一种海洋链霉菌磷脂酶d突变体和应用

文档序号：1793927 发布日期：2021-11-05 浏览：14次 >En<

阅读说明：本技术 一种海洋链霉菌磷脂酶d突变体和应用 (Marine streptomycete phospholipase D mutant and application ) 是由王永华王方华胡荣康蓝东明杨博于 2021-07-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种海洋链霉菌磷脂酶D突变体和应用,所述的磷脂酶D突变体是在氨基酸序列为SEQ ID NO:1的基础上单点突变380位点氨基酸所得。本发明磷脂酶D突变体酶活力显著提高,实验测定突变体1(S380A)的酶活力是野生型的2.4倍,突变体2(S380F)的酶活力是野生型的1.1倍,突变体3(S380V)的酶活力是野生型的2.6倍,突变体4(S380M)的酶活力是野生型的1.2倍,突变体5(S380L)的酶活力是野生型的1.6倍。同时,本发明突变体的催化效率也显著提高,酶活力和催化性能的改善进一步提升了该酶的工业利用价值。(The invention discloses a streptomyces marinus phospholipase D mutant and application thereof, wherein the phospholipase D mutant is obtained by single point mutation of 380-site amino acid on the basis that the amino acid sequence is SEQ ID NO. 1. The phospholipase D mutant enzyme activity is remarkably improved, and experiments determine that the enzyme activity of the mutant 1(S380A) is 2.4 times of that of a wild type, the enzyme activity of the mutant 2(S380F) is 1.1 times of that of the wild type, the enzyme activity of the mutant 3(S380V) is 2.6 times of that of the wild type, the enzyme activity of the mutant 4(S380M) is 1.2 times of that of the wild type, and the enzyme activity of the mutant 5(S380L) is 1.6 times of that of the wild type. Meanwhile, the catalytic efficiency of the mutant is also obviously improved, and the industrial utilization value of the enzyme is further improved by improving the enzyme activity and the catalytic performance.)

一种海洋链霉菌磷脂酶D突变体和应用

技术领域

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体地说涉及利用分子生物学定点突变技术获得催化性能显著提高的磷脂酶D突变体及其重组表达制备方法。

背景技术

磷脂是一种含有磷酸的混合脂类，是生物膜的基本成分和组成生命的必需物质。此外，磷脂由于其独特的化学结构和保健功能，已广泛应用于乳化剂、化妆品成分、医药配方和脂质体制剂。在工业中，天然磷脂主要是毛油精炼脱水和脱胶的副产品。近年来，人们对不同分子性质如电荷、极性、大小等的磷脂产生了极大的兴趣，以获得具有优良加工性能和突出生理药理功能的特殊功能磷脂。因此，对天然磷脂进行改性已成为实现磷脂副产物高价值利用的重要途径。

酶法修饰改性是制备功能性磷脂的一个重要方向。作为磷脂酶家族的重要成员，磷脂酶D(PLD)是合成和改造磷脂质的一类重要工具酶。磷脂酶D(PLD)(EC 3.1.4.4)可通过磷脂酰基转移作用(transphosphatidylation)催化磷脂质极性头部基团发生转移反应，从而合成为各种不同的稀有磷脂及系列功能性磷脂衍生物。PLD已被用于合成较少丰富的磷脂，如磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol，PG)，磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)，磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)和磷脂酰肌醇(phatidylglycerol，PI)。除此之外，通过PLD还合成了大量新型磷脂，其中包括磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)中的胆碱被脂族醇、糖类，核苷、芳香醇或n-杂环醇所取代。因此，开发有工业应用价值的PLD具有重要的战略意义和发展前景。

目前，在PLD酶蛋白开发方面，相较于其他类型酶蛋白(蛋白酶、脂肪酶等)，国际上整体还处于起步阶段，存在较大的发展空间。全球可购买到的商品化PLD不超过10种，并主要由日本的几个公司所垄断，国内未见有商品化的PLD。磷脂酶D来源单一、酶活力低下、制备难度大、成本高是当前制约该类酶开发的技术瓶颈。PLD自身酶学性质好坏是决定该酶是否可用于商品化酶制剂开发的关键因素，其中酶活力低下成为主要的制约因素，离工业化应用的需求还有很大的差距。利用蛋白质工程对酶分子进行改造成为解决该问题的主要方案，如中国发明专利201610402557.7中利用重组DNA技术对野生型磷脂酶D基因进行定点突变，得到活力较高的磷脂酶D基因。重组表达后，检测高活力磷脂酶D的比酶活较野生型磷脂酶D提高38-140％。

国内对磷脂酶D的研究起步较晚，在磷脂酶D发酵菌种、酶学性质等方面与国外的先进技术有很大的差距。当前，国内未见有PLD商品化酶出现，酶制剂主要依赖进口，商品化酶源的高度依赖性严重影响了我国下游酶法磷脂改性工业的健康发展。因此，急需开发新的酶学性质优良的磷脂酶D，并降低生产成本，从而促进磷脂酶D的广泛应用。实现新酶自主研发、高效制备等关键技术突破是改变当前现状的有效途径。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种高活力磷脂酶D，及利用其制备磷脂酰丝氨酸的方法。

SEQ ID No.1

DSSATPHLDAVEQTLRQVSPGLEGRVWERTAGNALDAPAGDPAGWLLQTPGCWGDANCAERTGTKRLLARMTENISKATRTVDISTLAPFPNGAFQDAIVAGLKKSVENGNKPKVRVLVGAAPVYHMNVLPSKYRDDLRDKLGKAADGLTLNVASMTTSKTAFSWNHSKLLVVDGQSAITGGINSWKDDYVDTTHPVSDVDLALTGPAAGSAGRYLDQLWTWTCENKSNIASVWFAASPGAGCMPTMEKDANPVPAAATGNVPVIAVGGLGVGIKDSDPSSAFKPELPSAPDTKCVVGLHDNTNADRDYDTVNPEESALRALVGSARSHVEISQQDLNATCPPLPRYDVRLYDALAAKLAAGVKVRIVVSDPENRGAVGSGGYSQIKSLNEISDLLRNRLSLLPGGAQGAKTAMCGNLQLATARSSDSAKWADGKPYAQHHKLVSVDDSAFYIGSKNLYPSWLQDFGYIVESPEAARQLDAELLAPQWKYSQATATFDYARGICQG

本发明的技术方案如下：

一种磷脂酶D突变体，所述的磷脂酶D突变体是在氨基酸序列为SEQ ID NO:1的基础上单点突变380位点氨基酸为几种疏水性氨基酸(A,F,V,M,L)所得。其中的第380位的氨基酸被置换为以下氨基酸：第380位：Ser380Ala，Ser380Phe，Ser380Val，Ser380Met，Ser380Leu。

所述突变体的基因，由氨基酸序列为SEQ ID No.1(GenBank:RKN69773.1)的克伦基链霉菌(Streptomyces klenkii)作为亲本，在此基础上，通过信号肽在线分析软件Signal P分析其信号肽序列，将去除信号肽后的蛋白序列进行同源建模，获得其三维结构，对其蛋白结构进行分析，通过酶切、连接等构建重组载体，之后由重叠PCR技术对野生型磷脂酶D基因将第380位点进行突变，得到突变体基因。

优选地，所述氨基酸序列为SEQID NO:2，SEQID NO:3，SEQID NO:4，SEQID NO:5，SEQID NO:6。

一种编码磷脂酶D突变体的基因，其核酸序列为SEQID NO:8，SEQID NO:9，SEQIDNO:10，SEQID NO:11，SEQID NO:12。

一种重组基因工程菌的制备方法，将所述基因克隆到表达载体pET-21a、pET-28a或pET-32a上，转化大肠杆菌SHuffle T7感受态细胞，获得重组基因工程菌。

所述的磷脂酶D突变体用于生产磷脂酰丝氨酸。优选地，将L-丝氨酸加入磷脂酶D突变体的酶液中，大豆卵磷脂加入有机溶剂中，混合后于40±5℃振荡培养12±4h。

优选地，所述有机溶剂与酶液的体积比为4:1～4:4，有机溶剂为乙醚。

优选地，所述磷脂酶D突变体的酶液为磷脂酶D突变体加入Tris-HCl缓冲液，pH为8。

以酶联比色法测定突变体对大豆磷脂酰胆碱的酶活及酶动力学。

在本发明中采用如下定义：

1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法：

使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。

2.磷脂酶D突变体的标识

采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示磷脂酶D突变体中突变的氨基酸。如Ser380Val，表示位置380的氨基酸由野生型磷脂酶D的Ser替换成Val。位置的编号对应于SEQ ID NO：1中磷脂酶D的氨基酸序列编号。核苷酸的变化同样采用“原始核苷酸位置替换的核苷酸”来表示，位置编号对应SEQ ID NO：7中野生型磷脂酶D的核苷酸序列编号。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)酶活力显著提高。本发明突变体1的酶活力是野生型的2.4倍，突变体2的酶活是野生型的1.1倍，突变体3的酶活是野生型的2.6倍，突变体4的酶活是野生型的1.2倍，突变体5的酶活是野生型的1.6倍。说明本发明获得的磷脂酶突变体活力得到显著提高。

(2)催化效率显著提高。本发明突变体1的催化效率(k_cat/K_m)是野生型的3.5倍，突变体2的催化效率(k_cat/K_m)是野生型的1.4倍，突变体3的催化效率(k_cat/K_m)是野生型的4.9倍，突变体4的催化效率(k_cat/K_m)是野生型的1.4倍，突变体5的催化效率(k_cat/K_m)是野生型的1.9倍。说明本发明获得的磷脂酶突变体催化效率得到显著提高。自身酶活力和催化效率的提升进一步提升了该酶的工业利用价值。

附图说明

图1为野生型SkPLD及突变体蛋白纯化SDS-PAGE检测结果图。

图2为磷脂酶D突变体1(SkPLD-Ser380Ala)、突变体2(SkPLD-Ser380Phe)、突变体3(SkPLD-Ser380Val)、突变体4(SkPLD-Ser380Met)、突变体5(SkPLD-Ser380Leu)与野生型(SkPLD)相对酶活力柱状图。

图3为磷脂酶D和突变体3(SkPLD-Ser380Val)应用于生产磷脂酰丝氨酸。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

实施例1：磷脂酶SkPLD突变体表达载体及表达菌株的构建

(1)参照克伦基链霉菌(Streptomyces klenkii)的野生型磷脂酶D(SkPLD)完整氨基酸序列(GenBank:RKN69773.1)，通过信号肽在线分析软件Signal P分析其信号肽序列，将1-33位氨基酸从完整序列中进行删除，获得磷脂酶SkPLD成熟肽编码序列(SEQ IDNO.1)；

(2)根据(1)所得氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏好性设计磷脂酶SkPLD基因编码序列，其碱基序列如SEQ ID NO.7所示(野生型)。在序列上游引入ECoR I，下游引入NotI酶切位点，所得磷脂酶SkPLD基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；

(3)将(2)所合成的磷脂酶SkPLD基因用限制性内切酶ECoR I和Not I分别对纯化的基因片段和质粒pET28a进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞。涂布于LB(含50μg/mL卡那霉素)平板。挑取阳性克隆通过ECoR I和Not I双酶切鉴定及基因测序，获得野生型SkPLD的pET28a-SkPLD重组质粒；

(4)采用两步重叠延伸PCR方法构建本发明所述突变体SEQID NO:2，SEQID NO:3，SEQID NO:4，SEQID NO:5，SEQID NO:6。首先进行引物全长的拼接，然后以含有目的基因的质粒模板进行扩增。反应条件如下：

反应条件1：

其中突变体1构建所用上游引物和下游引物序列为：

上游引物：agtaaccgccagcgccaaccgcgcc

下游引物：ggcgcggttggcgctggcggttact

突变体2构建所用上游引物和下游引物序列为：

上游引物：taaccgccaaagccaaccgcgccacgg

下游引物：ccgtggcgcggttggctttggcggtta

突变体3构建所用上游引物和下游引物序列为：

上游引物：gagagtaaccgccaacgccaaccgcgccac

下游引物：gtggcgcggttggcgttggcggttactctc

突变体4构建所用上游引物和下游引物序列为：

上游引物：ctgagagtaaccgcccatgccaaccgcgccacg

下游引物：cgtggcgcggttggcatgggcggttactctcag

突变体5构建所用上游引物和下游引物序列为：

上游引物：agtaaccgcctaagccaaccgcgccacgg

下游引物：ccgtggcgcggttggcttaggcggttactPCR扩增条件:98℃，3min；98℃，10s；58℃，15s；72℃，10s；20个循环；72℃，2min。扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化得到全长引物。

反应条件2：

PCR扩增条件:98℃，3min；98℃，10s；58℃，15s；72℃，408s；31个循环；72℃，2min。PCR产物利用DNA纯化试剂盒进行产物纯化得到磷脂酶突变基因。

用Dpn I酶切消化模板质粒，Dpn I酶切消化体系如下：

将Dpn I酶切消化体系置于37℃条件下，2h。将消化产物转化至E.coli DH5α感受态细胞。涂布于LB(含50μg/mL卡那霉素)平板。挑取阳性克隆通过ECoR I和Not I双酶切鉴定及基因测序，获得pET28a-SkPLD-突变体质粒。

(5)分别将(3)、(4)所得的重组质粒转化到大肠杆菌SHuffle T7感受态细胞，挑选阳性克隆并测序验证，即获得重组pET28a-SkPLD野生型及突变体的SHuffle T7大肠杆菌表达菌株。

实施例2：野生型SkPLD及其突变体重组表达菌株发酵及重组蛋白纯化

(1)将重组大肠杆菌SkPLD野生型及突变体表达菌株接种于含卡那霉素(50μg/mL)的种子培养基(NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，pH7.2～7.4)中，于37℃，200r/min摇瓶培养至对数生长期，作为种子液；

(2)将(1)中所述种子液按5％的接种量接种到自诱导液体发酵培养基(酶水解酪蛋白10g/L，酵母浸膏5g/L，葡萄糖0.5g/L，乳糖2g/L，甘油5g/L，磷酸氢二钠3.6g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.7g/L，硫酸钠0.7g/L，硫酸镁1g/L，pH 7.2～7.4)中，于37℃，200r/min摇瓶培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8，再于20℃，200r/min条件下诱导培养24h；(3)将(2)中所得发酵液离心(8000r/min,5min)，收集菌体沉淀，用Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)重悬并超声破碎细胞，将细胞破碎液离心(10000r/min,20min)，取上清，即为制备得到的磷脂酶SkPLD粗酶液；

(4)将(3)中所得磷脂酶粗酶液，用0.45μm的滤膜抽滤。滤液利用镍柱亲和层析柱纯化，流速4mL/min，最后用含10-500mM咪唑的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)梯度洗脱，目标蛋白在250mM咪唑浓度处被洗脱下来。将洗脱下来的目的蛋白过G-25脱盐柱后，上样Q柱层析，用含有700mM NaCl的Tris-HCl缓冲液(pH 7.3)洗脱得到目的蛋白(见附图1)。

实施例3:磷脂酶酶学性质分析

(1)磷脂酶活力的测定方法

野生型磷脂酶SkPLD及突变体磷脂酶活力的测定均采用标准的酶联比色法进行测定，以大豆磷脂酰胆碱作为反应底物。采用酶联比色法进行活性检测：磷脂酶D催化水解L-α-卵磷脂生成胆碱，胆碱在胆碱氧化酶的作用下生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化酶的作用下与4-氨基氨替比林和苯酚生成醌亚胺显色物质，在500nm波长下有吸光值。对于底物制备，1mmol大豆磷脂酰胆碱溶解在5mL氯仿中。氮气吹干后，加入SDS和Triton X-100，得到包含1mm大豆磷脂酰胆碱、1.25mM SDS和4mm Triton X-100的溶液。使用800W/s的探针超声器对溶液进行涡旋和超声10分钟。反应混合物(100μL)由0.4mM大豆PC、50mM Tris-HCl(pH8.0)、20mm CaCl2和10μL酶样组成。在40℃振荡孵育10min后，加入25μL含50mM EDTA和50mMTris-HCl(pH 8.0)的溶液并在100℃加热变性5分钟。冷却反应混合物到室温后,加入25μL的50mM Tris-HCl(pH值8.0)包含42mM苯酚,4-氨基氨替比林50mM,0.5U辣根过氧化物酶和0.25U胆碱氧化酶混合溶液。37℃孵育60min后，在500nm处测量反应混合物的吸光度。

(2)野生型及突变体磷脂酶酶动力学的测定方法如下：按照上述磷脂酶活力的测定方法，在各自最适反应温度和最适pH条件下，以大豆磷脂酰胆碱为底物，在底物浓度为0-2.8mN条件下测定酶活力，并对结果进行非线性拟合。对照组和样品组均做三组平行。结果如表1所示，本发明突变体1的催化效率(k_cat/K_m)是野生型的3.5倍，突变体2的催化效率(k_cat/K_m)是野生型的1.4倍，突变体3的催化效率(k_cat/K_m)是野生型的4.9倍，突变体4的催化效率(k_cat/K_m)是野生型的1.4倍，突变体5的催化效率(k_cat/K_m)是野生型的1.9倍。说明本发明获得的磷脂酶突变体催化效率得到显著提高。

表1磷脂酶SkPLD及其突变体的酶动力学参数

实施例4:突变体(S380V)用于磷脂酰丝氨酸合成

反应在双相反应体系中进行。初始转化条件为:将20mg/mL L-丝氨酸加入500μL酶液(100μg/mL PLD加入100mM Tris-HCl缓冲液，pH为8)中，大豆卵磷脂PC(5mg/mL)加入500μL乙醚中，40℃振荡培养12h。为了得到PLD催化转磷脂酰化的最佳条件，选用有机溶剂与水相比例(4:1,4:2,4:3,and 4:4)对SkPLD和突变体3(S380V)转磷脂酰化反应的影响。采用薄层色谱法(TLC)对磷脂样品进行分析。以氯仿-甲醇-乙酸-水(75:40:8:3，按体积计)和0.2％(w/v)2′，7′-二氯荧光素溶液为显色剂。采用HPLC(Waters 1525,USA)和ELSD定量PS。用色谱柱(4.6μm×125mm,Thermo,USA)洗脱反应混合物，溶剂A(甲醇/水/乙酸/三乙胺，425:75:2.5:0.25,vol.)和溶剂B(正己烷/异丙醇/溶剂A,160:384:256,vol.)。洗脱轮廓为:0min,A＝100％；9min时，B增加到40％；13min,B增到60％；17min,B＝100％；22分钟下降到0％。PS产率(％)定义为与初始PC浓度相比PS的百分比。结果如图3所示，以乙醚为有机相，在40℃下振荡12h，反应转化率为48.58％，PS累积浓度为2.43mg/mL。

综上所述，与野生型相比，本发明获得的磷脂酶突变体显著提高了其自身酶活力，更适合应用于食品、医药等工业领域，具有广阔的市场空间。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种海洋链霉菌磷脂酶D突变体和应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 506

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Ser Ser Ala Thr Pro His Leu Asp Ala Val Glu Gln Thr Leu Arg

1 5 10 15

Gln Val Ser Pro Gly Leu Glu Gly Arg Val Trp Glu Arg Thr Ala Gly

20 25 30

Asn Ala Leu Asp Ala Pro Ala Gly Asp Pro Ala Gly Trp Leu Leu Gln

35 40 45

Thr Pro Gly Cys Trp Gly Asp Ala Asn Cys Ala Glu Arg Thr Gly Thr

50 55 60

Lys Arg Leu Leu Ala Arg Met Thr Glu Asn Ile Ser Lys Ala Thr Arg

65 70 75 80

Thr Val Asp Ile Ser Thr Leu Ala Pro Phe Pro Asn Gly Ala Phe Gln

85 90 95

Asp Ala Ile Val Ala Gly Leu Lys Lys Ser Val Glu Asn Gly Asn Lys

100 105 110

Pro Lys Val Arg Val Leu Val Gly Ala Ala Pro Val Tyr His Met Asn

115 120 125

Val Leu Pro Ser Lys Tyr Arg Asp Asp Leu Arg Asp Lys Leu Gly Lys

130 135 140

Ala Ala Asp Gly Leu Thr Leu Asn Val Ala Ser Met Thr Thr Ser Lys

145 150 155 160

Thr Ala Phe Ser Trp Asn His Ser Lys Leu Leu Val Val Asp Gly Gln

165 170 175

Ser Ala Ile Thr Gly Gly Ile Asn Ser Trp Lys Asp Asp Tyr Val Asp

180 185 190

Thr Thr His Pro Val Ser Asp Val Asp Leu Ala Leu Thr Gly Pro Ala

195 200 205

Ala Gly Ser Ala Gly Arg Tyr Leu Asp Gln Leu Trp Thr Trp Thr Cys

210 215 220

Glu Asn Lys Ser Asn Ile Ala Ser Val Trp Phe Ala Ala Ser Pro Gly

225 230 235 240

Ala Gly Cys Met Pro Thr Met Glu Lys Asp Ala Asn Pro Val Pro Ala

245 250 255

Ala Ala Thr Gly Asn Val Pro Val Ile Ala Val Gly Gly Leu Gly Val

260 265 270

Gly Ile Lys Asp Ser Asp Pro Ser Ser Ala Phe Lys Pro Glu Leu Pro

275 280 285

Ser Ala Pro Asp Thr Lys Cys Val Val Gly Leu His Asp Asn Thr Asn

290 295 300

Ala Asp Arg Asp Tyr Asp Thr Val Asn Pro Glu Glu Ser Ala Leu Arg

305 310 315 320

Ala Leu Val Gly Ser Ala Arg Ser His Val Glu Ile Ser Gln Gln Asp

325 330 335

Leu Asn Ala Thr Cys Pro Pro Leu Pro Arg Tyr Asp Val Arg Leu Tyr

340 345 350

Asp Ala Leu Ala Ala Lys Leu Ala Ala Gly Val Lys Val Arg Ile Val

355 360 365

Val Ser Asp Pro Glu Asn Arg Gly Ala Val Gly Ser Gly Gly Tyr Ser

370 375 380

Gln Ile Lys Ser Leu Asn Glu Ile Ser Asp Leu Leu Arg Asn Arg Leu

385 390 395 400

Ser Leu Leu Pro Gly Gly Ala Gln Gly Ala Lys Thr Ala Met Cys Gly

405 410 415

Asn Leu Gln Leu Ala Thr Ala Arg Ser Ser Asp Ser Ala Lys Trp Ala

420 425 430

Asp Gly Lys Pro Tyr Ala Gln His His Lys Leu Val Ser Val Asp Asp

435 440 445

Ser Ala Phe Tyr Ile Gly Ser Lys Asn Leu Tyr Pro Ser Trp Leu Gln

450 455 460

Asp Phe Gly Tyr Ile Val Glu Ser Pro Glu Ala Ala Arg Gln Leu Asp

465 470 475 480

Ala Glu Leu Leu Ala Pro Gln Trp Lys Tyr Ser Gln Ala Thr Ala Thr

485 490 495

Phe Asp Tyr Ala Arg Gly Ile Cys Gln Gly

500 505

<210> 2

<211> 506

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Ser Ser Ala Thr Pro His Leu Asp Ala Val Glu Gln Thr Leu Arg

1 5 10 15

Gln Val Ser Pro Gly Leu Glu Gly Arg Val Trp Glu Arg Thr Ala Gly

20 25 30

Asn Ala Leu Asp Ala Pro Ala Gly Asp Pro Ala Gly Trp Leu Leu Gln

35 40 45

Thr Pro Gly Cys Trp Gly Asp Ala Asn Cys Ala Glu Arg Thr Gly Thr

50 55 60

Lys Arg Leu Leu Ala Arg Met Thr Glu Asn Ile Ser Lys Ala Thr Arg

65 70 75 80

Thr Val Asp Ile Ser Thr Leu Ala Pro Phe Pro Asn Gly Ala Phe Gln

85 90 95

Asp Ala Ile Val Ala Gly Leu Lys Lys Ser Val Glu Asn Gly Asn Lys

100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

Ser Ala Ile Thr Gly Gly Ile Asn Ser Trp Lys Asp Asp Tyr Val Asp

180 185 190

Thr Thr His Pro Val Ser Asp Val Asp Leu Ala Leu Thr Gly Pro Ala

195 200 205

Ala Gly Ser Ala Gly Arg Tyr Leu Asp Gln Leu Trp Thr Trp Thr Cys

210 215 220

Glu Asn Lys Ser Asn Ile Ala Ser Val Trp Phe Ala Ala Ser Pro Gly

225 230 235 240

Ala Gly Cys Met Pro Thr Met Glu Lys Asp Ala Asn Pro Val Pro Ala

245 250 255

Ala Ala Thr Gly Asn Val Pro Val Ile Ala Val Gly Gly Leu Gly Val

260 265 270

Gly Ile Lys Asp Ser Asp Pro Ser Ser Ala Phe Lys Pro Glu Leu Pro

275 280 285

Ser Ala Pro Asp Thr Lys Cys Val Val Gly Leu His Asp Asn Thr Asn

290 295 300

Ala Asp Arg Asp Tyr Asp Thr Val Asn Pro Glu Glu Ser Ala Leu Arg

305 310 315 320

Ala Leu Val Gly Ser Ala Arg Ser His Val Glu Ile Ser Gln Gln Asp

325 330 335

Leu Asn Ala Thr Cys Pro Pro Leu Pro Arg Tyr Asp Val Arg Leu Tyr

340 345 350

Asp Ala Leu Ala Ala Lys Leu Ala Ala Gly Val Lys Val Arg Ile Val

355 360 365

Val Ser Asp Pro Glu Asn Arg Gly Ala Val Gly Ala Gly Gly Tyr Ser

370 375 380

Gln Ile Lys Ser Leu Asn Glu Ile Ser Asp Leu Leu Arg Asn Arg Leu

385 390 395 400

Ser Leu Leu Pro Gly Gly Ala Gln Gly Ala Lys Thr Ala Met Cys Gly

405 410 415

Asn Leu Gln Leu Ala Thr Ala Arg Ser Ser Asp Ser Ala Lys Trp Ala

420 425 430

Asp Gly Lys Pro Tyr Ala Gln His His Lys Leu Val Ser Val Asp Asp

435 440 445

Ser Ala Phe Tyr Ile Gly Ser Lys Asn Leu Tyr Pro Ser Trp Leu Gln

450 455 460

Asp Phe Gly Tyr Ile Val Glu Ser Pro Glu Ala Ala Arg Gln Leu Asp

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