用于通过增强流动介导的扩张来改善内皮功能的组合物
阅读说明：本技术 用于通过增强流动介导的扩张来改善内皮功能的组合物 (Compositions for improving endothelial function by enhancing flow-mediated dilation ) 是由 L·阿克蒂戈雷塔 R·贝尔-赖利德 于 2020-04-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及包含经酯酶处理的脱咖啡因的生咖啡提取物(HDGCE)的组合物,该组合物用于通过增强个体中流动介导的扩张来改善心血管终点诸如内皮功能的方法中,其中以100mg/天-400mg/天的量向所述个体施用有效剂量的HDGCE。(The present invention relates to compositions comprising esterase-treated decaffeinated green coffee extract (HDGCE) for use in a method of improving cardiovascular end-point such as endothelial function by enhancing flow-mediated dilation in an individual, wherein an effective dose of HDGCE is administered to the individual in an amount of 100 mg/day to 400 mg/day.)
技术领域
本发明涉及包含经酯酶处理的脱咖啡因的生咖啡提取物(HDGCE)的组合物，该组合物用于通过增强个体中流动介导的扩张来改善心血管终点诸如内皮功能的方法中，其中以100mg/天-400mg/天的量向所述个体施用有效剂量的HDGCE。
背景技术
绿原酸是在反式肉桂酸和奎尼酸之间形成的酯类。绿原酸天然存在于咖啡中，主要用作连接到不同位置的奎尼酸和酚基(例如，咖啡因、阿魏酸、香豆酸、甲氧基肉桂酸)的单酯和二酯。
US 8,481,028描述了一种使用微生物和/或酶获得水解的绿原酸的方法，该微生物和/或酶能够水解咖啡酰奎尼酸和二酯(例如，3-、4-或5-咖啡酰奎尼酸和二酯)，和/或阿魏酰奎尼酸和二酯(例如，3-、4-或5-阿魏酰奎尼酸和二酯)，以分别生成咖啡酸和阿魏酸。
内皮是指排列血管和淋巴管的内表面的细胞，从而在内腔中的循环血液或淋巴与血管壁的其余部分之间形成界面。内皮减缓了许多血管功能，并且在血流机制和凝血调节中起关键作用。在还具有健康内皮的健康动脉中，如果血流量增加，则血管能够放松。已观察到，具有受损内皮功能的个体更易患心血管疾病(例如，对内皮的损伤可导致动脉粥样硬化斑块，以及脑血管疾病)。血管功能紊乱可通过测量血管中的流动介导的扩张(FMD)来监测。Mills等人(Clinical Nutrition 36(2017)1520-1529)描述了通过绿原酸及其代谢物调解咖啡诱导的人血管功能的改善。
在这篇文章中，作者描述了450mg和900mg的纯5-CQA在24名个体中未显示出显著效果。
对评估内皮功能紊乱标志物的咖啡和/或咖啡组分进行的研究很少。有趣的是，这些研究中的大多数已显示出对血管健康的有益效果。如Mills等人所展示(ClinicalNutrition 36(2017)1520-1529)，观察到的效果在高绿原酸咖啡水平而非低水平的情况下最为显著。
最近的研究(Sanchez-Bridge et al Biofactors 42(3)(2016)259-67)详细描述了在施用具有不同烘焙条件的咖啡之后咖啡绿原酸和酚酸在人类中的吸收和代谢。此外，为了评估肠吸收的重要性，还将酶水解后含有高水平游离酚酸的未经烘焙的咖啡用作测试饮料。通过使未经烘焙的咖啡提取物通过包含具有固定的约氏乳杆菌(La1，NCC533)酯酶的小珠的柱来制备酶促水解的未经烘焙的咖啡。
本发明的目的是改进现有技术并且提供一种用于通过通过增强个体中流动介导的扩张来改善心血管终点诸如内皮功能的更好的新营养解决方案。
发明内容
因此，根据本发明的第一方面，尽管这不一定是本发明的最广泛的方面，也不一定是本发明的唯一方面，本发明提供了改善血管功能并随之改善心血管疾病和脑血管疾病的方法，所述方法包括向个体施用有效剂量的经酯酶处理的脱咖啡因的生咖啡提取物(HDGCE)组合物，组合物的有效剂量为100mg/天-400mg/天的水解的生咖啡提取物的量。
在一个实施方案中，组合物包含比率为至少大于2∶1的咖啡酸：阿魏酸。在另一个实施方案中，组合物包含比率在3∶1至10∶1的范围内的咖啡酸：阿魏酸。
发明人惊奇地发现，与安慰剂治疗相比，食用包含HDGCE(173.1mg HDGCE剂量)的组合物在1h(p值＝0.036)和6h(p值＝0.017608)时显示出FMD的显著增加。在这些时间点处FMD的增加高于FMD的1％单位。内皮功能紊乱的改善(流动介导的扩张值1％)与心血管事件的风险低13％相关(Inaba等人，2010，Int J Cardiovas Imaging26：621-640)。
在一个方面，本发明涉及组合物，该组合物包含经酯酶处理的脱咖啡因的生咖啡提取物(HDGCE)，该组合物用于改善健康个体的心血管流动并降低心血管疾病风险的方法中，心血管疾病风险通过个体中测得的流动介导的扩张(FMD)的变化来测量，其中以100mg/天-400mg/天的量向个体施用有效剂量的该组合物。
在又一方面，本发明涉及用于制备包含经酯酶处理的脱咖啡因的咖啡提取物(HDGCE)的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
-通过使生咖啡豆与水、蒸汽、有机溶剂、超临界CO2和/或其混合物接触来制备脱咖啡因的生咖啡提取物；
-任选地对脱咖啡因的生咖啡提取物进行干燥，优选地喷雾干燥或冷冻干燥；
-在4至7范围内的pH和20℃至50℃范围内的温度下，使所获得的脱咖啡因的生咖啡提取物与酯酶接触1小时至6小时范围内的温育时间，其中酯酶优选为优选地溶解在1ml水或缓冲液中的浓度优选在1U至20U/200mg生咖啡提取物W/W范围内的绿原酸酯酶；
-将上述经酶处理的生咖啡提取物在80℃至120℃范围内的温度处加热1分钟至30分钟，以使酶失活并对提取物进行巴氏灭菌；以及
-任选地对提取物进行干燥，以获得经酯酶处理的脱咖啡因的生咖啡提取物(HDGCE)。
附图说明
图1示出来自约氏乳杆菌(L.johnsonii)的纯化酯酶，其具有约34KDa的Mw。
图2示出pH对约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)酯酶活性的影响。
图3示出温度对约氏乳杆菌酯酶活性的影响。
图4示出约氏乳杆菌酯酶的底物特异性。4-硝基苯丁酸酯(●)；4-硝基苯乙酸酯(◆)；4-硝基苯癸酸酯(▲)；4-硝基苯十四酸酯(■)；4-硝基苯十二酸酯
图5示出了约氏乳杆菌酯酶(16.5U/ml)对脱咖啡因的生咖啡提取物(200g/L)的CQA(●)、FQA(■)和di-CQA的动力学转化以及作为时间函数的咖啡酸(▲)和阿魏酸(◆)的形成。反应体积为1ml。反应一式两份进行。
具体实施方式
术语心血管疾病可包括例如冠状动脉疾病(也称为冠心病和缺血性心脏病)、外周动脉疾病(例如外周内皮功能紊乱)、肾动脉狭窄和主动脉瘤、动脉粥样硬化斑块形成。还存在许多涉及心脏的心血管疾病，例如心肌病、高血压性心脏病、心力衰竭、肺心病、心律失常、心内膜炎。最常涉及的结构是心脏瓣膜、炎性心脏肥大、心肌炎、某些药物、毒素和自身免疫性障碍、嗜酸性心肌炎、瓣膜心脏疾病、先天性心脏病和风湿性心脏病。优选地，心血管疾病选自动脉粥样硬化斑块形成、冠状动脉疾病和内皮功能紊乱，优选地内皮功能紊乱。更优选地，心血管疾病是内皮功能紊乱，优选地外周内皮功能紊乱。
脑血管疾病包括影响脑血管和脑循环的多种医学病症。向大脑供应氧气和营养物质的动脉通常在这些障碍中受损或变形。脑血管疾病的最常见表现是缺血性中风或小中风，有时是出血性中风。高血压(高血液压)是导致中风和脑血管疾病的最重要的风险因素，因为其可改变血管的结构并导致动脉粥样硬化。动脉粥样硬化使脑中的血管变窄，从而导致脑灌注减少。其他导致中风的风险因素包括吸烟和糖尿病。变窄的脑动脉可导致缺血性中风，但持续升高的血压也可导致血管撕裂，从而导致出血性中风。优选地，脑血管疾病选自缺血性中风、小中风和出血性中风。
术语“功能食物产品”是指包含HDGCE组合物的饮料或食物组合物，HDGCE组合物的量在100mg至400mg水解生咖啡提取物的范围内。食物组合物可以是粉末形式，诸如基于巧克力或麦芽的组合物。食物组合物也可以是小吃，诸如包含HDGCE的谷物棒。
术语“经酯酶处理的”是指脱咖啡因的生咖啡提取物与纯化绿原酸酯酶或包含这种酯酶的微生物一起温育。绿原酸酯酶例如在US 8,481,028中或例如在Bel-Rhlid等人：Biotranformation of caffeoyl quinic acids from green coffee extracts byLactobacillus johnsonii NCC 533(2013)：AMB express第3卷：28页中描述。
酯酶是水解酶，可以在与水的化学反应中将酯分解成酸和醇，称为水解。在与酶浓度相关的20℃至50℃范围内的温度处，温育时间可以为30分钟至6小时，使得脱咖啡因的生咖啡提取物中存在的总绿原酸的至少80％得以水解。在一个实施方案中，酯酶来自约氏乳杆菌。
术语“脱咖啡因的生咖啡提取物”是指通过例如热水或用有机溶剂或本领域技术人员熟知的超临界CO2提取而被脱咖啡因的生咖啡豆。咖啡因含量低于5％W/W，可为2％至3％W/W。
术语“100mg-400mg/天”的量是指100mg-400mg干重的经酯酶处理的脱咖啡因的生咖啡提取物(HDGCE)，可将其溶解在例如水中或整合到可食用食物产品诸如谷物、可溶性咖啡、巧克力或食品补充物诸如适于个体食用的胶囊或片剂中。在一个实施方案中，将量为100mg-400mg干重的经酯酶处理的脱咖啡因的生咖啡提取物溶解在约200ml的水中。
术语“通过流动介导的扩张的变化进行的测量”是指施用安慰剂的个体(给予无HDGCE的组合物的个体)与施用活性组合物的个体(包含100mg/天-400mg/天HDGCE的组合物)之间的ΔFMD值的变化。在一个实施方案中，变化为至少1％，P值低于0.02。
在一个实施方案中，所述HDGCE组合物中咖啡酸和阿魏酸的总含量介于30mg和80mg之间，并且组合物可为经热处理的组合物。在另一个实施方案中，所述HDGCE组合物中咖啡酸和阿魏酸的总含量介于35mg和60mg之间，并且组合物可为经热处理的组合物。
根据本发明使用的组合物可以是任何合适的形式，例如该组合物可以是液体组合物形式、饮料形式，例如液体饮品、搅合饮品、营养组合物或液体餐食替代物。
控制食物卫生风险的重要方法是对可能携带食物病原体或腐败生物体的可食用组分进行热处理。此类热处理的熟知示例是巴氏灭菌(例如将可食用材料加热至70℃持续2分钟、或75℃持续26秒或80℃持续5秒)和超高温(UHT)处理(例如将可食用材料加热至135℃以上持续至少2秒)。
根据本发明使用的组合物可按日剂量施用以提供每天每名个体100mg至400mg干重的HDGCE。该剂量应当确保每日用量充足，以至少在中期为个体提供所需的效果。在一个实施方案中，当施用组合物时，个体空腹。
本发明的另一方面是包含量为100mg-400mg/天的HDGCE的组合物用于增加流动介导的扩张(FMD)的非治疗性用途，其中咖啡酸和阿魏酸的量以咖啡酸：阿魏酸的比率计，为至少大于2∶1，例如至少大于3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或10∶1。
在一个实施方案中，除了施用HDGCE之外，还向所述个体补充至少200kcal的餐食。
在一个实施方案中，个体是人类个体。在一个实施方案中，个体是健康人类个体。
咖啡提取物
用于制备咖啡提取物的许多方法是本领域已知的，例如从EP 0916267中。咖啡提取物可以是例如纯可溶咖啡。纯可溶咖啡产品是易得的，并且许多用于制备纯可溶咖啡产品的方法是本领域已知的，例如从EP106930中。
本发明的另一方面提供了用于制备HDGCE组合物的方法，其包括以下步骤：(i)通过使生咖啡豆与水、蒸汽、有机溶剂、超临界CO2和/或其混合物接触来制备脱咖啡因的生咖啡提取物；(ii)任选地对所述脱咖啡因的生咖啡提取物进行干燥；(iii)在4至7范围内的pH和20℃至50℃范围内的温度处，使所获得的脱咖啡因的生咖啡提取物与酯酶接触1小时至6小时范围内的温育时间；(iv)将上述经酶处理的生咖啡提取物在80℃至120℃范围内的温度处加热1分钟至30分钟，以使酶失活并对提取物进行巴氏灭菌；以及(v)任选地对所述提取物进行干燥，以获得所述经酯酶处理的脱咖啡因的生咖啡提取物(HDGCE)。在一个实施方案中，干燥步骤(ii)是喷雾干燥或冷冻干燥。在另一个实施方案中，酯酶优选为优选地溶解在1ml水或缓冲液中的浓度优选在1U至20U/200mg生咖啡提取物W/W范围内的绿原酸酯酶。
本领域的技术人员将理解，他们可自由地合并本文所公开的本发明的所有特征。具体地讲，针对组合物的治疗性用途描述的特征可以与非治疗性用途组合，反之亦然。另外，可合并针对本发明的不同实施方案所描述的特征。根据附图和实施例，本发明的另外的优点和特征将显而易见。
实施例
实施例1
来自约氏乳杆菌(NCC533)的酯酶的纯化、表征和克隆
在约氏乳杆菌全细胞中鉴定酯酶活性。对酶进行纯化和表征。对基因进行注释(LJ-1228，基因＝11586011159347反向产物＝α/β水解酶(参见下文的序列)。然后使该基因在食品级大肠杆菌(E.coli)中过表达，并且通过HPLC(HIC柱TSK凝胶苯基-5PW，线性梯度为1至0mol(NH4)2SO4/L的NaPO4溶液(50mM)pH 7.0+1mM EDTA)纯化酶。流速为0.8ml/min)。
DNA序列/核苷酸序列
Atggagactacaattaaacgtgatggtctaaacttacatggtttacttgaaggaaccgataagattgaaaatgatacgattgctattttaatgcatggttttaaaggtgatttgggttatgatgacagcaagattttgtatgctctctctcactacttaaatgatcaaggcctcccaacaattcgttttgactttgatggatgcggaaaaagtgatggtaaatttgaagatatgactgtctatagcgaaatcctagatgggataaaaatattagattatgttcgtaatactgttaaggcaaaacatatctatttagtgggacactcccaaggtggagtagtagcgtcaatgctggctggatattatcgagatgttattgaaaaattggctttactctctcctgcagcaactcttaagtctgatgctttagatggagtttgtcagggtagtacttatgatccaacgcatatccctgaaactgtcaatgttagtggctttgaagtaggaggagcttactttagaacggctcaattattgcctatttatcaaacagcggaacattataatagggaaactttattgattcatggcttagcagataaagtcgtgtcacctaatgcttcaagaaaatttcatacacttttgcctaaaagtgagctccatttaattccagatgagggtcacatgtttaacggaaaaaatagacctgaagtattaaaattagttggtgagtttttaataaaataa
氨基酸序列
约氏乳杆菌酯酶的最佳pH的鉴定
通过使用甘氨酸缓冲液、乙酸盐缓冲液、Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液和水来确定最佳pH。将5-CQA用作底物(50μmol/ml)。如我们在图2中可见，酶的最佳pH介于4.0与6.0之间。反应在37℃下用纯化的酯酶(0.01U/mg底物)进行30分钟。
约氏乳杆菌酯酶的最佳温度的鉴定
通过在10℃至90℃的不同温度处使用5-CQA作为底物(50μmol/ml)确定最佳温度。如我们在图3中可见，酶的最佳温度介于30℃与40℃之间。反应在pH 5.0下用纯化的酯酶(0.01U/mg底物)进行30分钟。
底物特异性
使用不同的4-硝基苯基衍生物研究约氏乳杆菌酯酶的底物特异性。如我们在图4中可见，4-硝基苯丁酸酯是最佳底物，而未观察到4-硝基苯十二酸酯的转化。反应在37℃下、在pH 6.0的磷酸钠缓冲液中进行10分钟。底物以0.2mM的浓度使用，酶以0.01U/mg底物使用。每30秒监测一次测量。吸光度设置在410nm处。
用约氏乳杆菌酯酶处理脱咖啡因的生咖啡提取物。
反应动力学：实验室规模试验
使用不同浓度(1.65U/ml、3.3U/ml、4.95U/ml、8.25U/ml和16.25U/ml)的约氏乳杆菌酯酶对200mg/ml的脱咖啡因的生咖啡提取物(DGCE)进行动力学研究。反应在1ml体积中、在pH 4.5和37℃下进行。结果汇总于下表中。不同化合物的浓度以mg/ml为单位。
时间(h)
0
1
2
3
4
酶(U)
0
1.65
1.65
1.65
1.65
DGCE(mg/ml)
200
200
200
200
200
CQA
52.11
21.51
18.05
16.18
15.14
FQA
11.03
9.89
9.09
9.56
8.3
di-CQA
13.22
3.34
2.88
2.65
2.44
CA
0.49
19.82
21.51
22.35
22.08
FA
0.21
3.76
4.11
4.45
4.36
咖啡因
3.20
3.13
3.09
3.10
3.00
时间(h)
0
1
2
3
4
酶(U)
0
3.3
3.3
3.3
3.3
DGCE(mg/ml)
200
200
200
200
200
CQA
52.25
17.77
14.62
12.88
11.09
FQA
11.1
1.65
1.46
1.28
1.11
di-CQA
13.29
2.41
2.14
2.08
1.83
CA
0.48
25.63
27.23
27.56
26.27
FA
0.20
4.09
4.58
4.77
4.80
咖啡因
3.21
3.05
3.08
3.04
2.90
时间(h)
0
1
2
3
4
酶(U)
0
4.95
4.95
4.95
4.95
DGCE(mg/ml)
200
200
200
200
200
CQA
50.85
15.88
12.86
10.93
10.04
FQA
10.74
1.66
1.29
1.07
0.57
di-CQA
11.75
1.83
1.72
1.44
1.37
CA
0.49
26.42
27.77
27.82
27.65
FA
0.21
4.30
4.79
4.94
5.19
咖啡因
3.12
3.03
3.04
2.94
2.98
时间(h)
0
1
2
3
4
酶(U)
0
8.25
8.25
8.25
8.25
DGCE(mg/ml)
200
200
200
200
200
CQA
51.68
13.03
9.78
8.07
6.93
FQA
10.92
1.32
0.56
0.50
0.49
di-CQA
13.48
1.53
1.17
0.95
0.90
CA
0.48
27.13
28.52
29.22
29.40
FA
0.21
4.90
5.72
6.08
6.36
咖啡因
3.20
2.97
2.95
2.94
2.92
时间(h)
0
1
2
3
4
酶(U)
0
16.5
16.5
16.5
16.5
DGCE(mg/ml)
200
200
200
200
200
CQA
51.46
8.90
6.34
4.87
3.91
FQA
10.93
0.54
0.48
0.44
0.42
di-CQA
13.19
1,29
1.02
0.58
0.30
CA
0.48
27.26
28.79
29.19
29.90
FA
0.21
4.90
5.72
6.08
6.36
咖啡因
3.18
2.80
2.83
2.79
2.82
作为时间函数的反应动力学
使用浓度为16.25U/ml的约氏乳杆菌酯酶对脱咖啡因的生咖啡提取物(200mg/ml)进行动力学研究。反应在1ml反应体积中、在pH 4.5和37℃下进行。动力学进行1、2、3和4小时。不同化合物的浓度以mg/ml为单位。
作为酶浓度函数的反应动力学
使用不同浓度的约氏乳杆菌酯酶(5μl/ml、10μl/ml、15μl/ml、25μl/ml和50μl/ml，分别对应于1.65U/ml、3.3U/ml、4.95U/ml、8.25U/ml和16.5U/ml)对脱咖啡因的生咖啡提取物(200mg/ml)进行动力学研究。反应在1ml体积中、在pH 4.5和37℃下进行(见图5)。反应时间为4小时。不同化合物的浓度以mg/ml为单位。
中试生产试验
用约氏乳杆菌酯酶处理脱咖啡因的生咖啡提取物
在搅拌下将脱咖啡因的生咖啡提取物(1.76Kg)溶解在水(8.8Kg)中。然后通过添加盐酸(HCl，0.36Kg)将pH调节至pH 4.5。分两次向该溶液中添加0.024Kg酶(来自约氏乳杆菌的酯酶)：在时间T＝0h时添加0.016Kg酶，在反应3h后添加0.008Kg酶。反应在37℃下进行6小时。然后将混合物在98℃下加热10分钟以使酶失活。在离心(5000g下2分钟)和过滤(0.45μm)之后，将混合物冷冻干燥，并且将所得粉末用于制备用于临床研究的饮料。
UPLC分析
用于分析样品的方法允许定量测定从烘焙或生豆中提取的液体咖啡提取物和纯可溶性咖啡中的咖啡酸、绿原酸异构体(5-CQA、4-CQA、3-CQA、4-FQA、5-FQA、3，4-diCQA、3，5-diCQA和4，5-diCQA)和咖啡因。然后将样品在15℃下离心(5000g)5分钟。将100μL所得上清液添加到900μL甲醇/水(80∶20)中，并以0.2μm过滤，然后进行分析。分析在UPLC上进行，该UPLC配备有泵、脱气系统、进样回路大于5μL的进样器、光电二极管阵列检测器(波长为325nm和275nm)和适当的数据软件。分子的分离在ACQUITY UPLC BEH Shield RP 18，1.7μm，2.1×100mm柱(来自沃特世公司(Waters))上进行。流动相A为具有0.1％磷酸的5％乙腈水溶液，流动相B为具有0.1％磷酸的100％乙腈。流速为0.4mL/min，柱温为35℃，进样体积为2μL。
临床试验
主要目标
试验的主要目的是通过口服施用富含酚酸的水解的脱咖啡因的生咖啡来研究改善健康志愿者的内皮功能的功效。内皮功能被定义为反应性充血期间肱动脉内径相对于基线的变化百分比(％FMD)。
主要终点
主要结果是在治疗后的任何时间点，FMD％相对于基线(即给药前)的平均变化。响应计算为肱动脉直径相对于基线的百分比变化
HDGCE的试验设计
这是水解的生咖啡提取物在20名健康个体中的安慰剂对照、双盲、随机、单中心交叉试验。将个体随机分配到每个组序列。试验在一个中心进行，并且涉及4天(非连续)治疗期。
统计分析
主要终点的主要分析是在基线后的每个时间点，在不同剂量的酚酸和对照物之间的峰处FMD距基线平均值的变化差异。1％的差异被认为是临床相关的，并且小于0.05的p值被认为是统计上显著的。
组合物的描述
将含有酚酸和大约2％咖啡因的水解生咖啡提取物用于试验。在该研究中，每天仅向个体给予一个剂量的富含酚酸的咖啡提取物。将脱咖啡因的生咖啡提取物、麦芽糖糊精和香味剂湿混，然后冷冻干燥以确保最终预混物的均匀性。
安慰剂仅含有麦芽糖糊精和香味剂。麦芽糖糊精和香味剂的量在4组之间相似，以避免这些成分对研究结果的任何潜在影响。
下表描述了冷冻干燥后四种研究产品的组成(考虑干燥后2％的残余水)。
表1：水解生咖啡提取物(HDGCE)组合物
在即将施用前，将每种剂量的研究产品或匹配安慰剂在室温下溶解在200mL矿泉水的不透明玻璃中，带盖。早晨，在空腹条件下施用研究产品。
个体的处置
筛选了23名个体，其中3名是违反入选和/或排除标准的筛查失败。参与该研究的所有其余20名个体继续所有4次就诊。
全分析数据集(称为用于保持治疗的FAS或ITT)
所有随机化的个体都包括在全分析中。该数据集总共有20名个体。其中仅42名个体具有可用于初步分析的数据。
表1：分析群体
群体
个体总数
具有完整基线FMD数据的个体
FAS/ITT
20
19
PP
14
14
表3：相对于基线FMD的统计变化汇总
关于内皮功能紊乱的结果
表4：剂量40相对于安慰剂的估计差值和显著性
表5：剂量20相对于安慰剂的估计差值和显著性
表6：剂量10相对于安慰剂的估计差值和显著性
表7：HDGCE的FMD iAUC汇总统计
P值涉及不同剂量的iAUC与安慰剂的iAUC的比较。没有发现剂量在统计学上不同于安慰剂，并且这可能是由于观察到非常高的可变性。
我们发现，与安慰剂治疗相比，173.1mg的HDGCE剂量在1小时(p值＝0.036)和6小时(p值＝0.017608)时显示出FMD的显著增加。在这些时间点处FMD的增加高于FMD的1％单位。内皮功能紊乱的改善(流动介导的扩张值1％)与心血管事件的风险低13％相关(Inaba等人，(2010)Int J Cardiovas Imaging 26：621-640)。
结论
在1小时和6小时的时间点处，在173.1mg的HDGCE(剂量40)和安慰剂之间观察到统计显著性。
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