选的，所述吸附树脂柱Ⅰ和吸附树脂柱Ⅱ的高径比为7~4:1。

优选的，所述上吸附树脂柱Ⅰ和吸附树脂柱Ⅱ的具体操作为：首先将透过液上吸附树脂柱Ⅰ，当柱Ⅰ临近饱和时，串联吸附树脂柱I和吸附树脂柱Ⅱ，继续将透过液上吸附树脂柱I至已上柱液重量的0.5~1.4倍后，上柱结束；更为优选的，继续将透过液上吸附树脂柱I至已上柱液重量的0.6~0.8倍，上柱结束。

两个大孔树脂串柱上柱，可以在柱Ⅰ吸附饱和后发生竞争性吸附，从而使得杂质被竞争解吸下来后进入柱Ⅱ，从而达到进一步纯化的目的。

优选的，所述水赶后，断开附树脂柱I和吸附树脂柱Ⅱ，所述水赶采用水的量为3~5BV，更为优选的，所述水赶采用水的量为3.5~4BV。

上柱结束后，水赶可有效的将未吸附的料液充分被吸附，同时也可以洗掉部分杂质。

优选的，所述吸附树脂柱Ⅰ用采用线性解吸，即甲醇或乙醇水溶液的质量分数由0%开始洗脱，直至线性增加到60~80%，更优选的，直至线性增加到70%。

优选的，所述吸附树脂柱Ⅰ的甲醇或乙醇水溶液的体积为3~10BV，更优选的，所述吸附树脂柱Ⅰ的甲醇或乙醇水溶液的体积为4~6BV。

优选的，所述吸附树脂柱Ⅰ的解吸液中的花青素达到0.1%时开始收集，直至解吸液中花青素含量达到40%~60%时，开始分第二段收集且合并后面所有解吸液；更优选的，所述吸附树脂柱Ⅰ的解吸液中的花青素达到0.1%时开始收集，直至解吸液中花青素含量达到45%~50%时，开始分第二段收集且合并后面含有花青素的解吸液。

优选的，所述吸附树脂柱Ⅱ采用梯度解吸，采用质量分数为55~80%甲醇或乙醇水溶液进行解吸并收集解吸液，更优选的，采用质量分数为65~70%甲醇或乙醇水溶液进行解吸并收集解吸液。

优选的，所述甲醇或乙醇水溶液的体积为2.5~5BV，更优选的，所述甲醇或乙醇水溶液的体积为3~4BV；

优选的，步骤（4）中，所述浓缩为真空低温浓缩或反渗透膜浓缩，更为优选的，所述浓缩为反渗透膜浓缩。低温浓缩更有利于稳定花青素。

优选的，所述浓缩至浓缩液的Brix值为40～70%；更为优选的，所述浓缩至浓缩液的Brix值为50～60%。

优选的，所述低级醇与所述浓缩液的体积比为1~20:1，更为优选的，所述低级醇与所述浓缩液的体积比为5~15:1。

优选的，步骤（4）中，所述析晶的温度为-10~40℃，更为优选的，所述析晶的温度为0~10℃。

优选的，所述析晶的时间为4~24h。，更为优选的，所述析晶的时间为6~12h。。

长时间低温条件更有利于充分结晶，一定高浓度的饱和花青素醇溶液，是析晶的先决条件。

优选的，步骤（4）中，所述洗晶为采用低级醇溶液直接淋洗。

优选的，所述低级醇为甲醇或乙醇，更为优选的，所述低级醇为乙醇。

优选的，所述低级醇溶液的低级醇含量为80%以上，更为优选的，所述低级醇溶液的低级醇含量为90%以上。

优选的，所述淋洗的温度为-10~40℃，更为优选的，所述淋洗的温度为0~10℃。

所述对结晶进行淋洗可以冲洗掉晶体表面的杂质。

优选的，步骤（4）中，所述干燥为真空冷冻干燥，温度为-10～-70℃，真空度为5～15Pa。

真空冷冻干燥的温度低，对花青素的影响小。

本发明的有益效果在于：

（1）由于本方法采用串柱方式进行上柱，并单独解吸，同时使用线性解吸的方式对大孔树脂柱进行洗脱，更为精准的将目标物质进行分离，最后采用结晶的方法再次纯化，从而使得产品纯度进一步提高，利用本发明提取方法可高收率的从山茶花中提取花青素产品，得到的花青素产品的纯度较高，且收率较高；

（2）本发明的整个提取工艺条件温和，工艺简单，环境友好，适宜于产业化生产。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行进一步的说明。

各实施例使用的原料山茶花包括经过真空干燥、鼓风干燥、冷冻干燥、速冻等方式处理的新鲜山茶花、冷冻山茶花和脱水山茶花。

本发明实施例中花青素含量的检测方法为植物提取物越橘提取物SW/T-2013 附录A.2的测定方法。本发明实施例检测使用的高效液相色谱仪为：高效液相色谱检测仪为安捷伦科技有限公司Agilent technologies生产，型号：HPLC-1260。

本发明实施例所使用的原料或化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。

本发明实施例所使用的大孔树脂在使用前先进行活化，具体的方法为：将新鲜树脂用体积分数95%的乙醇溶液浸泡24h后，用蒸馏水冲洗至无醇味，用3BV、质量分数2.5%的盐酸溶液浸泡5.5h，用蒸馏水冲洗至中性，然后，再用3BV、质量分数3.5%的NaOH溶液浸泡5.5h，用蒸馏水冲洗至中性即成。

实施例1

本实施例包括以下步骤：

（1）浸提：将500g新鲜紫袍山茶花（浸提前取样送检，花青素的质量百分含量为1.21%）置于20℃的含水质量百分数为40%的低共熔溶剂的水溶液（低共熔溶剂中，氯化胆碱和柠檬酸的质量比为1:2）中浸提，低共熔溶剂的水溶液用量为15kg，分3次浸提，每次浸提4h，并间断进行搅拌，每次浸提后过100目滤网得浸提液，将浸提液合并后离心，得粗提液；

（2）超滤：将粗提液过截留分子量为3KDa的超滤膜，收集透过液；

（3）纯化浓缩：将透过液以流速为1BV/h上高径比为6:1、填料为D101型大孔树脂的吸附树脂柱I至临近饱和时，串联吸附树脂柱I和吸附树脂柱Ⅱ，并继续上吸附树脂柱I至已上柱透过液的1.0倍后，停止上柱，接着用3BV的水进行水赶，断开吸附树脂柱I和吸附树脂柱Ⅱ；吸附树脂柱Ⅰ用体积为5BV、质量分数为0~65%乙醇水溶液以线性方法进行解吸，解吸液中的花青素达到0.1%时开始收集，直至解吸液中花青素含量达到50%时，开始分第二段收集且合并后面含有花青素的解吸液；柱Ⅱ用体积为3BV、质量分数为70%乙醇水溶液进行梯度解吸并单独收集，分别将三种解吸液进行反渗透膜浓缩至Brix值为53%，得浓缩液，浓缩温度≤30℃；

（4）析晶干燥：分别向三种浓缩液加入对应4倍体积的85%乙醇，然后置于温度为-5℃条件下析晶20h，并伴随搅拌；析晶完成后，离心分离出晶体，然后用温度为-10℃、体积分数为90%的乙醇进行淋洗至近无色后，将晶体在温度为-60℃、真空度为8Pa的条件下真空冷冻干燥，即分别得到4.67g、3.53g、2.23g产品。

经高效液相色谱检测，本发明实施例所得产品中花青素的质量百分含量分别为28.12%、82.01%、61.09%，花青素的总收率为92.07%。

实施例2

（1）浸提：将500g新鲜火瀑布山茶花（浸提前取样送检，花青素的质量百分含量为1.36%）置于0℃的含水量为30%的低共熔溶剂的水溶液（低共熔溶剂的水溶液中，甜菜碱与脯氨酸的质量比为1:1）中浸提，低共熔溶剂水溶液的用量为20kg，分4次浸提，每次浸提3h，并间断进行搅拌，每次浸提后过100目滤网，得浸提液，将浸提液合并后离心，得粗提液；

（2）超滤：将粗提液过截留分子量为3KDa的超滤膜，收集透过液；

（3）纯化浓缩：将透过液以流速为1BV/h上高径比为4:1、填料为XAD-7HP型大孔树脂的吸附树脂柱I至临近饱和时，串联吸附树脂柱I和吸附树脂柱Ⅱ，并继续上吸附树脂柱I已上柱液的0.6倍后，停止上柱，接着用4BV的水进行水赶，断开吸附树脂柱；吸附树脂柱Ⅰ用体积为7BV、质量分数为0~60%甲醇水溶液以线性方法进行解吸，解吸液中的花青素达到0.1%时开始收集，直至解吸液中花青素含量达到50%时，开始分第二段收集且合并后面含有花青素解吸液；吸附树脂柱Ⅱ用体积为2.5BV、质量分数为65%甲醇水溶液进行梯度解吸并单独收集；分别将三种解吸液进行低温真空浓缩至Brix值为67%，得浓缩液，浓缩温度为≤65℃；

（4）析晶干燥：分别向三种浓缩液加入10倍体积的90%甲醇，然后置于温度为0℃条件下析晶5h，并伴随搅拌；析晶完成后，离心分离出晶体，然后用温度为0℃、体积分数为95%的甲醇进行淋洗至近无色后，将晶体在温度为-30℃、真空度为10Pa的条件下真空冷冻干燥，即分别得到4.18g、4.04g、3.81g产品。

经高效液相色谱检测，本发明实施例所得产品中花青素的质量含量分别为18.38%、79.31%、59.56%，花青素的总收率为91.79%。

实施例3

（1）浸提：将500g新鲜贝拉大玫瑰山茶花（浸提前取样送检，花青素的质量百分含量为0.98%）置于25℃的含水量为60%的低共熔溶剂的水溶液（低共熔溶剂水溶液中，氯化胆碱和酒石酸的质量比为1:1）中浸提，低共熔溶剂水溶液的用量为10kg，分3次浸提，每次浸提3h，并间断进行搅拌，每次浸提后，过100目滤网，得浸提液，将浸提液合并后离心，得粗提液；

（2）超滤：将粗提液过截留分子量为3KDa的超滤膜，收集透过液；

（3）纯化浓缩：将透过液以流速为1BV/h上高径比为8:1、填料为DM-301型大孔树脂的吸附树脂柱I至临近饱和时，串联吸附树脂柱I和吸附树脂柱Ⅱ，并继续上吸附树脂柱I已上柱液的1.4倍后，停止上柱，接着用5BV的水进行水赶，断开吸附树脂柱I和吸附树脂柱Ⅱ；吸附树脂柱Ⅰ用体积为4BV、质量分数为0~75%乙醇水溶液以线性方法进行解吸，解吸液中的花青素达到0.1%时开始收集，直至解吸液中花青素含量达到50%时，开始分第二段收集且合并后面含有花青素解吸液；柱Ⅱ用体积为4.5BV、质量分数为60%乙醇水溶液进行梯度解吸并单独收集；分别将三种解吸液进行反渗透膜浓缩至Brix值为41%，得浓缩液，浓缩温度为≤40℃；

（4）析晶干燥：分别向三种浓缩液中加入15倍体积的95%甲醇，然后置于温度为25℃条件下析晶20h，并伴随搅拌；析晶完成后，离心分离出晶体，然后用温度为30℃、体积分数为85%的乙醇进行淋洗至近无色后，将晶体在温度为-10℃、真空度为13Pa的条件下真空冷冻干燥，即分别得到3.31g、3.12g、1.31g产品。

经高效液相色谱检测，本发明实施例所得产品中花青素的质量含量分别为36.71%、85.92%、53.20%，花青素的总收率为93.73%。