一种响应面法优化提取洋紫荆花青素的方法
阅读说明：本技术 一种响应面法优化提取洋紫荆花青素的方法 (Method for optimizing and extracting cercis negundo anthocyanin by response surface method ) 是由 田长恩 刘芳莉 于 2021-09-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种响应面法优化提取洋紫荆花青素的方法。通过本发明的响应面法优化提取洋紫荆花青素的方法获得洋紫荆花青素最优提取工艺,提取到的花青素抗氧化活性好,1mL浓度为1OD的洋紫荆花青素提取液抗氧化活性相当于2.733mg的L-抗坏血酸。(The invention discloses a method for optimally extracting cercis chinensis anthocyanin by a response surface method. The optimal extraction process of the cercis chinensis anthocyanin is obtained by the method for optimally extracting the cercis chinensis anthocyanin by the response surface method, the extracted anthocyanin is good in antioxidant activity, and 1mL of the cercis chinensis anthocyanin extracting solution with the concentration of 1OD is equivalent to 2.733mg of L-ascorbic acid in antioxidant activity.)
技术领域
本发明涉及花青素提取技术领域，尤其涉及一种响应面法优化提取洋紫荆花青素的方法。
背景技术
花青素具有极强的抗氧化能力、对自由基也有较强的清除能力，且生物利用度高，对人体的生物有效性可达100％。近年来，发现花青素还具有减轻DNA损伤、减少DNA断裂和细胞内活性氧种类、减轻青少年抑郁症状、对睾丸有靶向作用等生理活性。
洋紫荆在我国南方地区作为观赏性植物，栽种广泛、花期长，花瓣紫红色，推测其富含花青素，以其作为原材料提取花青素，成本低廉，应该具有较大的开发潜力；同时，对其花青素的抗氧化能力进行研究可以为后续的开发和利用提供参考，促进利用洋紫荆花青素生产更绿色、环保、天然的护肤品和保健品等，提高人们的生活质量。
在提取工艺优化实验中，响应面法比正交法更具可信度。响应面优化法所获得的预测模型是连续的，在实验条件优化过程中，可以连续的对实验的各个水平进行分析；而正交实验只能对一个个孤立的实验点进行分析。响应面优化法考虑到了实验的随机误差，同时，它将复杂的未知函数关系在小区域内用简单的一次或二次多项式模型来拟合，计算简便。
CN110526892A中公开了一种从蓝靛果中提取花青素的方法，该方法通过浸提、超滤、树脂吸附洗脱、析晶，得到产品。该方法以水为溶剂从蓝靛果中提取的花青素产品花青素含量高、收率高，提取工艺条件温和，污染小，适宜于实际生产。但该方法使，成本较高、资源消耗大，工艺复杂。
CN110437197A中公开了一种从蝶豆花中提取花青素的方法，该方法通过脱脂、浸提、超滤、浓缩、醇沉、树脂吸附、梯度解吸、浓缩干燥，得花青素产品。该方法可从蝶豆花中同时提取多种含量的花青素产品，收率高、且整个提取工艺条件温和，环境友好。但该方法使用乙醇和多种有机酸，成本较高、资源消耗大，工艺复杂。
CN109020941A中公开了一种紫甘薯花青素的提取方法，该方法通过超声波、微波协同提取，离心、浓缩、真空冷冻干燥，得到花青素产品。该方法花青素提取率较高、纯度较高，具有推广应用价值。但该法操作相对复杂，且成本较高，对仪器设备的要求也相对高。
CN107474031A中公开了一种响应面法优化莲蓬原花青素的提取方法，该方法利用响应面法对甘油溶液的浓度、提取温度、提取时间3个影响原花青素提取的因素进行优化，得到了以甘油作为提取剂的莲蓬原花青素最佳提取工艺。该方法操作简单，使用的甘油，既无毒，也由于甘油提取物能够直接添加到某些食品、化妆品等产品中，有利于产业化的应用，具有较好的经济效益和社会效益。但使用甘油做提取剂，成本相对高；且没有考虑到液料比对提取率的影响。
概言之，乙醇等有机溶剂常被用于花青素的提取，其溶解的不止是花青素，导致提取物杂质含量高，须进一步分离纯化，增加生产成本。与水提取法相比，有机溶剂提取法生产成本更高、环境损害更大，且若所提取的花青素用于化妆品或食品工业，则所用溶剂还必须符合食用标准。水提取法尽管比有机溶剂提取法更环保、更经济，但是，目前该法的提取效率还有待提高，包括缩短提取周期、提高原料利用率等。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种响应面法优化提取洋紫荆花青素的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种响应面法优化提取洋紫荆花青素的方法，包括以下步骤：
(1)以洋紫荆为原料，进行洋紫荆花青素提取的单因素试验，包括花瓣种类的选择、提取剂种类的选择、浸提液pH值的选择、浸提温度的选择、浸提时间的选择和液料比的选择；
(2)以浸提温度、浸提时间、液料比为影响因素，以洋紫荆中所提取的花青素的吸光度为响应值，应用中心组合(Box-Behnken)试验建立数学模型，进行响应面分析，筛选出对洋紫荆花青素提取影响显著的因素；
(3)对影响因素相互作用的等高线图、响应面3D图和数学模型进行分析，确定提取洋紫荆花青素的最佳提取工艺。
优选地，在步骤(1)前还包括以下步骤：将新鲜洋紫荆花瓣自然晾干后进行折干率的测定；将洋紫荆干花的蒸馏水提取液于400～600nm的波长下扫描，得洋紫荆花青素最佳检测波长；确定洋紫荆花青素浓度与其抗氧化活性的相关性。
优选地，步骤(1)所述花瓣种类的选择具体为：以花瓣的种类为变量，控制其他因素的反应条件一致，在洋紫荆花青素最佳检测波长下分别测量不同状态下的洋紫荆花瓣花青素提取液的吸光度。
优选地，步骤(1)所述提取剂种类选择具体为：以提取剂的种类为变量，控制其他因素的反应条件一致，在洋紫荆花青素最佳检测波长下分别测量不同提取剂提取出的洋紫荆花青素提取液的吸光度。
优选地，步骤(1)所述浸提液pH值的选择具体为：以浸提液pH值为变量，控制其他因素的反应条件一致，在洋紫荆花青素最佳检测波长下分别测量不同的pH值下洋紫荆花青素提取液的吸光度。
优选地，步骤(1)所述浸提时间的选择具体为：以浸提时间为变量，控制其他因素使其他因素的反应条件一致，在洋紫荆花青素最佳检测波长下分别测量不同的浸提时间下洋紫荆花青素的吸光度。
优选地，步骤(1)所述液料比的选择具体为：以液料比为变量，控制其他因素的反应条件一致，在洋紫荆花青素最佳检测波长下分别测量不同的液料比下洋紫荆花青素提取液的吸光度。
优选地，步骤(1)所述浸提温度的选择具体为：以浸提温度为变量，控制其他因素的反应条件一致，在洋紫荆花青素最佳检测波长下分别测量不同的浸提温度下洋紫荆花青素提取液的吸光度。
优选地，在步骤(2)之前还包括以下步骤：探究花青素提取液颜色对吸光度测量结果的影响。
步骤(2)所述应用中心组合试验建立数学模型具体为：运用Box-Behnken复合模型，进行影响因素的水平试验，以洋紫荆中所提取的花青素的吸光度为响应值，运用DesignExpert软件对试验所得的数据进行回归分析，得到洋紫荆花青素提取液吸光度与所述影响因素之间的数学模型。
所述数学模型为：7.86456+0.046173×A－0.159535×B－0.483250×C－0.00112×AB+0.004925×AC+0.000462×BC－0.000246×A2+0.001432×B2+0.10419×C2；其中，A为浸提时间，B为浸提温度，C为液料比。
洋紫荆花青素最佳提取工艺提取的洋紫荆花青素提取液通过ABTS自由基清除实验确定抗氧化活性。
优选地，所述抗氧化活性确定具体为：将最佳提取工艺提取的洋紫荆花青素提取液进行ABTS自由基清除实验，计算其抗氧化活性；同时通过ABTS自由基清除实验做现有抗氧化活性产品的抗氧化活性标准曲线，将洋紫荆花青素提取液与其抗氧化活性进行对比，计算该最佳提取工艺所得提取液的抗氧化活性对应的现有抗氧化活性产品质量数。
一种洋紫荆花青素提取工艺，通过上述响应面法优化提取洋紫荆花青素的方法得到。
所述洋紫荆花青素提取工艺：以自然风干的洋紫荆自然落花为原料，粉碎后以pH接近7的水为提取剂，70℃浸提5min，液料比1:30(g/mL)。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
采用本发明的响应面法优化方法可得到洋紫荆花青素的最优提取工艺，采用此工艺提取到的洋紫荆花青素抗氧化活性好，1mL浓度为1OD的洋紫荆花青素提取液抗氧化活性相当于2.733mg的L-抗坏血酸。
附图说明
图1是洋紫荆花青素稀释度与其抗氧化活性的关系检测结果图。
图2是花瓣状态对所花青素含量的影响检测结果图。
图3是提取剂种类对花青素含量及其抗氧化活性的影响检测结果图。
图4是提取剂pH对洋紫荆花青素提取率的影响检测结果图。
图5是提取时间对花青素提取率的影响检测结果图。
图6是料液比对花青素提取率的影响检测结果图。
图7是浸提温度对花青素提取率的影响检测结果图。
图8是花青素提取液稀释度与其抗氧化活性的关系检测结果图。
图9是浸提时间与浸提温度的响应面3D图。
图10是浸提时间与液料比的响应面3D图。
图11是浸提温度与液料比的响应面3D图。
图12是L-抗坏血酸溶液抗氧化活性的标准曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中所使用的ABTS工作液为现用现配，具体为：以蒸馏水为溶剂，加入2，2’-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)，配制成溶液。称取ABTS 0.01g溶于10mL蒸馏水中，摇匀至其完全溶解；称取(NH4)2S2O80.052g溶于40mL蒸馏水中，摇匀至其完全溶解；将两溶液混匀，静置12-16小时，配制成ABTS工作液。
实施例1折干率测定结果
称量采集的新鲜洋紫荆花瓣重量(M)，将其自然晾干后再进行称重(W)，按折干率＝W/M×100％计算，重复该操作三次，计算三份洋紫荆鲜花折干率平均值，得洋紫荆鲜花折干率为9.85％(表1)。
表1洋紫荆鲜花折干率
实施例2洋紫荆花青素吸收峰检测
取已粉碎的洋紫荆自然风干花0.1g，加入20mL蒸馏水，25℃下浸泡20min，过滤，重复以上操作三次。使用紫外-可见光分光光度计扫描三次，取三次扫描波长数的平均值。经扫描，得洋紫荆花青素的吸收峰波长数为523nm。
实施例3洋紫荆花青素浓度与其抗氧化活性的相关性
取某一花青素提取液，分别稀释2、4、8、16倍，经ABTS自由基清除实验测定各稀释倍数的洋紫荆花青素提取液检测抗氧化活性，重复以上操作三次。根据数据平均值做出洋紫荆花青素与其抗氧化活性的散点图，求出R2，得图1。
图1表明，R2>0.9，洋紫荆花青素与抗氧化活性具线性相关关系。后续实验只需测量洋紫荆花青素浓度，优化出最佳工艺再进行抗氧化活性测定。
实施例4花瓣状态对所提取花青素含量的影响
分别称取洋紫荆：1g新鲜自然落下的地上鲜花、树上鲜花、0.1g保存数月的自然落下的地上干花，加适量液氮，研磨成粉末，以水为提取液，25℃下液料比为200:1(mL/g)浸泡20min，过滤，在523nm下测量吸光值。每组设三个平行实验，结果如图2所示。
图2表明地上干花与树上鲜花提取的花青素含量相近，但均低于地上鲜花。这可能与地上鲜花中的部分在收集时已经失水，造成其提取的花青素含量偏高有关。考虑到鲜花不易保存、受花期限制且采摘花朵会破坏其观赏价值等因素，以自然晾干的落花(地上干花)为最佳原料。
实施例5提取剂种类对所提取花青素含量及其抗氧化活性的影响
称取24份0.1g经粉碎机粉碎的保存数月的自然晾干的落花，分别加入体积为20mL(液料比200:1(mL/g)的蒸馏水、乙醇体积为30％、50％、60％、75％的乙醇溶液、无水乙醇、质量分数为0.1％、0.3％的HCl溶液中，25℃下浸提20min，过滤。每组设三个平行实验。取3mL洋紫荆花青素提取液，在523nm下测定吸光度，通过ABTS自由基清除实验得其抗氧化活性，得图3。
图3表明，尽管用60％乙醇提取的花青素含量相对较高，但其抗氧化活性与所有处理间均不存在显著差异，这可能与乙醇的存在影响花青素的抗氧化活性有关。考虑到节约成本、保护环境以及便于后期开发产品，因此蒸馏水为最佳提取剂。
实施例6提取剂pH对所提花青素含量的影响
称取21份0.1g经粉碎机粉碎的保存数月的洋紫荆自然晾干的落花，加入体积为6mL(液料比60:1(mL/g))的pH值分别调节至2、3、4、5、6、7、8的蒸馏水作为提取剂，25℃浸提20min，过滤，在523nm下测量吸光值。每组设三个平行实验，得图4。
图4表明，提取剂为酸性、中性时所提取的洋紫荆花青素含量差异不大，碱性时含量较高。但经查阅文献，花青素在酸性条件下更稳定，因此测定了pH为6、7、8的洋紫荆花青素提取液对应的抗氧化活性，发现浸提液为碱性时的洋紫荆花青素抗氧化活性明显低于酸性、中性条件。因此pH接近7的中性蒸馏水为最佳提取剂。
实施例7浸提时间对所提花青素含量的影响
称取27份0.1g经粉碎机粉碎的保存数月的洋紫荆自然晾干的落花，在50mL锥形瓶中各加入体积为10mL的蒸馏水(液料比100:1(mL/g))，分别按照5、10、15、20、25、30min的浸提时间25℃浸提，过滤，在523nm下测量吸光值。每组设三个平行实验，得图5。
图5表明，浸提时间不少于15min，花青素提取率保持稳定。
实施例8液料比对所提花青素含量的影响
称取18份0.1g经粉碎机粉碎的保存数月的洋紫荆自然晾干的落花，在50mL锥形瓶中各加入5、8、10、15、20、25mL蒸馏水，液料比分别为1:50、1:80、1:100、1:150、1:200、1:250(g/mL)，25℃浸提10min，过滤，在523nm下测量吸光值。每组设三个平行实验，得图6。
图6表明，液料比为50:1时所提取的花青素含量最高，液料比为80:1之后洋紫荆花青素提取率相对稳定。
实施例9浸提温度对所提花青素含量的影响
称取18份0.1g经粉碎机粉碎的保存数月的洋紫荆自然晾干的落花，在15mL离心管中各加入8mL蒸馏水，液料比为80:1(mL/g)，用真空机将离心管抽成真空状态，将浸提液摇晃均匀，分别以25℃、30、40、50、60、70℃的浸提温度浸提15min，过滤，在523nm下测量吸光值。每组设三个平行实验，得7(图中25℃为室温条件)。
图7表明，浸提温度为60℃时所提取花青素含量最高，之后含量降低，这与花青素在高温条件下会分解有关，温度越高，分解速度越快。
实施例10花青素提取液颜色对吸光度的影响
取某一花青素提取液，分别稀释2倍、5倍、10倍、15倍，各取相同体积(3mL)稀释液，在洋紫荆花青素吸收峰波长处测定吸光度，进行ABTS自由基清除实验，测定各稀释液的抗氧化活性，得图8。
图8表明，原液稀释五倍以上，抗氧化活性与花青素含量呈线性相关，由于ABTS工作液为绿色，洋紫荆花青素提取液为深褐色，因此，考虑到要排除颜色对测量数值的影响，选择将原液稀释10倍后测定其抗氧化活性，稀释十倍后的花青素提取液颜色均接近透明，几乎已经排除花青素提取液颜色对实验的影响。
实施例11
完成以上单因素实验后，对实验结果进行分析，以自然晾干的落花为原材料、水为提取剂，利用Box-Behnken Design(BBD)的中心组合原理，对浸提时间、浸提温度、浸提液料比三个因素进行三因素三水平的实验设计，实验因素水平选择及设计如表2所示。
表2响应面实验编码表
实施例12
通过选取浸提时间、浸提温度、浸提液料比为影响因素，以红洋紫荆中所提取的花青素的吸光度为响应值，在单因素试验的基础上应用中心组合试验设计建立数学模型，进行响应面的分析，响应面设计与结果如表3所示，方差分析如表4所示，拟合程度如表5所示。
表3响应面实验方案与实验结果
表4方差分析表
注:*表示差异显著(P＜0.05)，**表示差异极显著(P＜0.01)，P＞0.05则差异不显著。
对因素和响应值做多原回归分析，得到对应的二次项拟合方程(即洋紫荆花青素提取率X)为X＝7.86456+0.046173×A－0.159535×B－0.483250×C－0.00112×AB+0.004925×AC+0.000462×BC－0.000246×A2+0.001432×B2+0.10419×C2
从表中结果看，模型的P值<0.0001，证明回归效果是极显著的；失拟项的P值>0.05，没有失拟因素，因此可用回归方程代替真实实验点分析实验结果。
根据方差分析结果，得到C、AB、AC、B2为此模型的显著因素，C、AB、B2影响极显著，AC影响显著。
通过F值的大小可以看出本实验中三因素对洋紫荆花青素提取率影响的主次顺序：C(液料比)>A(浸提时间)>B(浸提温度)。
表5拟合程度
本实验Adjusted R2＝0.9779(>0.8)，变异系数C.V.为4.06％，该模型合适，其拟合程度较好，可以用来初步分析和预测最佳洋紫荆花青素提取工艺。
实施例13
通过观察响应面的等高线和响应面3D图，可以分析出影响的大小。等高线图中，二者交互作用不显著时，等高线呈圆形；交互作用显著时，等高线呈椭圆形或马蹄形。3D图中，坡度越陡，则响应值受因素的影响越大；反之，响应值受条件因素的影响越小。
图9、10、11呈现出本实验中的3个因素对洋紫荆花青素提取率影响的交互作用强烈程度。从图中可以看出，浸提时间与浸提温度形成的响应面坡度在三个响应面图中最陡峭，说明交互作用最强的是浸提时间与浸提温，浸提时间与液料比次之，交互作用最弱的是浸提温度与液料比，与方差分析的结果无异。
实施例14响应面优化及验证
本实验中响应值的物理意义是洋紫荆花青素提取率，因此优化三因素使提取率达到最大值，系统预测出的洋紫荆花青素最佳提取工艺如表6所示。
根据实验操作的实际情况，将已上最优工艺条件优化为：浸提时间5min，浸提温度70℃，液料比1:30(g/mL)。在这个最佳的提取条件下洋紫荆花青素的提取液的吸光值预测值为2.315(表7)。根据该工艺做三组平行提取实验进行验证，测得洋紫荆花青素提取含量较稳定，偏差小，平均值为2.988，优于系统预测值，因此此模型可靠，结果可信度高。
表6
表7方法(找到100组方法)
实施例15ABTS自由基清除实验测定洋紫荆花青素提取液的抗氧化活性
取2mL ABTS工作液，在734nm波长处测定并记录吸光度，加入1mL稀释十倍的洋紫荆花青素提取液(采用实施例14得到的优化工艺提取)，混匀，避光处理3min，在734nm波长处测定吸光度。按S＝(A0-A)/A0×100％计算ABTS自由基清除率(S)，其中，A0为ABTS·+溶液的吸光度，A为加花青素提取液后的吸光度。结果如表8所示。
表8最优工艺提取的洋紫荆花青素提取液抗氧化活性
将L-抗坏血酸配置成0.01、0.02、0.05、0.1g/L浓度梯度的溶液，用ABTS自由基清除实验测定其抗氧化活性，绘制成L-抗坏血酸抗氧化活性的标准曲线，结果如图12所示。
由图12得知采用实施例14得到的最优提取工艺提取的1mL、浓度为1OD的洋紫荆花青素提取液抗氧化活性相当于2.733mg的L-抗坏血酸。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
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