从甜茶苷生产的副产物中分离鞣花酸的酶法制备方法
阅读说明：本技术 从甜茶苷生产的副产物中分离鞣花酸的酶法制备方法 (Enzymatic preparation method for separating ellagic acid from byproducts of rubusoside production ) 是由 李伟 黄华学 于 2021-08-30 设计创作，主要内容包括：一种从甜茶苷生产的副产物中分离鞣花酸的酶法制备方法,包括以下步骤：甜茶上柱流出液的收集与浓缩、酶解、有机溶剂萃取、碱水反萃取、酸化、结晶。本发明方法所得的鞣花酸精品含量高达98.63%；本发明填补了现有技术的空白,提供了一种全新的、可将甜茶资源综合利用的、从甜茶苷生产的副产物中分离鞣花酸的酶法制备方法,变废为宝,工艺过程可操作性强,设备要求低,生产成本低,安全,环保,适宜于工业化生产。(An enzymatic preparation method for separating ellagic acid from a byproduct of rubusoside production comprises the following steps: collecting and concentrating the sweet tea column-loaded effluent, carrying out enzymolysis, extracting with an organic solvent, carrying out alkali water back extraction, acidifying, and crystallizing. The content of the ellagic acid fine product obtained by the method is as high as 98.63 percent; the invention fills the blank of the prior art, provides a brand-new enzyme method for preparing the ellagic acid by separating the byproducts of the rubusoside production, can comprehensively utilize the rubus suavissimus resources, changes waste into valuable, has strong operability of the process, low equipment requirement, low production cost, safety and environmental protection, and is suitable for industrial production.)
技术领域
本发明涉及一种从甜茶中分离鞣花酸的制备方法，具体涉及从甜茶苷生产的副产物中分离鞣花酸的制备方法。
背景技术
甜茶（学名Rubus Suavissimus S.Lee，英文名Sweet tea），又名甜叶悬钩子，是蔷薇科悬钩子属多年生有刺灌木，八十年代初才开始在我国作为药物发现。甜茶甘甜清爽，不仅能生津止渴，而且对人体有较好的药理作用和保健功能。据《中药志》记载及有关文献资料报道：“甜茶能防治高血压、治疗湿热痢疾、皮肤瘙痒、痈疽恶疮等症，并具有滋养肝肾和胃降逆、润肺止咳、解困醒酒等作用”。《本草纲目》记载：“气味甘、平”、“无毒、疗痔、止血及血痢、止渴、活血、利小便”。
甜茶叶在民间应用已久，常被用来代替蔗糖加工食品，作为民间入药用于补肾降压，被誉为神茶，与罗汉果等齐名。甜茶中富含的甜茶苷是一种二萜糖体，在化学结构上与甜菊苷近似，它们均由相同的苷元组成，二者的区别仅在甜茶苷中十位碳上少接一分子葡萄糖。甜茶苷的甜度为蔗糖的300倍，而热值仅是蔗糖的5%，属高甜度、低热能的天然甜味物质。甜茶苷能激活人的胰岛素，综合血糖，对糖尿病患者和肾虚病人都有很好的保健作用。甜茶叶提取的甜茶苷是甜味植物中口感最佳的，因其绿色天然，保健低热而在食品，饮料，冷食制品，调味品，医药工业，美容化妆品等各类行业中展现出良好的经济价值。
甜茶多酚同样是甜茶叶中重要的天然活性成分，具有抑菌、抗氧化、防辐射、抗过敏、防癌症等生物活性。产于广西的甜茶中，含有超过自身干重10%的甜茶多酚。在甜茶苷的实际工业化生产过程中，这些甜茶多酚都会伴随着甜茶苷一起被水浸出。只是这些甜茶多酚不会被大孔吸附树脂富集，而甜茶苷会被大孔吸附树脂富集。由于技术的局限以及甜茶多酚本身苦涩的口感，这些含有大量甜茶多酚的大孔吸附树脂上柱流出液只能当成废弃物，进入污水池进行环保处理。如此不但增加了污水处理的负担，而且是对天然活性成分甜茶多酚的浪费，没有实现甜茶自然资源的综合利用。
鞣花酸别名并没食子酸（benzoaric acid），化学式为C14H6O8，是一种多酚二内酯化合物，是两分子没食子酸通过聚合而形成的衍生物。鞣花酸广泛存在于各种水果、蔬菜、坚果等植物组织中，是一种天然多酚组分。鞣花酸具有多种生物活性功能，例如抗氧化功能、抗癌、抗突变性能、对人体免疫缺陷病毒的抑制作用。除此之外，鞣花酸还是一种有效的凝血剂，对多种细菌、病毒都有很好地抑制作用，能保护创面免受细菌的侵入、防止感染、抑制溃疡。经研究发现，鞣花酸还具有降压、镇静作用。鞣花酸表现出对化学物质诱导癌变及其他多种癌变有明显的抑制作用，特别是对结肠癌、食管癌、肝癌、肺癌、舌及皮肤肿瘤等有很好的抑制作用。
在自然界中，鞣花酸不仅能以游离的形式存在，而且更多的是以缩合形式（如鞣花单宁、鞣花苷等）存在。甜茶多酚是一种混合物，主要成分是鞣花单宁。如何将目前当作废弃物处理的甜茶多酚回收利用，加工成更具有经济价值的鞣花酸，该技术问题亟需解决。
CN201910378261.X公开了高含量甜茶苷、甜茶多酚的环保生产方法，是以干燥的甜茶叶为原料，经粉碎、渗漉提取、絮凝、离心、脱盐、脱色、大孔树脂吸附、梯度洗脱、絮凝物酸化、有机溶剂萃取等步骤，分别得到高含量的甜茶苷和甜茶多酚。
CN201810421242.6公开了一种从提取甜茶苷后的甜茶絮凝渣中回收甜茶多酚的方法，是以提取甜茶苷后的甜茶絮凝渣为原料，经酸溶、大孔吸附树脂富集、氧化铝精制等步骤，得到甜茶多酚。
CN201810688181.X公开了从甜茶中提取茶氨酸以及同时提取甜茶苷和茶多酚的方法，是以甜茶叶为原料，经破碎、渗漉、大孔吸附树脂吸附、聚酰胺树脂柱吸附、离子交换树脂柱吸附等步骤，得到茶氨酸、甜茶苷和茶多酚。
CN201010570285.4公开了悬钩子中鞣花单宁酸的分离纯化方法，是以悬钩子干叶为原料，经水提取、大孔吸附树脂柱层析、流出母液超滤膜分离、干燥、超临界二氧化碳萃取、得到鞣花单宁酸。
现有技术中，关于甜茶多酚的研究主要是针对甜茶总多酚（混合物）或者鞣花单宁酸的分离，很少有从甜茶原料或从甜茶副产物中分离鞣花酸的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种可将甜茶资源综合利用，产品纯度高，设备要求低，生产成本低，适宜于工业化生产的从甜茶苷生产的副产物中分离鞣花酸的酶法制备方法。
从甜茶苷生产的副产物中分离鞣花酸的酶法制备方法，包括以下步骤：
（1）甜茶上柱流出液的收集与浓缩：收集甜茶苷生产过程中大孔吸附树脂柱的上柱流出液，用纳滤膜过滤和浓缩，得甜茶多酚浓缩液；
（2）酶解：将所述甜茶多酚浓缩液用醋酸调节为酸性，加入单宁酶，搅拌，保温酶解；
（3）有机溶剂萃取：将酶解后的物料用有机溶剂萃取，分液，收集有机溶剂层；
（4）碱水反萃取：将收集到的有机溶剂层用碱水溶液反萃取，分液，收集碱水层；
（5）酸化：将收集到的碱水层用盐酸调节为酸性，此时析出大量固体，收集析出的固体，干燥，得鞣花酸粗品；
（6）结晶：将所述鞣花酸粗品在乙醇中加热溶解，加入脱色剂，保温搅拌脱色，趁热过滤，滤液冷却析晶，分离出晶体，干燥，得鞣花酸精品。
优选地，步骤（1）中，所述上柱流出液为甜茶叶原料经过包括“水提取、离心过滤、大孔吸附树脂上柱吸附”在内的处理后，产生的工业废水；所述上柱流出液中，总固形物的质量百分比含量为0.5%～10%，甜茶多酚在总固形物中的质量百分比含量为30%～50%，鞣花单宁在总固形物中的质量百分比含量为15%～30%。
优选地，步骤（1）中，所述纳滤膜的截留分子量为200～500Da，纳滤膜过滤和浓缩时的工作压力为0.2Mpa～0.5Mpa。使用纳滤膜的目的之一，是除去上柱流出液之中的无机盐，因为钙、镁、铁、铜等二价金属阳离子不但会降低单宁酶的活性，还会与酶解的产物鞣花酸络合、形成性质稳定的络合物，从而降低鞣花酸的收率。使用纳滤膜的目的之二，是除去氨基酸、色素等小分子杂质，以提高鞣花单宁的纯度，从而降低后续分离纯化步骤的难度。若纳滤膜的截留分子量过小或过滤的压力过小，无机盐和小分子杂质都将无法透过纳滤膜而除去，从而都会导致无法达到上述两个目的；若纳滤膜的截留分子量过大或过滤的压力过大，部分鞣花单宁有可能透过纳滤膜而损失，从而导致鞣花酸的收率偏低。使用纳滤膜的目的之三，是采用低温、节能的方式将物料浓缩，既可以避免鞣花单宁在高温下氧化、与杂质缩合，又可以提高鞣花单宁（酶解底物）的浓度、提高酶解的速度。
优选地，步骤（1）中，所述甜茶多酚浓缩液的固形物浓度为10%～20%。将纳滤膜截留液膜浓缩至该浓度的目的，是提高鞣花单宁（酶解底物）的浓度，以减少后续物料的处理量，同时节约单宁酶的用量。若浓缩液的固形物浓度过低，将导致酶的用量增加或酶解时间的延长；若浓缩液的固形物浓度过高，将导致鞣花单宁的溶解性降低，反而不利于酶解的进行。
优选地，步骤（2）中，用醋酸将所述甜茶多酚浓缩液的pH值调节为5.0～6.0。本步骤采用醋酸调节pH值5.0～6.0，目的之一是醋酸可以提高单宁酶的活性，目的之二是在该pH范围内单宁酶的催化能力最强。
优选地，步骤（2）中，所用单宁酶的重量为鞣花单宁重量的0.5%～5%。本发明使用单宁酶的目的，是将鞣花单宁酶解为鞣花酸。
优选地，步骤（2）中，酶解的温度为30～40℃。
优选地，步骤（2）中，酶解时的搅拌速度为60～120 r/min。搅拌的目的是使酶与底物充分接触，提高酶解的速度，确保酶解的效果。若酶解的搅拌速度过慢，将无法充分的达到上述目的；若酶解的搅拌速度过快，搅拌器产生过大的剪切力将破坏酶的空间结构，导致酶活力下降。
优选地，步骤（2）中，酶解的时间为6～12小时。
优选地，步骤（3）中，所述的有机溶剂为乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷、三氯甲烷中的一种或两种以上；每1 kg鞣花酸使用70～200 L有机溶剂；更优选每1 kg鞣花酸使用80～150 L有机溶剂。使用有机溶剂萃取的目的，是将酶解后得到的鞣花酸从水相转移至有机相，达到初步分离纯化的目的。
优选地，步骤（4）中，所述的碱水溶液为氢氧化钠或氢氧化钾的水溶液，质量百分比浓度为0.5%～2%；所用碱水溶液的体积为有机溶剂体积的20%～30%。使用碱水反萃取的目的，是将有机层中的鞣花酸与碱反应成盐，并溶于碱水，达到再次分离纯化的目的。若碱水溶液的质量百分比过低或碱水的用量过少，都将无法充分的达到上述目的，造成鞣花酸的收率偏低；若碱水溶液的质量百分比过高或碱水的用量过多，不但会造成能源和物料的浪费，还有可能造成鞣花酸分解破坏，同样造成鞣花酸的收率偏低。
优选地，步骤（5）中，用盐酸将收集到的碱水层的pH值调节为1.5～2.5。本步骤将碱水层用盐酸调节pH值至酸性的目的，是将溶解于碱水层中、呈离子状态的鞣花酸盐，转化为分子状态的鞣花酸，从而结晶析出。
优选地，步骤（6）中，所述乙醇的体积分数为80%～99%；每1kg鞣花酸粗品使用8～12L乙醇。
优选地，步骤（6）中，所述脱色剂为活性炭、活性白土、硅藻土、氧化铝中的一种或两种以上；所用脱色剂的重量为鞣花酸粗品重量的1%～5%；保温搅拌脱色的温度为70～80℃；保温搅拌脱色的时间为1～3小时。使用脱色剂搅拌脱色的目的，是除去鞣花酸粗品乙醇溶液中的色素和杂质，从而得到高含量的鞣花酸精品。
优选地，步骤（6）中，所述冷却析晶的温度为-10～10℃；所述冷却析晶的时间为12～24小时。冷却析晶的目的，是将乙醇溶液中的鞣花酸充分析出，确保鞣花酸的收率。
甜茶苷生产过程中大孔吸附树脂柱的上柱流出液富含鞣花单宁，鞣花单宁在单宁酶的作用下被酶解为鞣花酸。酶解液中的其它不能被单宁酶酶解的甜茶多酚，不会被有机溶剂萃取，而鞣花酸可被有机溶剂萃取，因此可以通过有机溶剂萃取的方式将鞣花酸初步分离纯化。即使有少量脂溶性的杂质同鞣花酸一起被有机溶剂萃取出，但是通过碱水反萃取，可将这些脂溶性杂质保留在有机溶剂层中。碱水层中的鞣花酸盐，通过酸化即可恢复为分子状态从而沉淀析出。
本发明方法的有益效果如下：
（1）本发明方法所得的鞣花酸精品含量高达98.63%。
（2）本发明填补了现有技术的空白，提供了一种全新的、可将甜茶资源综合利用的、从甜茶苷生产的副产物中分离鞣花酸的酶法制备方法，变废为宝，工艺过程可操作性强，设备要求低，生产成本低，安全，环保，适宜于工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
本发明实施例所使用的甜茶苷生产过程中大孔吸附树脂柱的上柱流出液购于湖南华诚生物资源股份有限公司，为甜茶叶原料经过水提取、离心过滤、大孔吸附树脂上柱吸附处理后产生的工业废水，其中，总固形物、甜茶多酚、鞣花单宁（以栗木鞣花素castalagin和栎木鞣花素vescalagin计，分子式均为C41H26O26）和鞣花酸（分子式C14H6O8）的质量百分比含量依次为2.05%、0.72%、0.43%和0；本发明实施例所使用的单宁酶购于南宁东恒华道生物科技有限责任公司，单宁酶的规格为250u/g；本发明实施例所使用的原料或化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
本发明实施例中，采用紫外分光光度法测点甜茶多酚的含量，采用高效液相色谱（HPLC）外标法检测鞣花酸的含量。
实施例1
（1）甜茶上柱流出液的收集与浓缩：收集甜茶苷生产过程中大孔吸附树脂柱的上柱流出液1吨，用纳滤膜过滤（纳滤膜的截留分子量500Da、过滤压力0.2Mpa），并用纳滤膜将纳滤膜截留液浓缩至固形物浓度为13.3%，得甜茶多酚浓缩液112L；
（2）酶解：将甜茶多酚浓缩液用醋酸调节pH值至5.5，加入0.1kg单宁酶（甜茶多酚浓缩液中约含鞣花单宁4.3kg，所用单宁酶的重量为鞣花单宁重量的2.33%），以60 r/min的速度搅拌，37℃保温，酶解8小时；
（3）有机溶剂萃取：将酶解后的物料用120L乙酸乙酯萃取（酶解后的物料中约含鞣花酸1.39kg，每1 kg鞣花酸使用86.33L乙酸乙酯），分液，收集有机溶剂层；
（4）碱水反萃取：将收集到的有机溶剂层用30L质量百分比浓度为2%的氢氧化钠水溶液反萃取，分液，收集碱水层；
（5）酸化：将收集到的碱水层用盐酸调节pH值至2.5，此时析出大量固体，过滤，将滤饼置于80℃鼓风干燥箱，干燥至恒重，得鞣花酸粗品1.45kg；
（6）结晶：将鞣花酸粗品在12L体积分数为85%的乙醇中加热溶解，加入0.05kg活性炭，在80℃下，搅拌3小时进行脱色，趁热过滤，将滤液冷却至0℃，析晶18小时，通过过滤将晶体分离出来，干燥，得鞣花酸精品1.18kg。
经高效液相色谱外标法检测，本发明实施例所得鞣花酸粗品中鞣花酸的含量为90.11%，本发明实施例所得鞣花酸精品中鞣花酸的含量为98.31%。
实施例2
（1）甜茶上柱流出液的收集与浓缩：收集甜茶苷生产过程中大孔吸附树脂柱的上柱流出液1吨，用纳滤膜过滤（纳滤膜的截留分子量200Da、过滤压力0.4Mpa），并用纳滤膜将纳滤膜截留液浓缩至固形物浓度为15.2%，得甜茶多酚浓缩液101L；
（2）酶解：将甜茶多酚浓缩液用醋酸调节pH值至5.8，加入0.08kg单宁酶（甜茶多酚浓缩液中约含鞣花单宁4.3kg，所用单宁酶的重量为鞣花单宁重量的1.86%），以90 r/min的速度搅拌，35℃保温，酶解10小时；
（3）有机溶剂萃取：将酶解后的物料用150L二氯甲烷萃取（酶解后的物料中约含鞣花酸1.39kg，每1 kg鞣花酸使用107.91L二氯甲烷），分液，收集有机溶剂层；
（4）碱水反萃取：将收集到的有机溶剂层用42L质量百分比浓度为1.5%的氢氧化钾水溶液反萃取，分液，收集碱水层；
（5）酸化：将收集到的碱水层用盐酸调节pH值至2.0，此时析出大量固体，过滤，将滤饼置于80℃鼓风干燥箱，干燥至恒重，得鞣花酸粗品1.48kg；
（6）结晶：将鞣花酸粗品在13.5L体积分数为95%的乙醇中加热溶解，加入0.04kg硅藻土，在75℃下，搅拌3小时进行脱色，趁热过滤，将滤液冷却至-2℃，析晶16小时，通过过滤将晶体分离出来，将晶体过滤，干燥，得鞣花酸精品1.23kg。
经高效液相色谱外标法检测，本发明实施例所得鞣花酸粗品中鞣花酸的含量为89.25%，本发明实施例所得鞣花酸精品中鞣花酸的含量为97.56%。
实施例3
（1）甜茶上柱流出液的收集与浓缩：收集甜茶苷生产过程中大孔吸附树脂柱的上柱流出液1吨，用纳滤膜过滤（纳滤膜的截留分子量300Da、过滤压力0.3Mpa），并用纳滤膜将纳滤膜截留液浓缩至固形物浓度为12.9%，得甜茶多酚浓缩液115L；
（2）酶解：将甜茶多酚浓缩液用醋酸调节pH值至6.0，加入0.06kg单宁酶（甜茶多酚浓缩液中约含鞣花单宁4.3kg，所用单宁酶的重量为鞣花单宁重量的1.40%），以120 r/min的速度搅拌，32℃保温，酶解12小时；
（3）有机溶剂萃取：将酶解后的物料用180L三氯甲烷萃取（酶解后的物料中约含鞣花酸1.39kg，每1 kg鞣花酸使用129.50L三氯甲烷），分液，收集有机溶剂层；
（4）碱水反萃取：将收集到的有机溶剂层用54L质量百分比浓度为1.2%的氢氧化钠水溶液反萃取，分液，收集碱水层；
（5）酸化：将收集到的碱水层用盐酸调节pH值至1.5，此时析出大量固体，过滤，将滤饼置于80℃鼓风干燥箱，干燥至恒重，得鞣花酸粗品1.46kg；
（6）结晶：将鞣花酸粗品在14.5L体积分数为90%的乙醇中加热溶解，加入0.03kg氧化铝，在80℃下，搅拌2小时进行脱色，趁热过滤，将滤液冷却至5℃，析晶24小时，通过过滤将晶体分离出来，干燥，得鞣花酸精品1.17kg。
经高效液相色谱外标法检测，本发明实施例所得鞣花酸粗品中鞣花酸的含量为88.60%，本发明实施例所得鞣花酸精品中鞣花酸的含量为98.63%。
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