控制猫糖尿病的化合物
阅读说明：本技术 控制猫糖尿病的化合物 (Compounds for the control of feline diabetes ) 是由 M·哈德 A·柯林森 B·锡德 于 2020-03-13 设计创作，主要内容包括：本文提供了控制猫糖尿病的方法；所述方法包括向有需要的猫每天施用总剂量约为5-50mg的化合物1,或其药学上可接受的形式,其结构式如下：本文还提供了控制猫糖尿病的方法,包括向有需要的猫施用有效量的SGLT抑制剂,其中所述有效量不超过导致健康猫腹泻或稀便频率升高所需剂量的10％至30％。(Provided herein are methods of controlling diabetes in cats; the method comprises administering to a cat in need thereof a total daily dose of about 5mg to about 50mg of compound 1, or a pharmaceutically acceptable form thereof, having the formula: also provided herein are methods of controlling diabetes in cats comprising administering to a cat in need thereof an effective amount of an SGLT inhibitor, wherein the effective amount is no more than 10% to 30% of the dose required to cause an increase in the frequency of diarrhea or loose stools in healthy cats.)
具体实施方式
I.概述
本发明公开了化合物贝沙格列嗪所具备的令人惊讶的物种依赖性效力和选择性，所述化合物最初为治疗人类2型糖尿病而开发。
贝格列洛津是一种C-芳基葡萄糖苷，是人类钠-葡萄糖连接转运蛋白2(SGLT2)的高选择性抑制剂，SGLT2是一种在肾近端小管S1和S2段的肾小管上皮的顶端质膜上表达的完整膜蛋白。在正常生理条件下，它负责重新摄取滤液中的大部分葡萄糖。贝沙格列嗪对人SGLT2的选择性是人SGLT1的2400倍。贝沙格列嗪在小鼠、大鼠、猫、狗、兔子、猴子和人类体内产生显著的饱和糖尿。使用啮齿动物糖尿病遗传模型的实验表明，即使存在大量先前存在的糖尿，贝沙格列嗪也可以降低血糖水平，部分缓解疾病。因此，糖尿的存在并不排除应用贝沙格列嗪控制糖尿病。
在本发明中，已发现贝沙格列嗪对猫SGLT2的效力是对人SGLT2的5倍，对猫SGLT1的效力是对人SGLT1的235倍。作为猫SGLT1/2的双重抑制剂，贝沙格列嗪在其作用机制中既有理想的作用，也有不良的作用。值得注意的是，在糖尿病猫中，它引起显著的糖尿和高血糖的迅速缓解，同时在高剂量下也表现出诱导稀便和腹泻的趋势，这是SGLT1抑制的典型后果。因此，体内观察证实了体外预测的低选择性。
在人类中，编码SGLT1、SLC5A1的基因的无效或亚型突变会导致严重的新生儿腹泻，这被认为反映了管腔水丰度增加和微生物过度生长。然而，SGLT1部分抑制将减少葡萄糖(和，至少在某些物种中，半乳糖)的吸收，因此可能减少饮食中碳水化合物对血糖浓度的影响，从而达到理想的治疗效果。由于作用部位是肠道，而不是肾脏，SGLT1和SGLT2双重抑制剂的益处不应随着肾功能的衰退而下降，因此可能使患有肾脏疾病或有肾脏损害的糖尿病猫从贝沙格列嗪的作用中受益。当抑制剂同时作用于SGLT1和SGLT2时，可将其描述为SGLT抑制剂。
因此，为了从SGLT1和SGLT2双重抑制剂的作用中获益，必须取得平衡。与SGLT2相比，如果SGLT抑制剂对SGLT1的活性过高，肠道影响将占主导地位，随之而来的腹泻虽然对高血糖不一定不利，但会对猫主人和猫主人对猫健康的认知产生不利影响。SGLT1抑制的不良后果不仅限于人类和其他物种的腹泻，还可能包括其他肠道效应，如胀气、腹痛和腹胀。
因此，对SGLT1的活性低于对SGLT2的活性是有利的。根据可用的有限数据无法估计最佳比例，但需要记住的一个要素是化合物的局部浓度。当通过口服途径给药时，一种药物在肠腔内的浓度可能比在血浆中的浓度高出许多倍。因此，相对较弱的SGLT1抑制剂可能仍然具有相对有效的体内效应。尽管体外数据在一定程度上有助于指导选择合适的SGLT1和SGLT2混合抑制剂，但最好的指导仍然是对猫的实际效果的评估。肠道不良反应的剂量阈值应比产生90％最大药效的最小剂量高几倍。
腹泻的频率和严重程度可能因猫的饮食或体重、品种、病史或其他特殊因素而异。腹泻或稀便使主人产生不适的阈值也受到多重影响。就本说明而言，腹泻频率升高是指任何超过未给药猫10％以上的排便频率。因此，优选的双抑制剂在健康猫中产生腹泻或稀便的频率不低于三倍，更优选地五倍，以非处方普通饮食(如干粮饮食)喂养的健康猫产生90％最大尿葡萄糖排泄量的最小剂量。
由SGLT1抑制引起的腹泻可以通过提供低碳水化合物的饮食来减少。如上所述，猫是专性食肉动物，在非驯养环境中摄入很少的碳水化合物。相比之下，非糖尿病猫的商业干粮饮食可能以碳水化合物的形式提供高达50％的热值。
在一些国家，含有低碳水化合物的处方饮食可用于控制猫糖尿病。这些饮食通常包括湿(罐装)食物，尽管也有一些碳水化合物含量较低的干粮饮食。ISFM专家小组的建议指出，尽管首选的碳水化合物含量尚未确定，但是饮食中源自碳水化合物的热值≤12％的可能适合糖尿病猫(Sparkes等人，2015；《猫科医学杂志》17:235)。几种非处方罐头食品膳食也有最低碳水化合物含量。
干粮饮食中的大部分碳水化合物来源于谷物或谷物衍生物，通常它们在天然饮食中所占的比例可以忽略不计。一些猫粮小贩提供低谷物含量的饮食，作为传统饮食的更健康的替代品。由于这些饮食提供的碳水化合物形式的代谢能量较少，因此它们可以作为糖尿病控制计划的有益补充。
贝沙格列嗪已经在糖尿病小鼠、大鼠和人类中进行了研究。除了下面的信息，这种化合物如今在猫身上也得到了研究。在每种生物体中，这种化合物都被发现降低血糖水平，并改善长期血糖控制措施，如啮齿动物或人类的HbA1c，或猫的果糖胺。然而，对于猫，贝沙格列嗪的效果异常强，且在质量上优于在其他生物体中观察到的效果。在高比例的糖尿病猫中，贝沙格列嗪产生了疾病的临床缓解，致使血清果糖胺浓度落在健康猫的参考范围内。尽管贝沙格列嗪对猫具有很高的效力，但迄今为止尚未观察到有临床意义的低血糖迹象。高效力和低风险的结合使贝沙格列嗪成为控制猫糖尿病的最佳选择。特别令人感兴趣和有用的是，在一项由主人在无监督(家庭)环境下给猫服用药物的现场研究中，作为单一疗法的贝沙格列嗪被证明能将大多数猫的果糖胺水平恢复到测试实验室正常参考范围内。
一个令人惊讶和重要的治疗益处是受治疗的猫的体重增加，这一效果与该化合物在健康和糖尿病动物中的预期作用大相径庭。例如，在服用贝沙格列嗪的糖尿病患者中，体重减轻是一个常见和一致的观察结果，美国2015/0164856教导了服用SGLT2抑制剂的猫体重减轻。
对于本领域技术人员显而易见的是，药物的有效性取决于许多因素，包括疾病的严重程度和持续时间、活性成分或其活性代谢产物的代谢速率以及给药的规律性。给药错误，尤其是遗漏，会对药物的明显效用产生重大影响。在实际操作中，遗漏是常见的，遗漏的程度可能是药物有效性的决定因素。
并存病也可能影响药物的有效性。例如，由于SGLT1和SGLT2双重抑制剂阻断肾脏对葡萄糖的再摄取，它们可能会随着肾脏滤过功能下降，或作为衰老的自然结果，或肾脏疾病的发生而失去效力。本发明的SGLT1和2双重抑制剂被认为对患有严重肾脏疾病的猫不是有吸引力的控制选择，尽管它们可能在轻度至中度肾脏损害的情况下有效，并且在临床研究中发现它们对不同年龄的猫有效。
当人类最初出现T2DM时，他们很少处于糖尿病危机的痛苦中。相反，这种疾病逐渐发展，诊断是定期检查中附带的结果，或者是由于病人的抱怨，如口渴或尿频，预示着更严重的疾病。然而，患有糖尿病的猫经常在急性疾病时被呈递给兽医，血糖水平非常高，尿糖，体重减轻。猫的特征性高血糖相关临床症状包括多饮(过度饮水)、多食(过度进食)、多尿(排尿过多)和体重减轻。通常是体重减轻和身体不适引起主人的担忧。令人惊讶的是，尽管患有糖尿病的猫由于尿液中葡萄糖的大量丢失而营养不良(通过上面详述的肾脏机制)，但矛盾地，施用增加尿液葡萄糖分泌的贝沙格列嗪却能阻止体重减轻，并使许多猫体重增加。以类似的方式，由于其作用机制，预计给糖尿病猫服用贝沙格列嗪会使多饮、多食和多尿的高血糖相关临床症状恶化，因为这些症状都被认为是由疾病引起的糖尿的机制性后果。然而，与这一预期相反的是，即使给猫服用了预计会加剧这些症状的药物，给糖尿病猫服用贝沙格列嗪可减少多饮、多食和多尿的临床症状。当然，由于药物的作用机制，他们确实持续表现出严重的葡萄糖排尿。因此，尽管根据其机制，贝沙格列嗪可能会加剧与高血糖相关的临床症状，但在临床研究中，它逆转了体重减轻，并允许猫恢复正常或接近正常的行为。
关于贝沙格列嗪改善糖尿病猫高血糖相关临床症状的机制尚未有明确的解释。然而，通过抑制SGLT1和SGLT2，尿液中可能排出足够多的额外葡萄糖，从而导致血浆葡萄糖浓度的降低。随着血糖浓度的下降，与疾病相反，药物作用引起的糖尿比例增加，从而进一步改善血糖控制。最终，平衡了葡萄糖排泄率与产生的过量葡萄糖，并且高血糖相关的临床症状得到改善。
猫的糖尿病可能与肢端肥大症有关，肢端肥大症是一种由脑垂体生长激素室增生引起的疾病，导致生长激素分泌不当。生长激素升高反过来又致使胰岛素样生长因子1(IGF-1)升高，从而拮抗胰岛素的作用。糖尿病猫的胰岛素抗性常常与肢端肥大症相关(Scott-Moncrieff,JC,Vet Clin North Am Small Anim Pract(2010)40:241)，据估计，欧洲多达四分之一的糖尿病猫可能有潜在的肢端肥大症(Niessen PLoS One.2015 10:e0127794)。经常需要非常高剂量的胰岛素来控制患有肢端肥大症的糖尿病猫。一种有效的胰岛素非依赖性抗糖尿病药物将是治疗猫糖尿病的一个重要补充。
本文描述了通过施用化合物1(贝沙格列嗪)来降低猫糖尿病的高血糖和高血糖相关临床症状的方法和组合物。本文所述的方法包括特定的给药量和频率。令人惊讶的是，给药化合物1作为唯一的治疗剂对糖尿病猫提供了治疗益处，其在大多数动物中导致血清果糖胺水平低于测试实验室参考范围的正常上限，即在健康猫的正常范围内。化合物1有效地治疗没有接受任何其他抗糖尿病药物治疗的猫科动物的糖尿病。相比之下，当给糖尿病大鼠和小鼠施用化合物1时，无法使血糖水平或HbA1c恢复到正常范围。类似地，当给T2DM患者施用化合物1时，在许多情况下，需要施用额外的药物使血糖水平或HbA1c恢复到正常范围。
有利的是，化合物1不会产生低血糖。因此，施用化合物1不需要仔细控制剂量或所述剂量的时间。
此外，在某些情况下，本文所述的控制猫糖尿病的方法导致所述猫的临床缓解。
II.定义
“化合物1”是指化合物(2S，3R，4R，5S，6R)-2-(4-氯-3-(4-(2-环丙氧基乙氧基)苄基)苯基)-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三醇，具有如下所式结构：
如本文所用，“药学上可接受的形式”是指给定化合物的药学上可接受的盐、多晶、共晶和单晶形式。
如本文所用，“临床缓解”是指一种疾病的一个或多个临床措施中的持续减少、减轻或减弱，使得该指标落在从健康群体中获得的测试值的可接受范围内。这样的测试值即落在“正常范围内”。“临床缓解”并不代表停止治疗。如本文所用，“临床缓解”并不要求疾病的所有临床指标都落在正常范围内。例如，一只猫的血清果糖胺在正常范围内，但其空腹血糖高于正常范围的上限，则称其处于临床缓解状态。
如本文所用，“正常范围”取决于测试实验室的设备和程序，因此可能因实验室而异。如本文所用，当数值落在“正常范围内”时，该短语指的是在测量时提供结果的特定实验室确定的范围内。
如本文所用，“无治疗缓解”是指在停止施用治疗剂后持续的缓解状态。
如本文所用，“高血糖相关临床症状”是指多饮、多食、多尿或体重减轻中的一个或多个特征标志。体重减轻的临床症状可以通过在问诊期间直接测量猫的体重来量化。记录其他标志通常需要主人观察猫的行为或其结果。
如本文所用，当用作形容词时，单词“猫(cat)”和单词“猫(feline)”可互换使用，表示或关于来自猫(Felidae)科的动物，特别包括作为宠物或伴侣动物而饲养的该科的成员，通常属于猫(Felis)属、山猫(silvestris catus)种或猫(catus)种，并通常被称为家养猫或家猫。
如本文所用，当用作名词时，单词猫指猫科动物。
如本文所用，“控制糖尿病”或“糖尿病的控制”是指主人或其他负责照顾动物的人通过旨在减轻或治愈疾病或提供症状缓解或通过各种手段改变动物的感知健康的具体措施来处理疾病的过程。这些措施包括动物饮食的变化，包括提供特殊或处方饮食，或改变所提供食物的类型或数量，或鼓励或提供增加体力或代谢能量消耗的活动，或提供草药制剂、膳食补充剂或药物。
如本文所用，“血糖”、“血糖浓度”或“血糖水平”是指全血中葡萄糖的测量值。通常，抽取的样本是毛细血管血液，葡萄糖由护理点设备如血糖仪测量。
如本文所用，“血糖曲线”是指测定通常为8到24小时的时间段内获得的全血系列样本中葡萄糖浓度的结果，作为评估疾病控制程度和控制适当性的方式，例如，确定治疗药物的用量是否过大，是否观察到不利的低血糖。
如本文所用，“血清葡萄糖”、“血清葡萄糖浓度”或“血清葡萄糖水平”是指在允许凝固的液相全血(一般为静脉血)中测得的葡萄糖浓度。血清葡萄糖浓度通常是通过诊断测试实验室进行的自动化程序在临床操作中确定的。
如本文所用，“血清果糖胺”、“血清果糖胺浓度”或“血清果糖胺水平”是指在允许凝固的液相全血(一般为静脉血)中测得的果糖胺浓度。血清果糖胺浓度通常是通过诊断测试实验室进行的自动化程序在临床操作中确定的。
如本文所用，“血浆葡萄糖”或“血浆葡萄糖浓度”是指通过测量液相全血(通常是静脉)而获得的葡萄糖浓度，所述全血是指以不凝固的方式从血液的细胞成分中分离出来的血液。
如本文所用，“禁食”一词在用于收集用于测试的标本的情况时，表明提取标本的动物已经被剥夺进食很长一段时间，通常是6小时或更长时间，如果在早上提取标本，通常过夜。禁食样本可用于测量受喂养影响较大的分析物，如葡萄糖或脂质。
如本文所用，“高血糖相关临床体征减少”以及“相关临床体征的改善”是指从控制开始起，多饮、多食、多尿或防止体重减轻中的一个或多个体征的改善。
如本文所用，多饮的改善表示观察到水或液体消耗的频率或体积减少，或者寻找猫不经常消耗的不寻常水源的频率的减少。
如本文所用，多食的改善表示食物消耗量的减少，或者乞讨或索取异常数量食物的频率的减少，或者在异常情况下乞讨或索取食物，例如在喂食后立即乞讨或索取食物。
如本文所用，多尿的改善表示排尿频率或排尿量的减少，或与排尿有关的异常行为的减少，包括在为排尿而设置的箱子外排尿或溢出排尿箱。
如本文所用，“防止体重减轻”是指从控制开始起，体重减少不超过5％。为免生疑问，“防止体重减轻”包括从控制开始起，体重的任何增加。
如本文所用，“低血糖”的定义是指临床状态下测量的血糖浓度低于血糖ISFM定义(Sparkes等人，2015；J Feline Med Surg 17:235)的<3.0–.5mM(53–63mg dL-1)的范围的上限。为免生疑问，低血糖是指血糖<63mg dL-1。
糖尿病的临床标志包括，但不限于，血清果糖胺水平，血液或血清葡萄糖水平，或糖化血红蛋白水平。控制方案可以持续至少1、3、7、14、28天或更多天；或1、2、3、4或更多个月，或在一生的剩余时间。在一些实施例中，所述控制方案是2个月。在一些实施例中，所述临床缓解是永久性的，即一直持续到猫的余生中。在一些实施例中，实现无控制缓解。在一些实施例中，所述无控制缓解持续时间为至少1、3、7、14、28天或更多天；或1、2、3、4或更多个月，或在一生的剩余时间内。无控制缓解持续的时间将取决于许多因素，包括猫科动物，其饮食和每天的运动量。作为一个非限制性例子，临床缓解可以通过血清果糖胺水平在或低于测试实验室参考范围的正常上限来识别。作为另一个非限制性示例，通过空腹血糖水平等于或低于170mg dL-1来识别临床缓解。
如本文所用，测试实验室参考范围的“正常上限”或“ULN”是指实验室测试值范围的最小上限，该范围被认为是从健康群体中提取的样本的正常变化中找到。正常值的上限通常由测试实验室提供，与将测试结果传递给从业人员有关，并可能因实验室而异或在实验室内因时间而变化，这取决于测试校准、测试操作或标本制备。例如，在下文报告的现场研究过程中，中央实验室测试方法的改变导致血清果糖胺的正常上限从356μmol L-1变为275μmol L-1。
如本文所用，“抗糖尿病剂”是指包含药、药物或通常用于治疗人类糖尿病或动物糖尿病的药物的组合物。用于治疗人类T2DM的常见抗糖尿病药物包括但不限于α-葡萄糖苷酶抑制剂、胰淀素类似物、双胍类、二肽基肽酶4抑制剂、肠促胰岛素或肠促胰岛素类似物、胰岛素类、美格替尼、非磺酰脲类促泌剂、SGLT2抑制剂、磺脲类和噻唑烷二酮类。人们普遍认为，用于治疗人类T2DM的口服药物对猫糖尿病的治疗几乎作用不大。迄今为止，美国、欧盟或日本的监管机构尚未批准任何口服药物用于治疗猫糖尿病。
如本文所用，“低碳水化合物饮食”是指从控制开始时，猫的食物摄入量。特别是，低碳水化合物饮食是指碳水化合物的相对摄入量不超过一定阈值水平的饮食。低碳水化合物饮食通常包括来自碳水化合物的卡路里百分比少于40％、35％、30％、26％、20％、15％、12％或更低。
如本文所用，“糖尿病饮食”是指从控制开始时，猫的食物摄入量。特别是，糖尿病饮食是指具有相对较高的蛋白质和较低的碳水化合物的饮食。高含量的蛋白质包括蛋白质的卡路里百分比高于60％、65％、70％、75％、80％或更高，而低含量的碳水化合物如上文所述。在特定实施例中，糖尿病饮食不包括干猫粮。
如本文所用，“腹泻或稀便频率升高”是指腹泻或稀便的次数超过未给药动物排便次数的10％以上。如本文所用，腹泻不包括偶发原因，如细菌、病毒、球虫或肠道蠕虫的感染，而是指SGLT1抑制引起的腹泻。在一些实施方案中，“腹泻”是指在治疗过程中至少三天内每天至少发生一次稀便或液体便。
如本文所用，“SGLT抑制剂”是指对SGLT1和SGLT2都具有活性的化合物，特别是那些SGLT2活性与SGLT1活性比例良好的化合物，例如，葡萄糖尿和肠道碳水化合物吸收受损的益处伴随着不良胃肠道症状的低风险，如腹泻、大便松弛、肠胃气胀和腹胀。
如本文所用，术语“给药”是指通过口、口腔、鼻、直肠、阴道或皮肤途径或其他外部接触，或通过静脉注射、腹膜注射、肌肉注射、病灶内或皮下途径，或通过向受试者植入缓释装置或制剂，如泵、凝胶、贮存器或可蚀物质。给药可以通过任何途径，包括胃肠外和透黏膜给药(例如，口腔、鼻用、阴道给药、直肠或经皮给药)。肠外给药包括静脉注射、肌肉注射、动脉内给药、皮内给药、皮下给药、腹腔内给药、脑室内给药、鞘内给药和颅内给药。其它给药模式包括但不限于脂质体制剂、静脉输液、透皮贴剂等。
如本文所用，一种控制、诱发、减少、改善或预防紊乱、疾病或病症的方法，包括施用化合物或组合物，也可指使用化合物或组合物来控制、诱发、减少、改善或预防紊乱、疾病或症状，以及使用化合物或组合物来制备用于控制、诱发、减少、改善或预防紊乱、疾病或症状的药物。
III.猫糖尿病的治疗方法
在本发明的一些方面，本文提供了控制猫糖尿病的方法，所述方法包括给有需要的猫每天施用总剂量约为5-50mg的化合物1，或其药学上可接受的形式，其结构式如下：
在本发明的一些方面，提供了降低患有糖尿病的猫的高血糖相关临床体征的方法，所述方法包括向有需要的猫每天施用总剂量约5-50mg的化合物1或其药学上可接受的形式。
在本发明的一些方面，提供了改善患有糖尿病的猫的高血糖相关临床体征的方法，所述方法包括给有需要的猫每天施用总剂量约5-50mg的化合物1或其药学上可接受的形式。
在本发明的一些方面，提供了诱导猫糖尿病的临床缓解的方法，所述方法包括向有需要的猫每天施用总剂量约5-50mg的化合物1或其药学上可接受的形式。
在本发明的一些方面，提供了将糖尿病猫的血清果糖胺水平降低到测试实验室参考范围的正常上限以下的方法，所述方法包括向有需要的猫每天施用总剂量约5-50mg的化合物1或其药学上可接受的形式。在一些实施方案中，所述测试实验室参考的上限约为356μmol L-1或275μmol L-1。
在本发明的一些方面，提供了改善糖尿病猫血糖控制的方法，在猫的血糖曲线中所有血糖测量值都落在峰值10mmol/L(180mg dL-1)和最低点4.5mmol/L(80mg dL-1)的范围内，所述方法包括向有需要的猫每天施用总剂量约为5-50mg的化合物1或其药学上可接受的形式。
在本发明的一些方面，提供了预防糖尿病猫体重减轻的方法，所述方法包括向有需要的猫每天施用总剂量约5-50mg的化合物1或其药学上可接受的形式。
在本发明的一些方面，提供了控制表现出IGF-1浓度大于测试实验室参考范围的正常上限的猫糖尿病的方法，包括向有需要的猫每天施用总剂量约5-50mg的化合物1或其药学上可接受的形式。在一些实施例中，所述测试实验室参考的正常上限为92nmol/L。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括向有需要的猫施用低碳水化合物饮食和包含约5-50mg化合物1的每日总剂量。碳水化合物通常存在于商业猫粮中，保持低碳水化合物饮食将改善猫的临床病理。在一些实施方案中，所述低碳水化合物饮食是罐装饮食。以罐头为食的猫不会被喂食任何干猫粮。在一些实施方案中，所述低碳水化合物饮食是糖尿病饮食。糖尿病饮食通常是高蛋白低碳水化合物的饮食。在一些实施方案中，糖尿病饮食包括很少或不包括干猫粮。在一些实施方案中，所述低碳水化合物饮食是生酮饮食。生酮饮食包括富含海鲜、肉类、家禽和鸡蛋的饮食。在一些实施方案中，所述低碳水化合物饮食是无谷物饮食。
在一些实施方案中，所述低碳水化合物饮食含有少于40％的碳水化合物形式的卡路里。在一些实施方案中，所述低碳水化合物饮食含有少于35％的碳水化合物形式的卡路里。在一些实施方案中，所述低碳水化合物饮食含有少于30％的碳水化合物形式的卡路里。在一些实施方案中，所述低碳水化合物饮食含有少于26％的碳水化合物形式的卡路里。
在一些实施方案中，化合物1是(2S，3R，4R，5S，6R)-2-(4-氯-3-(4-(2-环丙氧基乙氧基)苄基)苯基)-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三醇的双脯氨酸复合物，具有如下所示结构
将所述权利要求1的双脯氨酸复合物施用给有需要的猫。关于双脯氨酸复合物的更多信息参见WO2010/022313，其内容通过引用并入本文用于所有目的。
在一些实施方案中，化合物1是(2S，3R，4R，5S，6R)-2-(4-氯-3-(4-(2-环丙氧基乙氧基)苄基)苯基)-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三醇的晶体形式，具有如下所示结构
将所述化合物1的晶体形式施用给有需要的猫。
所述化合物的结晶形式由如图1所示的X射线粉末衍射图表征。在一些实施例中，所述X射线粉末衍射(XRPD)图包括一个或多个选自下组的峰：5.4°、11.2°、11.3°、11.9°、12.9°、15.5°、16.3°、17.8°、19.1°、20.0°、20.6°、20.7°、21.2°、22.8°、23.0°、23.4°、23.6°、23.9°、24.7°、25.4°、25.8°、27.8°和28.2°θ(±0.1°2θ)，其中所述XRPD是用CuKα1辐射制作。在另一个实施方案中，所述化合物的晶体形式用XRPD表征，包括两个或更多、三个或更多、四个或更多或五个或更多选自下组的峰：5.4°、11.2°、11.3°、11.9°、12.9°、15.5°、16.3°、17.8°、19.1°、20.0°、20.6°、20.7°、21.2°、22.8°、23.0°、23.4°、23.6°、23.9°、24.7°、25.4°、25.8°、27.8°和28.2°θ(±0.1°2θ)。在其他一些实施方案中，所述化合物的晶体形式用XRPD表征，包括12.9°、19.1°和20.7°θ(±0.1°2θ)处的峰。在其他实施方案中，所述化合物的晶体形式用XRPD图表征，包括选自下组的峰：11.2°、12.9°、15.5°、17.8°、19.1°、20.0°和20.7°θ(±0.1°2θ)。在其它实施方案中，所述化合物的晶体形式用XRPD图表征，包括选自下组的峰：5.4°、11.2°、11.9°、12.9°、15.5°、16.3°、17.8°和19.1°θ(±0.1°2θ)。在其它实施方案中，所述化合物的晶体形式用XRPD图表征，包括选自下组的峰：5.4°、11.2°、11.9°和12.9°θ(±0.1°2θ)。在另一个实施方案中，所述化合物的晶体形式用XRPD图表征，包括选自下组的峰：11.2°和12.9°θ(±0.1°2θ)。在其它实施方案中，所述化合物的晶体形式用XRPD图表征，其XRPD峰基本如图2。
本发明的晶体化合物还通过基本如图3所示的拉曼光谱和基本如图4所示的峰来表征。在一些实施方案中，所述化合物的晶体形式用拉曼光谱表征，包括一个或多个选自下组的峰：353、688、825、1178、1205、1212、1608、2945、3010和3063cm-1。在另一个实施方案中，所述化合物的晶体形式用拉曼光谱表征，包括两个或更多、三个或更多、四个或更多、或五个或更多峰。在其他实施方案中，所述化合物的晶体形式用拉曼光谱表征，包括选自下组的峰：约353、688和825cm-1。在其他一些实施方案中，所述化合物的晶体形式用拉曼光谱峰表征，所述拉曼光谱峰基本如图4所示。
在一些实施方案中，所述化合物1的治疗有效量为约5mg-50mg的每日总剂量(例如，约5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、22.5、25、30、35、40、45或50mg天-1)。在一些实施方案中，化合物1的每日总剂量约为10-20mg。在一些实施方案中，化合物1的每日总剂量约为15mg。
化合物1可通过许多合适的途径施用给猫。在一些实施方案中，化合物1口服给药。下文将讨论进一步的控制方法。
在一些实施方案中，化合物1与附加治疗剂联合给药。在一些实施方案中，化合物1作为单一疗法给药。也就是说，当化合物1是给猫服用的唯一抗糖尿病药物时，在治疗猫糖尿病方面具有积极的治疗益处。
有利地，化合物1的施用不需要与进食或其他事件同时进行。在一些实施例中，所述每日总剂量每天给药一次，与其他活动无关(包括用餐时间)。在一些实施例中，所述每日总剂量每天给药两次，与其他活动无关(包括用餐时间)。在一些实施方案中，所述剂量与猫的食物混合。在一些实施方案中，所述剂量作为单一固体剂型递送给猫。在一些实施方案中，所述剂量以口服溶液或口服混悬液的形式递送。在一些实施例中，所递送的最大流体体积为1mL。在一些实施方案中，所递送的最大体积为0.5mL。在一些实施方案中，所述剂量根据猫的体重来调整。在一些实施方案中，为所有猫提供单一剂量强度。
在治疗过程中，可监测血清果糖胺水平和/或血液或血清葡萄糖水平，以作为血糖控制的证据。多尿、多饮、多食或体重减轻等临床症状也可监测。如果糖尿病的症状持续存在，可改变控制计划，纳入其他特征，包括其他药物。
当猫保持临床病情缓解时，所述猫维持从所接受的治疗方案中获得的积极治疗益处。在一些实施方案中，当猫没有出现一个或多个猫糖尿病的临床症状时，维持临床缓解。如上所述，猫糖尿病的症状包括血清果糖胺水平升高、血液或血清葡萄糖水平升高、多尿、多饮和多食。
在一些实施方案中，维持临床缓解的猫是由猫的血清果糖胺水平决定的。在一些实施方案中，将猫的血清果糖胺水平与测试实验室参考范围的正常上限进行比较。在一些实施方案中，所述测试实验室参考的上限约为356μmol L-1或275μmol L-1。在一些实施方案中，临床缓解中的猫表现出血清果糖胺水平处于或低于测试实验室参考范围的正常上限。在一些实施方案中，临床缓解中的猫表现出血清果糖胺水平处于或低于360μmol L-1。在一些实施方案中，临床缓解中的猫表现出血清果糖胺水平处于或低于350μmol L-1。在一些实施方案中，临床缓解中的猫表现出的血清果糖胺水平处于或低于标本所提交的测试实验室的正常上限。
在一些实施方案中，维持临床缓解的猫是由猫的血液或血清葡萄糖水平决定的。在一些实施方案中，处于临床缓解中的猫的血液或血清葡萄糖水平维持在低于250mg dL-1。在一些实施方案中，处于临床缓解中的猫的血液或血清葡萄糖水平维持在低于200mg dL-1。在一些实施方案中，处于临床缓解中的猫的血液或血清葡萄糖水平维持在低于190mg dL-1。在一些实施方案中，处于临床缓解中的猫的血液或血清葡萄糖水平维持在低于180mg dL-1。在一些实施方案中，处于临床缓解中的猫的血液或血清葡萄糖水平维持在低于170mg dL-1。在一些实施方案中，处于临床缓解中的猫的血液或血清葡萄糖水平维持在低于160mg dL-1。在一些实施方案中，处于临床缓解中的猫的血液或血清葡萄糖水平维持在低于150mg dL-1。
本文所述的方法减少、减轻或消除猫糖尿病的症状。例如，在一些实施方案中，在控制方案完成后测量的猫的血清果糖胺水平在所述猫中降低。在一些实施方案中，在控制方案完成后测量的猫的血液或血清葡萄糖水平在所述猫中降低。
在一些实施方案中，在所述控制方案完成后，猫的血清果糖胺水平降低至少约20％。在一些实施方案中，在所述控制方案完成后，猫的血清果糖胺水平降低至少约30％。在一些实施方案中，在所述控制方案完成后，猫的血清果糖胺水平降低至少约40％。在一些实施方案中，在所述控制方案完成后，猫的血清果糖胺水平降低至少约50％。
在一些实施方案中，在所述控制方案完成后，猫的血清果糖胺水平低于测试实验室参考范围的正常上限。在一些实施方案中，所述测试实验室参考的上限约为356μmol L-1或275μmol L-1。在一些实施方案中，在所述控制方案完成后，猫的血清果糖胺水平低于500μmol L-1。在一些实施方案中，在所述控制方案完成后，猫的血清果糖胺水平低于450μmol L-1。在一些实施方案中，在所述控制方案完成后，猫的血清果糖胺水平低于400μmol L-1。在一些实施方案中，在所述控制方案完成后，猫的血清果糖胺水平低于350μmol L-1。
在一些实施方案中，在所述控制方案完成后，猫的血液或血清葡萄糖水平降低至少约20％。在一些实施方案中，在所述控制方案完成后，猫的血液或血清葡萄糖水平降低至少约30％。在一些实施方案中，在所述控制方案完成后，猫的血液或血清葡萄糖水平降低至少约40％。在一些实施方案中，在所述控制方案完成后，猫的血液或血清葡萄糖水平降低至少约50％。
在一些实施方案中，在所述控制方案完成后，猫的血液或血清葡萄糖水平低于250mg dL-1。在一些实施方案中，在所述控制方案完成后，猫的血液或血清葡萄糖水平低于200mg dL-1。在一些实施方案中，在所述控制方案完成后，猫的血液或血清葡萄糖水平低于190mg dL-1。在一些实施方案中，在所述控制方案完成后，猫的血液或血清葡萄糖水平低于180mg dL-1。在一些实施方案中，在所述控制方案完成后，猫的血液或血清葡萄糖水平低于170mg dL-1。在一些实施方案中，在所述控制方案完成后，猫的血液或血清葡萄糖水平低于160mg dL-1。在一些实施方案中，在所述控制方案完成后，猫的血液或血清葡萄糖水平低于150mg dL-1。
如上所述，对SGLT1的活性低于对SGLT2的活性是有利的，SGLT1抑制可引起腹泻。因此，本发明的SGLT抑制剂提供了猫糖尿病治疗中的药效作用，其剂量水平低于不良肠道效应的阈值水平。因此，在另一方面，本发明提供了控制猫糖尿病的方法，其包括向有需要的猫施用有效量的SGLT抑制剂，其中所述有效量不超过导致健康猫腹泻或稀便频率升高所需剂量的10％至30％。在一些实施例中，所述健康猫以商业干粮为食。在一些实施方案中，所述健康猫是指在施用SGLT抑制剂之前没有表现出腹泻或稀便频率升高的猫。在一些实施例中，所述健康猫没有糖尿病。
在一些实施方案中，所述有效量不超过致使健康猫腹泻加剧或稀便所需剂量的10、12、16、18、20、22、24、26、28或30％。在一些实施方案中，所述有效量不超过致使健康猫腹泻加剧或稀便所需剂量的30％。在一些实施方案中，所述有效量不超过致使健康猫腹泻加剧或稀便所需剂量的20％。在一些实施方案中，所述有效量不超过致使健康猫腹泻加剧或稀便所需剂量的10％。
有效量包括产生所述SGLT抑制剂最大药效作用的至少90％的剂量。
本文还提供了控制猫糖尿病的方法，所述方法包括向有需要的猫施用有效量的SGLT抑制剂，其中所述SGLT抑制剂以不低于所述有效量的3至10倍的剂量致使健康猫腹泻或稀便的频率升高。在一些实施例中，所述健康猫以商业干粮为食。在一些实施方案中，所述健康猫是在治疗前没有表现出腹泻或稀便频率升高的猫。在一些实施例中，所述健康猫没有糖尿病。
在一些实施方案中，所述SGLT抑制剂以不低于有效量的3、4、5、6、7、8、9或10倍的剂量致使健康猫腹泻或稀便的频率升高。在一些实施方案中，所述SGLT抑制剂以不低于有效量3倍的剂量致使健康猫腹泻或稀便的频率升高。在一些实施方案中，所述SGLT抑制剂以不低于有效量5倍的剂量致使健康猫腹泻或稀便的频率升高。在一些实施方案中，所述SGLT抑制剂以不低于有效量10倍的剂量致使健康猫腹泻或稀便的频率升高。
有效量包括产生所述SGLT抑制剂最大药效作用的至少90％的剂量。
本文所述的方法可用于控制所有形式的猫糖尿病。在一些实施方案中，所述猫糖尿病是1型糖尿病。在一些实施方案中，所述猫糖尿病是2型糖尿病。
IV.药物组合物
化合物1可制备成适合递送给受试者的各种组合物。适合给受试者服用的组合物通常包括化合物1(或其药学上可接受的形式)和药学上可接受的载体。
化合物1可并入多种制剂中用于治疗性给药。更具体地说，化合物1可以通过与适当的药学上可接受的载体或稀释剂一起或单独配制成药物组合物，并且可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，如片剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒剂、制剂、凝胶剂、浆液、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。因此，可以以各种方式实现本发明化合物的给药，包括口服、口腔、胃肠外、静脉内、皮内(例如，皮下、肌肉内)、透皮等。此外，化合物1可以局部而不是全身给药，例如，通过储存制剂或缓释制剂中给药。
用于施用化合物1的药物组合物可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学和药物递送领域中已知的任何方法来制备。所有方法包括使活性成分与含有一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。一般而言，药物组合物通过使活性成分与液体载体或细碎的固体载体或两者均匀且紧密地结合来制备，然后，如果需要，将产品成型为所需的制剂。
适用于本发明的制剂参见雷明顿：《药学科学与实践》，第21版，Gennaro编，利平科特威廉姆斯&威金斯(LWW)(2003年)，现通过引用并入本文。本文所述的药物组合物可以以本领域技术人员已知的方式制造，即通过常规的混合、溶解、造粒、制粒、粉碎、乳化、包封、包埋或冻干方法。以下方法和赋形剂仅为示例性的，并不以任何方式限制。
在一些实施方案中，化合物1被制备成缓释、控制释放、延长释放、定时释放或延迟释放制剂，例如在含有治疗剂的固体疏水聚合物的半透性基质中递送。已经建立了各种类型的缓释材料，并为本领域技术人员所熟知。目前的缓释制剂包括薄膜包衣片剂、多颗粒或微丸系统、使用亲水或亲脂材料的基质技术以及含有成孔赋形剂的蜡基片剂(例如，参见Huang等人，药物开发与工业制药，29：79(2003)；皮尔恩乔布等人，药物开发与工业制药，29：925(2003)；Maggi等人，欧洲药剂学和生物药剂学杂志，55：99(2003)；Khanvilkar等人，药物开发与工业制药，216216228：601(2002)；以及施密特等人，国际药剂学杂志，216 9(2001))。根据其设计，缓释递送系统可以在数小时或数天内释放化合物，例如在4、6、8、10、12、16、20、24小时或更长时间内释放化合物。通常，缓释制剂可以使用天然或合成聚合物制备，例如，聚合物乙烯基吡咯烷酮，如聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)；羧基乙烯基亲水性聚合物；疏水和/或亲水性亲水胶体，如甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素；和羧基聚亚甲基。
所述缓释或延长释放制剂也可以使用天然成分制备，如矿物质，包括二氧化钛、二氧化硅、氧化锌和粘土(参见美国专利6,638,521，通过引用并入本文)。可用于递送化合物1的示例性缓释制剂(以本文所述的任何形式)包括美国专利6,635,680；6,624,200；6,613,361；6,613,358,6,596,308；6,589,563；6,562,375；6,548,084；6,541,020；6,537,579；6,528,080和6,524,621中描述的那些，其中每一项专利均通过引用并入本文。特别相关的控制释放制剂包括美国专利6,607,7516,599,529；6,569,463；6,565,883；6,482,440；6,403,597；6,3199,919；6,150,354；6,080,736；5,672,356；5,472,704；5,445,829；5,312,817和5,296,483中描述的那些，其中每一项专利均通过引用并入本文。本领域技术人员将轻易认识搭配其他可应用的缓释制剂。
对于口服给药，化合物1可通过与本领域公知的药学上可接受的载体结合而轻易配制。这样的载体使化合物能够配制成片剂、药丸、糖衣丸、胶囊剂、乳剂、亲脂性和亲水性悬浮液、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，供有需要的患者口服。口服药物制剂可通过将所述化合物与固体赋形剂混合，任选地研磨所得混合物，并加工颗粒混合物，若有需要，添加合适的助剂，获得片剂或糖衣丸核。合适的赋形剂尤其是填料，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂，例如，玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基-纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。若需要，可以加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，如海藻酸钠。
本发明的片剂含有与适于制造片剂的无毒的药学上可接受的赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂可以是，例如惰性稀释剂，如纤维素、二氧化硅、氧化铝、碳酸钙、碳酸钠、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；造粒剂和崩解剂，例如，玉米淀粉，或者海藻酸；结合剂，例如PVP、纤维素、PEG、淀粉、明胶或阿拉伯胶，和润滑剂，例如硬脂酸镁，硬脂酸或滑石粉。片剂可以是未包衣的或可以是包衣的，肠溶或以其他方式，通过已知的技术来延缓在胃肠道中的崩解和吸收从而提供较长时期的持续作用。例如，可以采用延时材料如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。它们也可以用包衣以形成用于控释的渗透治疗片剂。
可口服使用的药物制剂包括明胶制成的推入式胶囊，以及由明胶和如甘油或山梨糖醇的增塑剂层制成的软密封胶囊。推装胶囊可以含有与填料如乳糖、粘合剂如淀粉和/或润滑剂如滑石或硬脂酸镁以及任选的稳定剂的混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可以溶解或悬浮在合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，还可以加入稳定剂。所有用于口服制剂的剂量都应适合此类给药。
用于口服使用的制剂也可以为硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂例如微晶纤维素、乳糖、淀粉、预糊化淀粉或高岭土，或者为软明胶胶囊，其中，活性成分为水或油介质，例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。另外，乳剂可以用非水混溶性成分如油制备以及用表面活性剂如单甘油二酯，PEG酯等等来稳定。
在某些情况下，化合物1可以通过注射，例如，通过团注或连续输注配制用于胃肠外给药。对于注射，所述化合物可以通过将其溶解、悬浮或乳化在水性或非水性溶剂中而配制成制剂，如植物油或其他类似的油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙二醇；若有需要，可以使用常规添加剂，如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。优选地，化合物1可以在水性溶液中配制，优选在生理相容的缓冲液中配制，如Hank溶液、林格溶液或生理盐水缓冲液。注射用制剂可以以单位剂型呈现，例如安瓿或多剂量容器，并添加防腐剂。所述组合物可以呈现含油或含水载体中的悬浮液、溶液或乳液等形式，并且可以包含诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂等试剂。
用于胃肠外给药的药物制剂包括水溶性形式化合物1(本文所述的任何形式)的水溶液。此外，化合物1的悬浮液可以制备为适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，如芝麻油，或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或试剂，增加化合物的溶解度以制备高浓度溶液。或者，化合物1可以是粉末形式，在使用前与合适的载体例如无菌无热原水组成。
全身给药也可以通过经黏膜或经皮的方式。对于经粘膜或经皮给药，制剂中使用适合待渗透屏障的渗透剂。对于外部给药，化合物1可以被配制成软膏、霜剂、药膏、粉剂和凝胶。在一个实施方案中，所述透皮递送剂是DMSO。透皮给药系统可以包括，例如，贴剂。对于经粘膜给药，制剂中使用适合待渗透屏障的渗透剂。这种渗透剂是本领域公知的。可用于本发明的经皮给药制剂包括美国专利6,589,549、6,544,548、6,517,864、6,512,010、6,465,006、6,379,696、6,312,717和6,310,177中描述的那些制剂，其中每一项专利均通过引用并入本文。
除了前文所述的制剂之外，化合物1还可以配制成长效制剂。这种长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌肉内)或肌肉注射给药。因此，例如，化合物1可以与合适的聚合物或疏水材料(例如在可接受的油中作为乳液)或离子交换树脂配制，或作为微溶衍生物配制，例如作为微溶络合物或盐配制。
所述药物组合物还可以包括合适的固相或凝胶相载体或赋形剂。此类载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物，如聚乙二醇。
V.药物制剂
本公开包括化合物1的新药物剂型，或其药学上可接受的形式。本文所述的剂型适合于口服给予受试者。所述剂型可以是任何适合口服给药的形式，包括但不限于胶囊或片剂。
在一些实施方案中，本发明提供了一种单个单位剂量胶囊或片剂形式，其含有5-50mg化合物1(贝沙格列嗪)，或其晶体形式，其结构式如下：
在一些实施方案中，化合物1的量为约10-20mg。在一些实施方案中，化合物1的量约为15mg。
在一些实施方案中，化合物1的单个单位剂型是胶囊。在一些实施方案中，化合物1的单个单位剂型是片剂。
在一些实施例中，单个单位剂型为尺寸选自下组的胶囊：#0、#1、#2、#3、#4或#5。在一些实施方案中，单个单位剂型是尺寸为#4的胶囊。在一些实施方案中，单个单位剂型是尺寸为#5的胶囊。
VI.试剂盒
本文还提供了包含化合物1的药物组合物和剂型或其制剂的试剂盒。
在某些方面，本发明提供了一种包含化合物1的试剂盒。本文所述的一些试剂盒包括一个描述施用化合物1的方法的标签。本文所述的一些试剂盒包括一个描述治疗猫糖尿病的方法的标签。在一些实施方案中，本文描述的试剂盒包括一个描述降低猫的血清果糖胺和/或血液或血清葡萄糖水平的方法的标签。
本发明的组合物，包括但不限于，美国食品和药物控制局(FDA)或其他监管机构批准的瓶、罐、小瓶、安瓿、管或其他容器封闭系统的包含化合物1的组合物，其可提供含有化合物1的一种或多种剂量。包装或分配器还可随附与容器有关的通知，通知的格式由控制药品的制造、使用或销售的政府机构规定，该通知表明该机构的批准。在本发明的一些方面，所述试剂盒包括如本文所述的制剂或组合物、包含所述制剂的容器封闭系统或包括所述制剂的剂量单位形式，以及描述如本文所述使用方法的通知或说明书。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例用于说明本发明而不用于限制本发明。本领域技术人员将容易认识到各种非临界参数，这些参数可以被改变或修改以产生基本相同的结果。
实施例1.贝沙格列嗪对糖尿病小鼠的影响
在研究350中，在遗传性糖尿病db/db小鼠中检测了贝沙格列嗪(作为2:1脯氨酸：贝沙格列嗪共晶)的作用。用血糖仪(一触式超强生(LifeScan)血糖监测系统)测量血糖。一般来说，血液是从尾巴上的伤口中获得的。当血糖值高于血糖仪定量上限33.3mmol/L时，从眶丛中取2滴血，用含肝素的抗凝微离心管收集，随后进行稀释和血糖测量。表1中的贝沙格列嗪质量约为2:1成分质量的2/3。
通过灌胃给药，每天给动物服用载体或脯氨酸：贝沙格列嗪共晶体，持续28天。每天在上午10:00至下午12:00之间对动物进行给药。每4天测一次体重，并根据最近一次体重调整剂量。给药量为10mL/kg体重。每天观察所有动物，并记录任何异常发现。分别在第-3、0、1、7、14、21和28天的给药后6h进行血糖浓度测定。
如表1所示，除0.1mg kg-1组外，所有治疗组中的非空腹血糖组在第1、7、14、21、28天均明显低于对照组。在给药6小时后，贝沙格列嗪以剂量依赖性方式降低db/db小鼠的非空腹血糖水平。分别施用0.067、0.2、0.67和2mg kg-1贝沙格列嗪28天后，动物血糖值分别为对照组的79.74％、56.33％、51.81％和53.25％。尽管这些数据表明贝沙格列嗪是糖尿病小鼠的有效抗糖尿病药物，但没有一个剂量组的血糖浓度正常化落在非糖尿病范围内。对于C57/BL6系(db/db小鼠的非糖尿病参考品系)的空腹小鼠，据报道平均空腹血糖为7.3mM(131mg dL-1；Andrikopoulos等人，2005年；内分泌杂志(2005)187：45)。通常，血糖水平大于180mg dL-1被认为是糖尿病的标志。然而，在db/db小鼠中，作为单独药物的贝沙格列嗪不能将血糖降低到300mg dL-1以下。
表1贝沙格列嗪治疗对db/db小鼠非空腹血糖浓度(mg dL-1)的影响
*P<0.05,**p<0.01vs.对照组
每日一次，连续4周口服化合物或载体。在给药后6小时，使用血糖仪测定不禁食情况下的血糖。
表1贝沙格列嗪治疗对db/db小鼠非空腹血糖浓度(mg dL-1)的影响
数值表示平均值±SD(n＝8)。以超过贝沙格列嗪(如图所示)质量1.5倍的剂量分别给各组施用贝沙格列嗪/脯氨酸共晶。
实施例2.贝沙格列嗪对糖尿病大鼠的影响
在研究338中，在遗传性糖尿病ZDF大鼠中检测了贝沙格列嗪(作为2:1脯氨酸：贝沙格列嗪共晶)的作用。从雄性ZDF大鼠的隐静脉中采集血液，置于含有氟化钠和草酸钾的Capijet管中(批号：HA0931；特鲁莫医疗公司)，并用于测定非禁食血糖水平。用基于己糖激酶方法学的比色法(葡萄糖-SL法：诊断化学有限公司)分析血浆葡萄糖水平。在分析前，根据制造商的说明，血浆样品需要用0.9％的生理盐水进行1：2稀释。
连续28天每日一次，在上午9:00-11:00间分别给动物灌胃口服载体(10％PEG400)或以下四种剂量水平(0.067、0.2、0.67和2.0mg kg-1)中的一种剂量的实验化合物。每周测体重3次，并相应调整剂量。每周测量3次食物(普瑞纳5008；配方饮食)和水消耗量，并估计每天的数值。在代谢笼中收集尿液时记录24小时食物和水的消耗。每天观察所有动物，并记录任何异常发现。
在第7、14和21天，从大隐静脉(Capiject批次#HA0931；特鲁莫医疗公司)采集血液样本，用于测定血浆葡萄糖水平，随后口服化合物或载体。
每日口服贝沙格列嗪治疗可在7天内显著降低血糖水平。在开始给药时，各组之间的血糖没有显著差异，因为研究组的组成是为了最小化该变量的组间差异(F(4,45)＝0.04；p＝0.99)。在治疗第7天，观察到血糖水平明显下降(F(4,45)＝3.99；p＝0.007)；两两比较显示，与载体对照组(表2)相比，除最低剂量组外，接受贝沙格列嗪的各组的血糖水平均较低(0.2和0.67mg kg-1组的p<0.05，2.0mg kg-1组的p<0.01)。基线的降幅仍然显著(F(4,45)＝4.05；p＝0.007)，后续比较再次表明除贝沙格列嗪为0.067mg kg-1组外，其他所有组的降幅均显著高于(0.3和1.0mg kg-1组的p<0.05；3.0mg kg-1组的p<0.01)对照组中观察到的血糖水平的增幅(表2)。7天后观察到的血糖水平变化如下：+2.8％、-16.8％、-17.1％和-25.3％，分别对应贝沙格列嗪0.067、0.2、0.67和2.0mg kg-1，载体对照组为+9.6％。
治疗2周后，观察到血糖水平下降(F(4,45)＝12.3；p＜0.0001)；两两比较显示，与载体对照组p＜0.01相比，除了0.067mg kg-1贝沙格列嗪组，各组的血糖水平均显著较低，即贝沙格列嗪在0.2、067、2.0mg kg-1时(图1和表1)。同样，治疗2周后，基线治疗的降幅也显著(F(4,45)＝5.13；p＝0.002)，贝沙格列嗪在2.0mg kg-1时产生的降幅显著大于载体组的降幅(p<0.01)(表2)。14天后，观察到贝沙格列嗪在0.067、0.2、0.67、2.0mg kg-1时，血糖变化分别为+9.5％、-5.6％、-8.1％和-25.1％，载体对照组为+17.0％。
类似地，治疗3周后，血糖水平显著降低(F(4,44)＝7.77；p＜0.0001)；在接受0.3、1.0和3.0mg kg-1的EGT0001474组，血糖水平显著较低(分别为P＜0.05，＜0.01和＜0.01)(表2)。基线的降幅仍然显著(F(4,44)＝3.36；p＝0.017)，贝沙格列嗪在2.0mg kg-1时产生的降幅显著大于载体组的降幅(p<0.01)(表2)。21天后观察到的血糖水平变化如下：+15.5％、+4.3％、+1.5％和-15.4％，分别对应贝沙格列嗪0.067、0.2、0.67和2.0mg kg-1，载体对照组为+25.5％。在第21天抽血前，一只接受0.67mg kg-1贝沙格列嗪的大鼠因垂死而被安乐死。尸检结果表明，在给药的前几周，该动物可能吸入了一些给药溶液。这一效果被认为与供试品无关。在第7天和第14天，保留安乐死动物的数据，但不保留第21天的分析(因此，F统计量分母中的自由度减少)。
尽管这些数据表明贝沙格列嗪是糖尿病大鼠的有效抗糖尿病药物，但没有一个剂量组的血糖浓度正常化落在非糖尿病范围内。通常，血糖水平大于180mg dL-1被认为是糖尿病的标志。然而，在ZDF大鼠中，作为单独药物的贝沙格列嗪不能将血糖降低到287mg dL-1以下(表2)。
表2口服贝沙格列嗪对雄性Zucker糖尿病肥胖大鼠血糖水平的长期影响。
a.各组均以比贝沙格列嗪质量大1.5倍的剂量施用贝沙格列嗪/脯氨酸(如图所示)。
b.在第21天采血前实施安乐死；第0天的n＝10，但第21天和第21δ天，n＝9(因此，减去平均值得出的值与表中所示值不同：-10.2g)。
前面的研究表明，给糖尿病啮齿动物服用贝沙格列嗪可显著改善其疾病的严重程度，但不会使动物恢复到正常血糖状态或产生正常范围内的血糖水平。
实施例3.体外贝沙格列嗪对猫SGLT1和SGLT2转运蛋白的影响
在研究5中，将编码猫SGLT2的DNA片段插入巨细胞病毒即刻早期蛋白增强子/鸡β-肌动蛋白启动子下游，在哺乳动物表达载体pNL715的SalI和Hind III位点之间插入兔β-珠蛋白内含子(CAG启动子)(pPB-CAG-SGLT2Cat-IRES-EGFP；中国上海张江高科技园区哈雷路4楼1118号白鹭制药上海公司，邮编：201203)。质粒表达盒两侧为PiggyBac转座子倒置末端重复序列，包含一个内部核糖体进入位点(IRES)，位于增强型上游GFP开放阅读框和牛生长激素多聚腺苷酸化信号。通过限制性内切酶裂解分析鉴定含有所需cDNA插入物的质粒。类似地，将编码猫SGLT1的质粒(pNL717)插入到SalI和Hind III位点，创建pPB-CAG-SGLT1Cat-IRES-EGFP(上海白鹭制药有限公司)。通过聚合酶链反应将cDNA克隆fSGLT1编码区891位的C-to-T转换突变(在氨基酸残基297处创建终止密码子)恢复为野生型序列。逆转恢复了表达质粒的活性。
根据制造商建议的方案，使用Lipofectamine 3000(赛默飞公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)将猫SGLT表达质粒DNA转染到Cos-7细胞中。在转染前24小时，将细胞以大约3×106个细胞/孔接种在每个孔含有10mL培养基的100mm培养皿中，并在转染时达到95％以上的融合率。转染后24小时，用胰蛋白酶收集转染细胞，并将其接种到添加10％FBS、2mM谷氨酰胺、100μLDMEM/孔的96孔聚D-赖氨酸涂层闪烁板(珀金埃尔默)中，然后在37℃下5％CO2的气氛中培养48小时。转染细胞保存在含有10％二甲基亚砜的DMEM中，并于-195℃下冷冻保存，或通过甲基-α-D-[U-14C]吡喃葡萄糖苷(AMG)摄取试验评估转运蛋白活性。
用150μL钠缓冲液(137mM NaCl、5.4mM KCl、2.8mM CaCl2、1.2mM MgCl2、10mMTris/HEPES、pH 7.2)或无钠缓冲液(137mM N-甲基葡萄糖胺、5.4mM KCl、2.8mM CaCl2、1.2mM MgCl2、10mM Tris/HEPES、pH 7.2)洗涤表达SGLT1或SGLT2的转染细胞(每孔4×104个细胞)两次。将50μL含有40μCi/mLα-甲基-D-吡喃葡萄糖苷(AMG；Perkin Elmer)的无钠缓冲液或50μL含有8μCi/mL AMG、10％猫血浆和所需浓度的贝沙格列嗪的钠缓冲液添加到培养板的每个孔中，并在37℃下摇动培养1h。用150μL磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞两次，使用1450型微β孔板闪烁计数器(Perkinlemer公司)对覆盖有TopSeal(珀金埃尔默)和AMG摄取的平板进行定量。使用GraphPad Prism(科学直观软件)分析AMG摄取结果。用具有可变斜率的非线性回归计算IC50。
在10％猫血浆存在下，贝沙格列嗪对猫SGLT1和SGLT2表现出高效力，IC50值分别为23.8nM和412pM。与其对同源人类转运体的活性相比(Zhang等人，药理学研究63:2842011)，贝沙格列嗪对猫SGLT2的活性高5倍，对猫SGLT1的活性高235倍。
实施例4.贝沙格列嗪对非糖尿病猫的影响
在研究1和研究2中，将明胶胶囊配制的贝沙格列嗪给予健康饲养的猫，并在给药后24小时内记录尿糖排泄。要么给猫施药一次(qd)，要么施药两次(bid)(后者在第0小时和第12小时)。如图5所示，在大约3mg kg-1的剂量下，观察到最大葡萄糖尿，每天给药两次仅比每天给药一次的效果略好。暴露于高剂量贝沙格列嗪的猫，其稀便和/或腹泻的严重程度与剂量程正相关，这一效果与(并归因于)该药物对肠道SGLT1的抑制作用一致。鉴于对猫SGLT2较低的体外选择性，贝沙格列嗪在猫体内的药理作用可能是抑制SGLT1和SGLT2的结果。
由SGLT1抑制产生的不良效应的检测剂量比产生最大药效的剂量高5至10倍，因此贝沙格列嗪对猫SGLT1的效力似乎接近最佳。如果抗SGLT1的效力更高，最大药效作用和不希望的副作用之间的重叠将随之而来。
在研究3中发现了贝沙格列嗪对猫SGLT1具有理想效力的进一步证据，在该研究中，健康猫每日两次服用15mg kg-1贝沙格列嗪(30mg kg-1d-1)，持续21天。如图6所示，在整个研究过程中，猫体重减轻，这是由于葡萄糖尿和腹泻共同导致的热量流失。给药结束后，所有猫的体重都增加。因为糖尿病猫通常出现体重减轻的结果，腹泻的程度显然是不利的，且与治疗不相容。因此，比产生最大药效作用的高十倍的剂量不能持续使用。幸运地是，贝沙格列嗪对SGLT1的作用不足以在产生最大药效作用的剂量下引起腹泻，但仍足以在最大有效剂量的相对较低倍数下，提供明显的继发性肠抑制证据。
实施例5.贝沙格列嗪对糖尿病猫的影响
在一项现场有效性研究中，客户养的猫被诊断为糖尿病，其依据是：i)两次单独的禁食(≥6h)血糖测量值>250mg dL-1；ii)糖尿；iii)果糖胺>450μmol L-1(由于测试实验室方法的改变后来改为>360μmol L-1)，以及iv)以下一种或多种情况：多尿/多饮、多食和/或体重减轻(在猫的医疗记录中有记录)。在第1次访视期间(第0天之前7天)，对疑似糖尿病的猫进行评估。在第2次访视(第0天)期间登记合格的猫，并开始每天口服一次贝沙格列嗪进行治疗。给猫开具糖尿病动物的饮食(Purina DM，干或湿品种)。在第3次访视(第14±3天)、第4次访视(第28±3天)和第5次访视(第56±3天)期间，将猫返回诊所进行血糖控制评估。治疗期为第2次访视(第0天)到第5次访视(第56±3天)。如果主人或研究人员认为有必要，可以在任何计划外的访视期间将猫带回诊所。从第2次访视开始(第0天)起，每次访视均进行8小时血糖曲线(每2小时±15分钟采集一次血液样本，持续8小时)，并使用AlphaTRAK 2血糖仪(雅培实验室)测量血糖。用于血液学和血清化学的血液样本在筛查时和在开始给药后的每次预定访视期间收集。在中心实验室评估所有临床病理样本(血液、血清和尿液)，这些样本未在临床上进行血糖曲线分析。血清化学包括果糖胺的评估。在研究过程中，中心实验室测量方法的改变导致正常上限(ULN)从356μmol L-1变为275μmol L-1。为了适应参考范围的变化，数据以正常值上限的百分比表示，用非结构化协方差重复测量ANCOVA进行分析，访视为固定效应。检测实验室空腹血糖的正常上限为155mg dL-1。在32只猫完成第56天的访视后，制出了下列表格。
在这项研究中，主人认为接触贝沙格列嗪的猫在多饮、多食和多尿方面有改善。在三个主人评估的体征中，发现多食症改善的可能性最小。虽然贝沙格列嗪会引起热量损失，但也经常观察到体重增加。
通过测量血清果糖胺的正常化，血糖控制明显良好。在完成这项研究的32只猫中，有26只的果糖胺浓度低于参考实验室测试范围的正常上限。没有一只猫表现出症状性低血糖，这与健康动物的研究结果一致，健康动物的研究结果表明，数倍高于预期临床剂量的贝沙格列嗪不会产生低血糖。
研究发现，SGLT2基因缺陷的小鼠和人类血糖正常，这也预示着不会出现低血糖症。
三只猫显示血清胰岛素样生长因子-1(IGF-1)升高，鉴于肢端肥大症与胰岛素抵抗和胰岛素难治性糖尿病的已知关联，可以合理的认为肢端肥大症对其疾病病因具有潜在贡献。所有三只IGF-1升高的猫都达到了正常的果糖胺浓度，并完成了研究以及为期四个月的安全评估延长期。随后，IGF-1浓度最高的猫被证实为肢端肥大症。研究完成后，猫每天需要11单位胰岛素，临床表现不佳。
记录了主人评定或兽医评定的猫健康或身体状况的改善情况，其中许多变化达到了统计显著性。如果表现明显，酮血症通常在研究过程中得到纠正。本研究采用了一种经过验证的调查工具，旨在测量猫糖尿病对主人生活质量的影响，并检测到主人生活质量上有统计学显著的改善。
详细研究结果
在第56±3天，将每只猫分类为实现(或未实现)血糖控制(成功/失败)。将治疗成功定义为至少一种血糖变量的改善(BG平均值<250mg dL-1；或者果糖胺<450μmol/L或<360μmol/L，取决于分析时的测定参考范围)，以及兽医在最终评估时对充分血糖控制的评估。如表3所示，40只猫中有32只认为是治疗成功的(80％)。所有继续研究到V5的猫都被认为是治疗成功的。在视为治疗失败的8只猫中，有6只在SAE后从研究中移除，1只应捐助者的要求被移除，1只因使用研究禁止的药物来治疗AE而被移除。表3还记录了实现果糖胺浓度低于正常上限(最初为356μmol L-1，随后为275μmol L-1)的猫。
表3治疗成功评价
猫急性糖尿病的临床体征包括体重减轻、多尿、多饮和多食。所有这些都被认为是继发于由于葡萄糖排尿引起的热量浪费，这在血糖浓度超过葡萄糖尿的肾脏阈值后表现出来。由于贝沙格列嗪降低了肾脏的糖尿阈值，预计它会加剧高血糖的临床症状。然而，如果贝沙格列嗪将血糖尿升高到可以显著降低血糖浓度的程度，那么一旦血糖浓度恢复正常，净效果可能是降低肾小球总葡萄糖流量。归一化后，高血糖的临床体征的严重程度可能会降低。从研究队列中收集的数据表明，后一种效应可能存在。
评估糖尿病临床体征的责任由主人和治疗兽医分担。兽医每次访视时记录体重，主人每次访视时记录多饮、多尿和多食的迹象，使用四分(0到3)整数分数，低分数代表良好的评级。
除了提供猫状态的测量值作为时间的函数外，定量评估还用于在研究完成时产生成功或失败的二元结果。用体重来评分成功，第5次就诊时的体重超过第2次就诊时的体重(开始治疗)。用其他标志物评分成功，第5次就诊时主人的评分低于第2次就诊时主人的评分。
表4显示了定量评估中每只猫的二元结果。任何退出研究的猫在所有类别中都被评为失败(0)。表4的最后一行给出了每一列的总和，或者按列标准计算的总成功次数。在31只猫身上观察到至少一种临床症状(“任何成功”一栏)的改善，比被发现的少一只实现了血糖控制。示例5血糖控制成功，但临床症状失败。对于这只猫，主人每次访视对每个类别的评分都相同，体重从5.4公斤下降到5.1公斤。排除体重作为标准(“非体重成功”栏)，30只猫被评分为成功。未达到非体重标准的额外猫为示例4。对于这只猫，每个类别的最终和初始分数相同。然而，示例4和示例5的猫被其主人评定为，当与研究开始时进行定性比较时，多饮、多尿或多食的情况有所改善，如下节所述。
表4临床症状定量评估的二元成功结果
分别于给药后0、2、4、6、8小时采集血液，用血糖仪测定绘制血糖曲线。采用具有一阶自回归协方差结构的混合模型重复测量ANCOVA分析对数转换数据，以访视、小时和逐小时访问为固定效应，以小时为随机效应。下面的图7显示了模型调整后的最小二乘平均值，每个曲线的五个测量值按访问显示，具有95％的置信区间。每次访问的平均数据(下方第二个图)用重复测量ANCOVA进行分析，以小时为固定效应，并采用一阶自回归协方差结构。40只登记猫的数据如图8所示。在第8周，5次血糖测定的平均值为114.9mg dL-1(95％置信区间102.8，128.4)。
中心实验室测定筛查时(V1)和登记后每次就诊时(V3、V4和V5)的血清果糖胺浓度。中心实验室测量方法的改变导致正常上限(ULN)从356μmol L-1变为275μmol L-1。数据以正常值上限的百分比表示，用非结构化协方差重复测量ANCOVA进行分析，访视为固定效应。图9显示了具有95％置信区间的模型调整最小二乘平均值。内嵌值Δ表示从基线到第8周的最小二乘平均值的差，表示为ULN的百分比，以及相应的95％置信区间。在第8周，人群中平均血清果糖胺值为正常上限的86.7％(95％置信区间80.0％,93.9％)。
中心实验室测定筛查时(V1)和登记后每次就诊时(V3、V4和V5)的血清葡萄糖浓度。对数转换数据采用协方差为非结构化重复测量ANCOVA分析，访问作为固定效应。图10显示了具有95％置信区间的模型调整最小二乘平均值。插入的文本给出了从基线到第8周的最小二乘平均值的差，以及相应的95％置信区间。第8周时，平均血糖为144(95％置信区间127，163)。
猫经常参加这项研究，因为它们的主人观察到它们的体重正在减轻，尽管它们吃的比平时多。如图11所示，在研究过程中猫的平均体重增加。到第56天，82％的猫保持或增加了体重，没有一只猫的体重减轻超过研究开始时体重的5％。
在每次研究访视时测量体重。对数转换数据的分析如上所述。图11显示了具有95％置信区间的模型调整最小二乘平均值。内嵌图给出了从基线到第8周的最小二乘平均值的差，按初始体重的百分比，具有95％的置信区间。尽管置信区间很宽，因为在研究开始时，群体在体重方面是异质性的，但治疗对每只猫的体重增加的影响是非常显著的(p<0.0001)。体重增加的效果是惊人的，与贝沙格列嗪引起的葡萄糖尿导致的热量消耗会导致猫体重下降这一预期相反。
在整个研究中，主人被要求根据一个四分的定性评分提供猫的高血糖相关临床症状的评估，其中0分代表优秀，3分代表差。分别记录多食、多饮和多尿的评估。在所有三项测量中均检测到显著差异(图12、13和14)，主人评估的多食症的影响程度最小。尽管主人认为他们的猫表现出多食症迹象的减少，但他们猫的客观体重增加了。因此，尽管贝沙格列嗪的作用机制包括通过葡萄糖排尿来消耗热量，但对高血糖相关临床症状的影响比贝沙格列嗪引起的热量损失的影响更为深刻。
猫肢端肥大症相关糖尿病是一种独特的病因，其治疗面临特殊挑战。通常需要非常高的胰岛素剂量来克服这种情况下通常遇到的严重胰岛素抵抗。除了伴随长期疾病的形态学变化外，IGF-1浓度升高也是猫肢端肥大症的病理特征。进入研究的三只猫的IGF-1浓度高于正常上限(92nmol/L)：病例7(172nmol/L),病例28(100nmol/L)和病例30(120nmol/L)。这三个病例在V5时均被视为治疗成功，并完成了为期6个月的延长安全性研究。
酮血症和酮症酸中毒是血糖严重失控的两种表现。由于可用的胰岛素不能使血糖充分降低，脂肪细胞不能完全吸收葡萄糖负荷导致酮症。测定酮血症最可靠的分析物是β-羟基丁酸酯。中心实验室测定筛查时(V1)和登记后每次就诊时(V3、V4和V5)的血清β-羟基丁酸(β-OHB)浓度。对数转换数据采用协方差为非结构化重复测量ANCOVA的混合模型分析，访问作为固定效应。图15显示了具有95％置信区间的模型调整最小二乘平均值。插入的文本给出了从基线到第8周的最小二乘平均值的差，以及相应的95％置信区间。第8周，血清β-羟基丁酸平均浓度为1.76mg dL-1(95％置信区间1.40，2.20)，低于实验室的正常值上限(1.9mg dL-1)。初始访视值极大的置信区间反映了在研究开始时观察到的猫酮血症程度的极端变化。
尽管为了清楚理解的目的已经通过说明和实施例详细地描述了前述发明，但是本领域技术人员将理解，可以在所附权利要求的范围内实施某些改变和修改。另外，本文提供的每篇参考文献通过引用整体并入，其程度如同每篇参考文献通过引用单独并入。在本申请与本文提供的参考文献之间存在冲突的情况下，以本申请为准。