地胆草中吉玛烷型倍半萜内酯类化合物及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 地胆草中吉玛烷型倍半萜内酯类化合物及其制备方法和应用 (Gilmaxane type sesquiterpene lactone compound in elephantopus scaber and preparation method and application thereof ) 是由 宋少江 黄肖霄 白明 徐伟 于 2021-10-19 设计创作，主要内容包括：地胆草中吉玛烷型倍半萜内酯类化合物及其制备方法和应用,属于医药技术领域,涉及从菊科地胆草属植物地胆草(Elephantopus scaber L.)中提取分离的六个新吉玛烷型倍半萜内酯类化合物scaberxone A,scaberxone B,scaberxone C,scaberxone D,scaberxone E,scaberxone F。上述6种化合物均具有相同的吉玛烷型倍半萜内酯母核。本发明还提供所述6种新化合物的制备方法和在制备抗炎药物方面的应用。本发明制备方法简单易行,重现性比较好,纯度较高。(A germarine type sesquiterpene lactone compound in Elephantopus scaber, a preparation method and an application thereof belong to the technical field of medicines, and relate to six novel germarine type sesquiterpene lactone compounds, namely scaberxone A, scaberxone B, scaberxone C, scaberxone D, scaberxone E and scaberxone F, which are extracted and separated from Elephantopus scaber L (Elephantopus scaber L.) of Elephantopus in the compositae. The 6 compounds all have the same parent nucleus of the germacrane type sesquiterpene lactone. The invention also providesProvides a preparation method of the 6 new compounds and application in preparing anti-inflammatory drugs. The preparation method is simple and feasible, and has good reproducibility and high purity.)
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及植物地胆草中的新吉玛烷型倍半萜内酯及其制备方法和这类化合物在制备抗炎药物方面的应用。
背景技术
地胆草：地胆草(Elephantopus scaber L.)又名苦地胆，为菊科地胆草属植物，广泛分布于美洲、亚洲、非洲各热带地区；在中国分布于浙江、江西、福建、贵州及云南等省区。地胆草属约有30余种，我国仅有两种，即地胆草和白花地胆草。地胆草主要以根部入药，味苦、性寒，具有清热、凉血、解毒、利湿的功效，用于治疗感冒、扁桃体炎、眼结膜炎、黄疽等。另外，地胆草亦作为煲汤食材广泛使用。近年来从地胆草中已分离得到多种化学成分，如倍半萜内酯类、黄酮类、三萜类、木脂素、芳香类化合物等。
炎症是高等动物对损伤性刺激的一种防御反应，然而过度炎症反应会导致多种组织、器官的严重损害，慢性疾病如哮喘、癌症、心血管疾病以及神经退行性疾病等其他相关疾病都属于炎症性疾病范畴，这些疾病正在全球范围蔓延并且已演变成严重危害人类健康和社会经济可持续发展的重要公共卫生问题。因此，来自植物的天然抗炎化合物吸引了众多研究人员的注意，成为近年来备受关注的重要研究领域。
发明内容
本发明提供了六种从菊科地胆草属植物地胆草(Elephantopus scaber L.)中分离得到的新吉玛烷型倍半萜内酯：
本发明的利用地胆草制备新吉玛烷型倍半萜内酯类化合物的方法，包括如下步骤：
(1)取干燥的地胆草全草以70-80％乙醇提取，合并提取液浓缩得浸膏，浸膏采用正丁醇萃取，并将所得组分经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统50:1-1:2进行等度梯度洗脱，共收集到5个馏分(I-V)。
(2)馏分I经HP20柱色谱，以乙醇-水系统进行梯度洗脱，得3个馏分A1、A2、A3。
(3)所得馏分A2经开放式ODS柱色谱上用乙醇-水系统进行洗脱，得到4个馏分Fr.1-Fr.4。
(4)Fr.2经硅胶柱色谱以二氯甲烷-甲醇系统50:1-0:1洗脱，在TLC分析的基础上得到5个亚馏分Fr.21-Fr.25。
(5)在制备型反相高效液相色谱上使用甲醇-水的流动相来分离Fr.23得到馏分Fr.231-Fr.236。
(6)在半制备型反相高效液相色谱上使用乙腈-水的流动相来分离Fr.233得到化合物1-6。
上述利用地胆草制备新吉玛烷型倍半萜内酯类化合物的方法，其中：
步骤(1)中，所述的乙醇浓度为70-80％，所述提取为乙醇回流提取，提取3-4次，每次2-3小时。使用地胆草为菊科地胆草属植物地胆草(Elephantopus scaberL.)。
步骤(2)中，所述乙醇-水系统为10-50％的乙醇-水系统。
步骤(3)中，所述乙醇-水系统为20-60％的乙醇-水系统。
步骤(5)中，所述甲醇-水的流动相中甲醇含量为33％。
步骤(6)中，所述乙腈-水的流动相中乙腈含量为15-35％。
所得化合物1-6经过系统结构鉴定结果如下：
利用高分辨质谱、NMR、计算ECD、X-单晶衍射对化合物1-6进行结构鉴定，相应谱图见附图1-30。
Scaberxone A(1):白色无定形粉末；-70.0(c 0.1,MeOH)；HR-ESI-MS给出其准分子离子峰为[M+H]+295.1178(cal.C15H17O6,295.1176)，结合氢谱碳谱确定分子式为C15H18O6，其不饱和度为7。化合物1的1H-NMR(600MHz in DMSO-d6)谱数据显示：δH 7.48(1H,s)和4.74(1H,dt,J＝10.0,1.5Hz)为吉玛烷型倍半萜内酯类化合物1,5位的特征烯烃质子信号，此外还存在一个甲基信号δH1.56(3H,d,J＝1.5Hz)，三个连氧质子信号[(δH 5.42,1H,dt,J＝4.7,1.7Hz；4.27,1H,td,J＝10.0,4.8Hz；3.81,1H,m)]，一对连氧亚甲基质子信号[δH3.79(1H,dd,J＝6.4,3.0Hz),3.51(1H,ddd,J＝9.8,4.8,3.0Hz)]，一个次甲基质子信号δH2.39(1H,m)，两对亚甲基质子信号δH 2.62(1H,dt,J＝14.5,1.7Hz)；2.23(1H,dd,J＝14.5,4.7Hz)和2.79(1H,m)；2.46(1H,t,J＝11.6Hz)。此外，氢谱中还存在两个羟基信号δH5.00(1H,d,J＝4.8Hz)和4.92(1H,t,J＝4.8Hz)。13C-NMR(150MHz in DMSO-d6)谱，显示15个碳信号，包括两个内酯羰基碳信号(δC 177.1,174.0)，四个烯烃碳信号(δC 150.4,130.4,130.0,129.3)，四个含氧碳信号(δC80.9,79.5,70.5,60.5)，两个亚甲基信号(δC39.4,29.8)，两个次甲基信号(δC 48.4,48.0)和一个甲基信号(δC 21.0)。在HMBC谱中，通过H-1与C-2，C-3，C-9，C-10，C-15的相关，H-5与C-3，C-7，C-14的相关，H-8与C-6，C-12的相关，H-7与C-9的相关，确定了化合物1具有Δ7(8)-吉玛烷型倍半萜内酯的结构；通过1H-1H COSY谱对该骨架也进行了确证[H-5/H-6/H-7(H-11/H-13)/H-8/H-9]。H-13与C-11的HMBC相关，证明羟甲基连接在11位。化合物1的相对构型由NOESY谱确定，H-1/H-14，H-6/H-8，H-6/H-11，H-8/H-14之间的NOE相关，确定了H-2，H-6，H-8，H-11为β构型，而H-5和H-7之间的NOE相关，确定H-7为α构型。通过从甲醇中获得化合物1的晶体，用单晶X射线衍射方法，确定1的绝对构型。此外，实验和计算的ECD数据也支持1的2S,6R,7S,8S,11S构型。
综上所述，最终确定了该化合物结构，为scaberxone A(1)。
化合物1的1H(600MHz)与13C(150MHz)NMR数据(DMSO-d6)
ScaberxoneB(2):白色无定型粉末；-13.0(c 0.12,MeOH)；HR-ESI-MS给出其准分子离子峰为311.1123[M+H]+(cal.C15H19O7,311.1125)，结合氢谱碳谱确定分子式为C15H18O7，不饱和度为7。化合物2的核磁数据与1非常相近，氢谱中存在两个羟基信号，仔细分析碳谱发现，2中存在一个连氧的季碳，结合11-OH与C-7,C-11,C-12,C-13；13-OH与C-11,C-13的HMBC相关确定了在化合物2中分别在C-11，C-13处连有羟基。因此，化合物2与1的主要区别在于2中在C-11处多连一个羟基。化合物2的相对构型由NOESY谱确定，H-1/H-14,H-6/H-8,H-6/H-14,H-6/H-13之间的NOESY相关，确定了H-2,H-6,H-8,H-13为β构型，而H-5和H-7之间的NOE相关，确定H-7为α构型。通过从甲醇中获得了化合物2的晶体，用单晶X射线衍射方法，进一步验证了2的平面结构和相对构型，由于晶体质量不佳，最后通过计算ECD确定化合物2的绝对构型，实验和计算的ECD数据支持2的绝对构型为2S,6R,7S,8S,11S。
综上所述，最终确定了该化合物结构，为scaberxoneB(2)。
化合物2的1H(600MHz)与13C(150MHz)NMR数据(DMSO-d6)
Scaberxone C(3):白色无定型粉末；-28.6(c 0.12,MeOH)；HR-ESI-MS给出其准分子离子峰为279.1229[M+H]+(cal.C15H19O5,279.1227)，结合氢谱碳谱确定分子式为C15H19O5，不饱和度为7。通过比较质谱与核磁数据，发现化合物3与1的结构高度相似，3中观察到在C-11位连接的是甲基而非羟甲基，通过δH1.49(H-13)与δC 38.5(C-11)的HMBC相关得到证实。相对构型通过NOESY谱进行确定，H-1/H-5，H-5/H-7和H-6/H-13的关键相关峰表明，H-5，H-7和H-11共面，暂定为α-取向；H-6/H-8，H-6/H-14之间的NOESY相关性证实了H-2，H-6和H-8是β-取向。通过实验和计算得到的ECD谱的比较，确定了3的绝对构型为2S,6R,7S,8S,11S。
综上所述，最终确定了该化合物结构，为scaberxone C(3)。
化合物3的1H(600MHz)与13C(150MHz)NMR数据(CDCl3)
Scaberxone D(4):白色无定型粉末；-28.8(c 0.12,MeOH)；HR-ESI-MS给出其准分子离峰为279.1228[M+H]+(cal.C15H19O5,279.1227)，通过1D NMR光谱数据的比较，结合HSQC和HMBC数据的分析，表明4与3除了C-1周围的NMR数据略有不同外，其余几乎相同。因此，确定4为3的C-2差向异构体。通过NOESY实验进行了进一步的证实，其中H-1和H-5的相关性表明H-2是α取向的。实验和计算的ECD曲线的比较分析显示4的绝对构型为2R,6R,7S,8S,11S。
综上所述，最终确定了该化合物结构，为scaberxoneD(4)。
化合物4的1H(600MHz)与13C(150MHz)NMR数据(DMSO-d6)
ScaberxoneE(5):白色无定型粉末；-22.6(c 0.12,MeOH)；HR-ESI-MS给出其准分子离子峰为463.1572[M+Na]+(cal.C21H28O10Na,463.1575)。5和4的核磁共振数据的比较表明这两种化合物之间的主要区别为：在化合物5中为Δ6(7)-吉玛烷型倍半萜内酯的结构而不是Δ7(8)-吉玛烷型倍半萜内酯以及5中存在一个额外的葡萄糖。借助HSQC实验，观察到葡萄糖部分信号[δH 4.44(1H,d,J＝7.9Hz),3.68(1H,ddd,J＝11.9,6.0,2.2Hz),3.46(1H,dd,J＝11.9,4.2Hz),3.17(1H,m),3.15(1H,d,J＝8.8Hz),3.05(1H,dd,J＝8.8,3.0Hz),3.02(1H,dt,J＝7.9,4.2Hz)]和(δC 103.9,77.1,76.9,73.7,70.1,61.1)。H-1'/C-8和C-1'/H-8的HMBC的相关表明糖部分连接在C-8位置上。NOESY相关性表明C-2，C-6，C-8和C-11的相对构型与1相同，而糖部分的β-构型是由于端基质子信号的偶合常数δH 4.44(1H,d,J＝7.9Hz,H-1′)确定的。酸水解后，HPLC分析显示为D-葡萄糖。对5进行ECD计算以确定绝对构型。结果表明(2S,6R,7S,8S,11S)-5的计算结果与实验一致。最后，进一步通过X单晶射线衍射实验验证了5的完整结构和绝对构型。
综上所述，最终确定了该化合物结构，为scaberxoneE(5)。
化合物5的1H(600MHz)与13C(150MHz)NMR数据(DMSO-d6)
ScaberxoneF(6):白色无定型粉末；-69.4(c 0.12,MeOH)；HR-ESI-MS给出其准分子离子峰为441.1761[M+H]+(cal.C21H29O10,441.1755)。化合物6的1H和13C-NMR光谱显示出典型的吉马烷型倍半萜内酯以及与化合物5结构相同的葡萄糖基部分的信号。唯一不同的是倍半萜苷元的相对构型，其结构如下所述，从H-1/H-5和H-1/H-7的NOESY交叉峰推断H-2的β-取向，因此确定化合物6的结构为5的C-2差向异构体。通过计算ECD确定6的绝对构型为2R,6R,7S,8S,11S。
综上所述，最终确定了该化合物结构，为scaberxoneF(6)。
化合物6的1H(600MHz)与13C(150MHz)NMR数据(DMSO-d6)
对发明中所述的六个化合物的抗炎活性进行了考察，六个化合物均显示出了一定的抗炎活性。其中化合物6效果最突出。因此本发明所述的吉玛烷型倍半萜内酯类化合物具有进一步开发抗炎药物的前景。
本发明的优点在于，所述化合物均为新化合物，结构新颖，且均为立体构型确定的光学纯化合物，同时具有抗炎活性，这些发现不仅丰富了吉马烷型倍半萜内酯的结构多样性，而且为开发新药提供了线索，具有进一步开发的价值。
附图说明
图1化合物1的1H-NMR谱(600MHz,DMSO-d6)；
图2化合物1的13C-NMR谱(150MHz,DMSO-d6)；
图3化合物1的HSQC谱(600MHz,DMSO-d6)；
图4化合物1的HMBC谱(600MHz,DMSO-d6)；
图5化合物1的NOESY谱(600MHz,DMSO-d6)；
图6化合物2的1H-NMR谱(600MHz,DMSO-d6)；
图7化合物2的13C-NMR谱(150MHz,DMSO-d6)；
图8化合物2的HSQC谱(600MHz,DMSO-d6)；
图9化合物2的HMBC谱(600MHz,DMSO-d6)；
图10化合物2的NOESY谱(600MHz,DMSO-d6)；
图11化合物3的1H-NMR谱(600MHz,CDCl3)；
图12化合物3的13C-NMR谱(150MHz,CDCl3)；
图13化合物3的HSQC谱(600MHz,CDCl3)；
图14化合物3的HMBC谱(600MHz,CDCl3)；
图15化合物3的NOESY谱(600MHz,CDCl3)；
图16化合物4的1H-NMR谱(600MHz,DMSO-d6)；
图17化合物4的13C-NMR谱(150MHz,DMSO-d6)；
图18化合物4的HSQC谱(600MHz,DMSO-d6)；
图19化合物4的HMBC谱(600MHz,DMSO-d6)；
图20化合物4的NOESY谱(600MHz,DMSO-d6)；
图21化合物5的1H-NMR谱(600MHz,DMSO-d6)；
图22化合物5的13C-NMR谱(150MHz,DMSO-d6)；
图23化合物5的HSQC谱(600MHz,DMSO-d6)；
图24化合物5的HMBC谱(600MHz,DMSO-d6)；
图25化合物5的NOESY谱(600MHz,DMSO-d6)；
图26化合物6的1H-NMR谱(600MHz,DMSO-d6)；
图27化合物6的13C-NMR谱(150MHz,DMSO-d6)；
图28化合物6的HSQC谱(600MHz,DMSO-d6)；
图29化合物6的HMBC谱(600MHz,DMSO-d6)；
图30化合物6的NOESY谱(600MHz,DMSO-d6)；
图31化合物1-6抑制LPS诱导BV-2小胶质细胞产生NO的能力。
具体实施方式
下面所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1：
地胆草中吉玛烷型倍半萜内酯类化合物1-6的制备方法，具体步骤如下：
(1)取干燥的菊科地胆草属植物地胆草全草以70-80％工业乙醇回流提取3-4次，每次2-3小时。合并提取液浓缩得浸膏，浸膏采用正丁醇萃取并将所得组分经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统50:0-1:2(50:1,30:1,20:1,10:1,5:1,3:1,1:1,1:2,v/v)进行等度梯度洗脱，共收集到5个馏分(I-V)。
(2)馏分I经HP20柱色谱，以10％、30％、50％的乙醇(乙醇-水系统)依次进行梯度洗脱，得3个馏分A1、A2、A3。
(3)所得馏分A2经开放式ODS柱色谱上用20％、40％、50％、60％的乙醇(乙醇-水系统)依次进行洗脱，得到4个馏分Fr.1-Fr.4。
(4)Fr.2经硅胶柱色谱以二氯甲烷-甲醇系统50:1-0:1(50:1,30:1,20:1,10:1,5:1,3:1,1:1,0:1,v/v)洗脱，在TLC分析的基础上得到5个亚馏分Fr.21-Fr.25。
(5)在制备性反相高效液相色谱上使用甲醇-水(甲醇33％,v/v)的流动相来分离Fr.23得到了Fr.231-Fr.236。
(6)在半制备性反相高效液相色谱上使用乙腈-水(乙腈15-35％,v/v)的流动相来分离Fr.233得到了化合物1-6。
实施例2：
地胆草中吉玛烷型倍半萜内酯类化合物1-6的抗炎的活性考察。
细胞毒性试验/细胞活力试验：
将BV-2细胞接种在96孔板中，并与化合物1-6一起培养24小时。完全去除培养基后，向每个孔内添加四唑蓝(MTT)，然后在37℃的培养箱中再培养2-4小时。小心地去除MTT溶液，并添加DMSO在室温条件下适当振荡，使形成的结晶充分溶解。最后，使用酶标仪在490nm处读取吸光度。
抑制NO生成的生物测定：
将BV-2细胞接种到96孔板中，并在存在与不存在样品的情况下用LPS分别处理24小时。通过Griess反应对上清液中的NO生成进行定量。用酶标仪在490nm处读取吸光度。使用Graphpad prism 7软件进行分析，以此评估在BV-2小胶质细胞中化合物1-6抑制LPS诱导的NO产生的能力。以地塞米松作为阳性对照。具体结果如图31所示。所述的6个化合物均具备抑制LPS诱导BV-2小胶质细胞产生NO的能力，其中化合物6效果最突出。