具体实施方式

以下将结合具体的实施例来进一步阐述本发明的技术方案。

本发明所述重组III型人源化胶原蛋白为申请号为201811438582.6、发明名称为“多肽、其生产方法和用途”的专利申请记载。

在一项实施方案中，本发明的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白包含以SEQ ID No.1所示的序列(由30个氨基酸组成，从N段到C段依次为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP)的n个重复，n为大于等于1的整数；其中，当n为大于等于2的整数时，各重复序列之间是直接连接的。

在一项优选的实施方案中，本发明的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白包含以SEQ IDNo.1所示的序列的n个重复，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、20、24或32；其中，当n为大于等于2的整数时，各重复序列之间是直接连接的。

在一项更优选的实施方案中，本发明的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白包含以SEQ IDNo.1所示的序列的16个重复，各重复序列之间是直接连接的。

除非另有说明，本发明中使用的仪器、试剂、材料、实验动物等均可通过常规商业手段获得。

实施例1：重组III型人源化胶原蛋白促进CE大鼠子宫内膜形态学恢复

80只6-8周Sprague Dawley大鼠(220-260g)购买并饲养于重庆医科大学动物中心。饲养1周后，将大鼠随机分为正常对照组(n＝20，40个子宫)、假手术组(n＝20，40个子宫)、模型组(n＝20，40个子宫)、治疗组(n＝20，40个子宫)。

正常对照组(NC)大鼠不予以任何处理。假手术组(SHAM)仅大鼠麻醉、腹部消毒后，开腹，将子宫暴露在空气中30min后缝合腹部，24h麻醉后行相同的操作。模型组(MODEL)大鼠麻醉、腹部消毒后，开腹，自宫角处向两侧宫腔内各注射150μl LPS溶液(5mg/ml)后缝合腹部，24h麻醉、消毒开腹于相同的位置注射150μl无菌PBS溶液后缝合腹部。治疗组(COL)大鼠麻醉、腹部消毒后，开腹，自宫角处向两侧宫腔内各注射150μl LPS溶液(5mg/ml)后缝合腹部，24h后麻醉、消毒开腹于相同的位置注射150μl重组III型人源化胶原蛋白(包含16个重复序列)溶液(10mg/ml)后缝合腹部。每组分别于治疗1d、4d、7d、14d、28d处死4只大鼠，取大鼠双侧子宫。将大鼠子宫分别保存于RNA保存液和多聚甲醛中，用于后续实验。

取0/1/4/7/14/28天的大鼠子宫，并进行石蜡包埋切片，而后进行如下操作：

(1)石蜡切片脱蜡脱至水：将切片依次放入二甲苯I，二甲苯II，各浸泡10min。然后依次放入无水乙醇I、无水乙醇II、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇各5min，用蒸馏水冲洗2-3min。

(2)苏木素染细胞核：将切片放入苏木素染3-5min，用自来水冲洗2-3min，1％盐酸酒精分化3-5s，自来水冲洗2-3min。

(3)伊红染色：将切片放入伊红染色液中染色1-3min。

(4)脱水封片：将切片依次放入70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、无水乙醇II、无水乙醇I、二甲苯II、二甲苯I各5min，然后将切片拿出稍晾干，中性树脂封片。

(5)图像采集分析

染色后每张切片在100倍高倍镜下拍照，随机选取5个视野，用Image pro-plus图像处理软件测量子宫内膜厚度和计数腺体数目，取5个视野的平均值。

结果如图1所示，模型组由于慢性子宫内膜炎造成大鼠子宫内膜变薄，腺体数量减少。而治疗组在灌注重组III型人源化胶原蛋白之后，大鼠子宫内膜逐渐变厚，治疗14天后，趋于正常，而且腺体数量逐渐变多。

实施例2：重组III型人源化胶原蛋白促进细胞外基质重塑

建立大鼠实验模型，具体方法同实施例1。

取0/1/4/7/14/28天的大鼠子宫，并进行如下处理：

(1)总RNA提取

①组织称重，100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆机将组织在低温条件下研磨均匀，冰上静置3-5min。

②加入200μl氯仿，剧烈震荡15s，冰上静置3-5min。

③4℃13000rpm/min离心15min，将上清液吸入到新的离心管中，冰上静置10min。

④4℃13000rpm/min离心10min，可见白色沉淀，弃上清。

⑤加入1ml预冷75％乙醇，4℃7000rpm/min离心5min，弃上清。

⑥超净台风干5min，加入25μl无RNase水。

(2)逆转录cDNA

①测定提取的总RNA，测定浓度，然后配平至1μg/μl。

②配制RNA-primer Mix：

③低速离心机离心RNA-primer Mix，65℃10min，使其变性，冷却后放置于冰上。

④配制cDNA逆转录反应液：

⑤37℃孵育1h，85℃灭活5min。-20℃保存。

(3)PCR反应

①配制反应液：

②离心，设置PCR反应检测仪程序：

③上述反应结束后，分析溶解曲线：

一般认为，慢性子宫内膜炎会造成大鼠子宫细胞外基质(ECM)的增加，同时能够减缓其降解。而胚胎的着床受滋养层介导，在着床过程中具有侵蚀力的滋养层可遇到大量的细胞外基质，分泌中、晚期子宫内膜过量的细胞外基质表达阻止胚泡植入而导致不孕。

对组织中ECM成分的基因表达进行qPCR检测的结果如图2所示，经过重组III型人源化胶原蛋白治疗之后，ECM的成分在D1-D4之间出现增加的趋势，但是D7后逐渐减少，D28回复接近正常水平，说明重组III型人源化胶原蛋白参与了细胞外基质的动态调节过程。

TIMP1、MMP-2是细胞外基质相关因子。金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)是基质金属蛋白酶的组织抑制剂，是表达于组织中常见的一种糖蛋白。基质金属蛋白酶(MMPs)是一类降解细胞外基质的一类多肽家族。MMPs高表达能促进细胞迁移和增殖。TIMPs家族抑制MMPs家族功能，调节后者发挥正常的功能。两者共同维护细胞外基质稳态。图2结果显示MMP2在治疗组中含量明显增加，其大幅降低了细胞外基质。而作为MMP2的抑制剂，TIMP-1在治疗组中明显少于模型组。

实施例3：重组III型人源化胶原蛋白抑制炎症因子的生成

建立大鼠实验模型，具体方法同实施例1。

取0/1/4/7/14/28天的大鼠子宫，并进行如实施例2的处理。

对组织中免疫相关因子IL-1b、IL-6基因表达水平进行qPCR检测的结果如图3所示，发现在模型组中，两个免疫相关因子均出现了上升趋势，而治疗组相关因子的表达虽然也处于上升趋势，但是相比于对照组，明显低于对照组的相对表达量，并且在D7-D14时，便呈下降趋势。因此，可以说明，重组III型人源化胶原蛋白能够降低炎症免疫因子的表达，从而调节细胞免疫作用。

实施例4：重组III型人源化胶原蛋白改善大鼠子宫内膜容受性相关因子的表达

建立大鼠实验模型，具体方法同实施例1。

取0/1/4/7/14/28天的大鼠子宫并进行石蜡包埋切片，对其做如下处理：

(1)石蜡切片60度烘烤2h。

(2)将切片依次放入二甲苯I、二甲苯II，各浸泡20min。然后依次放入无水乙醇I、95％乙醇、85％乙醇各5min，用PBS冲洗3minx3次。

(3)将组织切片浸泡在枸橼酸钠缓冲液中，微波炉中高火加热至沸腾后，中火加热5minx3次，每次中间休息3min。然后拿出静置至室温。然后用PBS冲洗3minx3次。

(4)擦净组织周围水分，滴加100μL内源性过氧化物酶阻断剂遮盖组织，湿盒中孵育10min以充分灭活内源性过氧化物酶。然后用PBS冲洗3minx3次。

(5)擦净组织周围水分，滴加100μL封闭用正常山羊血清工作液覆盖组织，湿盒中孵育15min。

(6)将山羊血清工作液甩干，每个组织滴加100μL HOXA10抗体稀释液(稀释比例为1:300)。湿盒孵育4度过夜。

(7)将湿盒放置在37度复温30min。用PBS冲洗5minx3次。滴加100μL或适量的生物素标记山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，室温孵育15min。PBS缓冲液冲洗5min×3次。

(8)滴加100μL或适量的辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育15min。PBS缓冲液冲洗5min×3次。

(9)显色：加入适量新鲜配制的DAB，室温孵育3min。

(10)复染：自来水冲洗，苏木素染色液孵育1min。1％盐酸酒精分化2s、冲洗返蓝。

(11)组织切片60度烘烤1h。二甲苯I、二甲苯II，各浸泡20min。然后依次放入85％乙醇、95％乙醇、无水乙醇I各5min，二甲苯II、二甲苯I各10min，中性树脂封片。

(12)图像采集分析

染色后每张切片在200倍高倍镜下拍照，随机选取5个视野，用Image pro-plus图像处理软件测量并分析切片平均吸光度值。

HOXA10是同源框基因家族中重要的一员，在正常人的子宫内膜腺上皮、间质细胞中均有表达，起到编码转录因子、促进细胞分化和调控胚胎发育的作用。研究表明在子宫内膜癌、卵巢癌、子宫内膜异位症及其他妇科疾病患者内膜中均检测到HOXA10的异常表达。

HOXA10检测结果如图4所示，模型组中，大鼠子宫HOXA10表达降低，而治疗组HOXA10表现了上升的趋势，说明重组III型人源化胶原蛋白能够改善子宫内膜容受性，促进胚胎的种植。

实施例5：重组III型人源化胶原蛋白抑制CD138的表达

建立大鼠实验模型，具体方法同实施例1。

取0/1/4/7/14/28天的大鼠子宫并进行石蜡包埋切片，对其做同实施例4处理，其中步骤(6)抗体稀释液为CD138抗体稀释液(稀释比例为1:300)。

CD138阳性表达常用于诊断慢性子宫内膜炎。CD138免疫组化检测结果如图5所示，模型组的大鼠子宫内膜CD138表达增加，治疗组经重组III型人源化胶原蛋白治疗后大鼠子宫内膜CD138表达降低。

总结：在LPS构建的慢性子宫内膜炎大鼠模型中，重组III型人源化胶原蛋白能够减少内膜组织中CD138的表达，并促进造模后损伤的子宫内膜增厚和腺体的生成。同时，能够抑制炎症因子的生成，增加子宫内膜容受性。其作用可能与细胞外基质成分的重塑相关。

序列表

<110> 山西锦波生物医药股份有限公司

重庆医科大学附属第二医院

<120> 重组III型人源化胶原蛋白的用途

<130> 6C39-2163547I

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Phe Arg Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly

1 5 10 15

Ile Pro Gly Glu Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ala Pro

20 25 30