超声辅助深共熔溶剂提取蓝布正中鞣花酸的方法
阅读说明：本技术 超声辅助深共熔溶剂提取蓝布正中鞣花酸的方法 (Method for extracting ellagic acid from blue brave by using ultrasonic-assisted deep eutectic solvent ) 是由 乐世俊 杨钊 唐于平 徐顶巧 于 2021-09-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种超声辅助深共熔溶剂提取蓝布正中鞣花酸的方法,本发明采用超声辅助深共熔溶剂提取蓝布正中鞣花酸,本发明将蓝布正鞣花酸得率作为指标,研究以下五个因素：蓝布正含水率(A)、提取时间(B)、料液比(C)、提取温度(D)和提取功率(E)对蓝布正鞣花酸得率的影响,用响应面设计法得出的实验方案进行实验,以获得蓝布正鞣花酸得率的最优提取条件参数。实验结果表明采用最佳的提取工艺,即蓝布正含水率为47%,按质量体积比10:1加入深共熔溶剂,在70℃,提取功率为300 W进行超声提取31min。该方法稳定可靠,提取效率高,可用于蓝布正中鞣花酸的提取。(The invention discloses a method for extracting ellagic acid from a blue cloth by using an ultrasonic-assisted deep eutectic solvent, which adopts the ultrasonic-assisted deep eutectic solvent to extract the ellagic acid from the blue cloth, takes the yield of the ellagic acid from the blue cloth as an index, and researches the following five factors: the influence of the positive water content (A) of the blue cloth, the extraction time (B), the material-liquid ratio (C), the extraction temperature (D) and the extraction power (E) on the yield of the positive ellagic acid of the blue cloth is tested by using an experimental scheme obtained by a response surface design method so as to obtain the optimal extraction condition parameters of the yield of the positive ellagic acid of the blue cloth. Experimental results show that the optimal extraction process is adopted, namely the positive water content of the blue cloth is 47%, the deep eutectic solvent is added according to the mass-to-volume ratio of 10:1, and ultrasonic extraction is carried out for 31min at 70 ℃ and the extraction power of 300W. The method is stable and reliable, has high extraction efficiency, and can be used for extracting ellagic acid from herba Blumeae Laciniatae.)
技术领域
本发明涉及一种中药有效成分的提取方法，具体涉及超声辅助深共熔溶剂提取蓝布正中鞣花酸的方法。
背景技术
蓝布正，又名追风七，是蔷薇科植物路边青(Geum aleppicum Jacq)或柔毛路边青(Geum japonicum Thunb var chinense Bolle)的干燥全草，甘、微苦、凉，归肝、脾、肺经。其属“秦岭七药”之一，在陕西、安徽、湖北、甘肃、山东、河南、江苏等地区分布较广，具有健脾益气、润泽养颜、滋阴润肺、止咳化痰等功效，可用于气血两虚、肺气虚弱、久咳不止、脾失健运、湿聚下注等。蓝布正主要由鞣质类、木脂素类及苯丙素类等成分组成，其主要药理作用有祛风除湿、补血、抗炎、抗高血压、祛痰平喘及降血糖等。蓝布正主要成分是鞣花酸，具有消散攻逐体内瘀血、抑制肿瘤细胞的生长、有效抑制自由基的氧化反应等作用。根据现有研究可知，可以将加热搅拌提取法、超声提取法、微波提取法及超临界流体提取法等作为鞣花酸的提取方法，现有的提取方法，对鞣花酸的提取效率较低。
目前，还没有报道可采用超声辅助深共熔溶剂提取蓝布正中鞣花酸的方法。
发明内容
发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，通过响应面设计法筛选出最佳的提取工艺，提供一种可提高鞣花酸得率的超声辅助深共熔溶剂提取蓝布正中鞣花酸的方法。
本发明另外一个目的是提供鞣花酸的含量测定方法，本发明提供的检测方法，灵敏度高，稳定性好，对控制质量和保证疗效具有重要意义。
技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
一种超声辅助深共熔溶剂提取蓝布正中鞣花酸的方法，包括以下步骤：
(1)深共熔溶剂的制备
称取一定量的氯化胆碱和草酸混合，置于水浴加热，搅拌，待液体为无色透明且没有气泡时，取出待其冷却至室温，得深共熔溶剂；
(2)取蓝布正放入步骤(1)的深共熔溶剂中进行超声提取，提取后过滤得滤液，浓缩既得。
作为优选方案，以上所述的一种超声辅助深共熔溶剂提取蓝布正中鞣花酸的方法，包括以下步骤：
(1)深共熔溶剂的制备
称取摩尔比为1～3:1～3的氯化胆碱和草酸混合，置于40～60℃水浴加热1～10h，搅拌，待液体为无色透明且没有气泡时，取出待其冷却至室温，得深共熔溶剂；
(2)取蓝布正，按质量体积比5～20:1加入步骤(1)的深共熔溶剂中，于60～80℃进行超声提取20～60min，提取后过滤得滤液，浓缩既得。
作为优选方案，以上所述的一种超声辅助深共熔溶剂提取蓝布正中鞣花酸的方法，包括以下步骤：
(1)深共熔溶剂的制备
称取摩尔比为1:1的氯化胆碱和草酸混合，置于55℃水浴加热4～6h，搅拌，待液体为无色透明且没有气泡时，取出待其冷却至室温，得深共熔溶剂；
(2)取含水率为47％～60％的蓝布正，按质量体积比10:1加入步骤(1)的深共熔溶剂中，在70℃，提取功率为300W进行超声提取31min，提取后过滤得滤液，浓缩既得。
本发明所述的方法制备得到的鞣花酸的含量测定方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液配制
精密称定鞣花酸对照品，加甲醇制成浓度为0.25mg/mL的鞣花酸对照品溶液，过0.45μm滤膜，将其放入4℃冰箱贮存待用；
(2)供试品溶液配制
取超声辅助深共熔溶剂提取蓝布正得到的鞣花酸，加甲醇稀释后，过0.45μm滤膜，得到供试品溶液；
(3)分别取步骤(1)的对照品溶液和步骤(2)的供试品溶液，注入高效液相色谱仪中，按外标一点法或标准曲线法测定供试品中鞣花酸的含量。
其中步骤(3)的色谱条件为：流动相A为甲醇水溶液，流动相B为0.7％磷酸水溶液；梯度洗脱顺序如下：0～5min，8％A，92％B；5～10min，20％A，80％B；10～20min，40％A，60％B；20～25min，75％A，25％B；25～30min，90％A，10％B；30～35min，8％A，92％B；色谱柱Waters SunFire C18，规格4.6mm×150mm，5μm；流速为1mL·min-1；检测波长为253.4nm；柱温为30℃；进样量为10μL。
有益效果：本发明提供的超声辅助深共熔溶剂提取蓝布正中鞣花酸的方法和现有技术相比具有以下优点：
本发明采用超声辅助深共熔溶剂提取蓝布正中鞣花酸，本发明将蓝布正鞣花酸得率作为指标，研究以下五个因素：蓝布正含水率(A)、提取时间(B)、料液比(C)、提取温度(D)和提取功率(E)对蓝布正鞣花酸得率的影响，用响应面设计法得出的实验方案进行实验，以获得蓝布正鞣花酸得率的最优提取条件参数。实验结果表明采用最佳的提取工艺，即蓝布正含水率为47％，按质量体积比10:1加入深共熔溶剂，在70℃，提取功率为300W进行超声提取31min，提取的蓝布正中鞣花酸得率为3.2142mg·g-1，比纯水提取高142％，比70％丙酮水溶液高41％，比50％甲醇水溶液高76％。
该方法稳定可靠，提取效率高，可用于蓝布正中鞣花酸的提取。
另外本发明建立了蓝布正提取物中鞣花酸的含量检测方法，方法学表明，本发明提供的检测方法，精密度高、稳定性好、重复性好、准确度高。
附图说明
图1为含水率与提取时间的交互作用的响应面图。
图2为含水率与料液比的交互作用的响应面图。
图3含水率与提取温度的交互作用的响应面图。
图4为含水率与提取功率的交互作用的响应面图。
图5为提取时间与料液比的交互作用的响应面图。
图6为提取时间与提取温度的交互作用的响应面图。
图7为提取时间与提取功率的交互作用的响应面图。
图8为料液比与提取温度的交互作用的响应面图。
图9为料液比与提取功率的交互作用的响应面图。
图10为提取温度与提取功率的交互作用的响应面图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1深共熔溶剂提取蓝布正中鞣花酸
1、实验材料、仪器与试剂
1.1实验材料
蓝布正(铜陵禾田中药饮片股份有限公司，产品批号20190312)，另再分别取24批不同产地不同批号的蓝布正药材饮片，除去饮片中混有的杂质，用中草药粉碎机粉碎2min，过50目筛，避光贮存待用。
4.1.2实验仪器
实验仪器
生产公司
MiLLi-QIQ7000纯水机
密理博中国有限公司
电热恒温水浴锅
上海科恒实业发展有限公司
KQ-500DE型数控超声波清洗器
昆山市超声仪器有限公司
中草药粉碎机
天津市泰斯特仪器有限公司
赫西3H16RI冷冻离心机
湖南赫西仪器装备有限公司
AcquityAre超高效液相色谱仪
美国Waters有限公司
Microfuge20R微量冷冻离心机
美国贝克曼库尔特有限公司
梅特勒MS105DU电子天平
上海梅特勒-托利多实验室
1.2实验试剂
实验材料
化学式
生产商
氯化胆碱
C<sub>5</sub>H<sub>11</sub>NO<sub>2</sub>
西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司
草酸
C<sub>2</sub>H<sub>2</sub>O<sub>4</sub>
西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司
甲醇(分析纯)
CH<sub>3</sub>OH
天津市天力化学试剂有限公司
鞣花酸标准品
C<sub>14</sub>H<sub>6</sub>O<sub>8</sub>
四川省维克奇生物科技有限公司
2、实验方法
2.1深共熔溶剂的制备
分别称取一定量的氯化胆碱和草酸(摩尔比为1:1)置于烧杯中，于55℃水浴加热4～6h，并用玻璃棒不时搅拌，待液体为无色透明且没有气泡时，取出待其冷却至室温，可得深共熔溶剂，密封后于4℃冰箱中贮存待用。
2.2蓝布正中鞣花酸的提取方法
准确称取一定量的蓝布正(铜陵禾田中药饮片股份有限公司，产品批号20190312)粉末，将其放入10mL EP管中，加入2.5mL深共熔溶剂，根据实验设计的五个因素对蓝布正中鞣花酸进行超声提取，使用两台离心机时应该提前半小时进行预热至指定温度。提取完成后，将第一台冷冻离心机的转速设定为8000rpm，将温度设定为30℃，并且进行20min的离心分离。离心后，取出1mL上清液，将其转移至2mL EP管中，添加1mL超纯水，将微量冷冻离心机的速度设定为10000rpm、并将温度设置为20℃进行第二次离心分离，时间为10min。第二次离心结束后缓慢取出，并用移液枪移取上清液1mL至液相小瓶中，在超高效液相色谱仪中进行分析，每个样品均检测两次。
色谱条件：流动相(A)为甲醇水溶液，流动相(B)为0.7％磷酸水溶液；对样品展开进样分析，进行梯度洗脱顺序如下：0～5min，8％A，92％B；5～10min，20％A，80％B；10～20min，40％A，60％B；20～25min，75％A，25％B；25～30min，90％A，10％B；30～35min，8％A，92％B；色谱柱Waters SunFire C18(4.6mm×150mm，5μm)；流速为1mL·min-1；检测波长为253.4nm；柱温为30℃；进样量为10μL。
蓝布正鞣花酸得率计算公式为：
V1：定容后样品体积，单位：mL；V2：待测样品定容后体积，单位：mL；X：高效液相色谱法检测样品时对应于标准曲线的浓度，单位：mg·mL-1；m：蓝布正质量，单位：g；W：总鞣花酸得率，单位：mg·g-1。
2.3 Box-Behnken实验设计
根据单因素实验结果与分析及Box-Behnken实验设计原理，选取实验中的DES含水率、提取时间、料液比、提取温度及提取功率作为Box-Behnken实验设计的5个因素，结合响应面法的设计原理，采用5因素3水平的设计方案，见表1。
表1响应面分析因素与水平设计
2.4不同产地不同批号蓝布正中鞣花酸得率测定
分别取24批不同产地不同批号的蓝布正药材饮片，按照响应面设计法实验所得最优提取条件参数进行实验操作，得蓝布正中鞣花酸得率测定结果，每个样品均检测三次。
3、方法学考察
3.1对照品溶液配制
取0.25mg的鞣花酸对照品，精密称定，备用，并制成浓度为每1mL甲醇溶液中含有0.25mg鞣花酸对照品的溶液，配制完成后将其放入4℃冰箱贮存待用。
3.2供试品溶液配制
将氯化胆碱与草酸按照一定摩尔比(1:1)称取完成后，放入烧杯中置于55℃水浴中加热4～6h，并不时搅拌，烧杯中液体为无色透明且没有气泡时，取出等待其冷却至室温，得到深共熔溶剂，放入4℃冰箱贮存待用。
3.3实验条件参数
A(50％)、B(30min)、C(20mg·mL-1)、D(50℃)和E(300W)。
3.4重复性实验
取相同批次的蓝布正粉末，准确称重，平行6份，备用。制成供试品溶液，按上述的色谱条件，将10μL分别进样注入高效液相色谱仪中，测定鞣花酸的峰面积，考察蓝布正中鞣花酸的重复性。
3.5精密度实验
根据“3.2”的方法对供试品溶液进行制备，取已经提前制备好的0.125mg·mL-1的鞣花酸标准品溶液1mL，按上述的色谱条件，在高效液相色谱仪中对供试品溶液进行分析，每次进样10μL，并连续不断进样6次，测定鞣花酸的峰面积。
3.6稳定性实验
取相同批次的蓝布正粉末，准确称重，平行6份，备用。制成供试品溶液，放至室温。在高效液相色谱仪中于0、2、4、6、8、10、12、24h分别进样10μL，按上述的色谱条件，通过测定供试品溶液中鞣花酸的峰面积，来研究供试品溶液的稳定性。
3.7加样回收率实验
取已知含量的样品0.025g，精密称定，平行6份，备用。分别精密加入0.06275mg鞣花酸对照品，取供试品溶液，按上述的色谱条件注入高效液相色谱仪中进行测定，分别进样10μL，通过测定鞣花酸的峰面积，计算回收率。
3.8溶剂对比实验
取相同批次的蓝布正粉末，准确称重，平行3份，备用。加入纯水、70％丙酮、50％甲醇制成供试品溶液进样10μL，按上述的色谱条件注入高效液相色谱仪中进行测定鞣花酸的峰面积，对比不同溶剂的提取效率。
4、实验结果与分析
4.1 Box-Behnken实验设计优化提取工艺
4.1.1响应面实验设计及结果，见表2。
表2响应面分析方案及结果
4.1.2模型方程的建立与显著性检验
在对表2中的实验结果进行分析后，得到鞣花酸得率(Y)与A、B、C、D和E等因素的回归方程(1)：
Y＝2.83-0.0337A+0.0608B-0.0297C+0.2217D-0.0173E-0.0059AB-0.0321AC-0.0633AD+0.0072AE+0.0831BC+0.0467BD+0.0255BE-0.0434CD-0.0110CE-0.0106DE-0.1191A2-0.1130B2-0.0204C2+0.0692D2-0.1374E2
表3显示了模型回归方差分析结果。上面的回归方程的相关系数R2＝0.8698，表示该方程拟合度较高；校正系数＝76.57％，表明该模型可以解释76.57％的实验数据。失拟项可以表示模型中数据的差异，可以从表3中看到，回归模型失拟项F＝8.35，P＜0.0001，这表明回归模型已经达到了非常显著的水平，该模型非常适合实际实验，并且实验误差相对较小，能反映出鞣花酸得率与DES含水率、提取时间、料液比、提取温度及提取功率之间的关系。模型方程式中的失拟项F＝2.94，P＝0.1175＞0.05，表明回归模型并非缺乏拟合，并且对实验拟合情况良好。比较P值和F值的大小，结果表明，各因素对鞣花酸得率的影响为：D＞B＞A＞C＞E。其中，B、D、A2、B2、D2、E2项(P＜0.05)对鞣花酸的提取有显著影响。因此，可利用该模型对蓝布正中鞣花酸的提取情况进行分析和预测。
表3回归模型方程的方差分析
注：*.P＜0.05差异性显著；**.P＜0.01差异性极显著。
4.1.3各因素的交互作用
实验结果见表4、图1～图10。
表4响应面设计优化各因素交互作用实验结果
注：-.表示相同因素；/.表示对应各因素为确定值。
一般来说，在响应面设计法中，能直接反映出各因素之间交互作用对响应值影响的是响应面图和等高线图。等高线的形状可以反映出交互作用的强度，分为圆形(弱交互作用)和椭圆形(显著交互作用)。可以看出图1中Ⅱ、Ⅸ的椭圆形状较为明显，则表明AC之间和CE之间较强的交互作用。
4.1.4验证实验结果
通过软件Design-Expert 10求解方程(1)后，得到最优的提取条件参数：A(47％)、B(31min)、C(10mg·mL-1)、D(70℃)和E(300W)。在此条件下，响应面设计法预测的鞣花酸得率为3.188mg·g-1。为了检验响应面设计法给出的模型是否真实可信，故采用获得的最优提取条件参数进行三次验证实验，三次验证实验中鞣花酸平均得率为3.2142mg·g-1，相对于理论预测值的相对标准偏差为0.58％。总而言之，可以看到该模型是可靠的，因此响应面设计法适用于蓝布正中鞣花酸提取工艺的回归分析和条件参数日臻完善。
4.2不同产地不同批号蓝布正中鞣花酸测定结果，结果见表5。
表5实验结果
4.3方法学考察实验结果
结果见表6、表7。
表6实验结果
实验项目
鞣花酸峰面积RSD(％)
结果
重复性实验
2.60
提取方法重复性良好
精密度实验
0.4
仪器的精密度良好
稳定性实验
0.85
供试品溶液在24h内稳定
表7加样回收率实验结果
4.3不同提取溶剂超声提取的对比实验结果
表8溶剂对比实验结果
以蓝布正为提取原料，深共熔溶剂为提取溶剂，采用超声提取其中的鞣花酸，考察DES含水率、提取时间、料液比、提取温度和提取功率等工艺条件，并利用响应面法建立模型对实验进行分析，当蓝布正(DES)含水率为47％、提取时间为31min、料液比为10mg·mL-1、提取温度为70℃、提取功率为300W时，鞣花酸得率最高为3.3186mg·g-1，比纯水提取高142％，比70％丙酮水溶液高41％，比50％甲醇水溶液高76％，表明本发明采用深共熔溶剂可明显提高鞣花酸得率，取得了很好的技术效果。
24批蓝布正药材的鞣花酸得率测定结果表明，贵州和福建两地药材鞣花酸得率较高。福建省不同批号蓝布正以及贵州省Y44与其他四份蓝布正鞣花酸得率存在显著差异，可能是由于气候、地理位置、收获季节等因素的影响。因此，将鞣花酸得率作为考察蓝布正中有效化学成分的指标，为蓝布正药材的后续质量研究提供了科学依据。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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