一种头孢噻肟镁化合物、其制备方法及应用
阅读说明：本技术 一种头孢噻肟镁化合物、其制备方法及应用 (Cefotaxime magnesium compound, preparation method and application thereof ) 是由 刘翠哲 刘金霞 曹凯 宋成军 金鹏 白红红 杨禄坤 于 2020-05-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种头孢噻肟镁化合物、其制备方法及应用,通过采用头孢噻肟与镁结合,能起到协同增效的作用,头孢噻肟能抑制病原菌细胞壁合成,对革兰阴性菌的作用强,联合镁元素后显著抑制细菌细胞壁的合成,使用效果显著增强。本发明通过利用头孢噻肟酸与镁离子反应生成头孢噻肟镁化合物,提高头孢噻肟药物的稳定性,同时为临床上不适合钠盐的患者提供一种选择。本发明所述头孢噻肟镁化合物为含镁抗生素,同时具有抗菌治疗效果和补镁的效果,镁元素与头孢噻肟合用,对一些炎症有益处,起到协同增效的作用。所述头孢噻肟镁的制备方法,操作简单,不使用有机溶剂,无有毒有害物质生成,产品纯度高,便于工业化生产。(The invention relates to a cefotaxime magnesium compound, a preparation method and application thereof. The invention utilizes the reaction of cefotaxime acid and magnesium ions to generate a cefotaxime magnesium compound, improves the stability of the cefotaxime medicament, and provides a choice for patients who are not suitable for sodium salt clinically. The cefotaxime magnesium compound is a magnesium-containing antibiotic, has antibacterial treatment effect and magnesium supplement effect, and has synergistic effect on certain inflammation beneficial parts by combining magnesium element with cefotaxime. The preparation method of cefotaxime magnesium is simple to operate, does not use organic solvent, does not generate toxic and harmful substances, has high product purity, and is convenient for industrial production.)
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种头孢噻肟镁化合物、其制备方法及应用。
背景技术
头孢噻肟，3-乙酰氧基甲基-7-[2-(2-氨基-4-噻唑基)-2-甲氧亚胺基]-乙酰胺基-3-头孢-4-羧酸，分子式为C16H17N5O7S2，分子量为455.46，临床上应用其注射用无菌粉末。
头孢噻肟为第三代头孢菌素，是一种广谱抗生素。对革兰阴性杆菌的作用明显优于第一、二代头孢菌素，尤其对流感杆菌、大肠杆菌、肠杆菌、产枸橼酸菌属、沙雷菌属、克雷白杆菌属及产β-内酰胺酶的耐药大肠杆菌的作用比头孢噻肟强，特别对产青霉素酶的嗜血杆菌的作用最强。头孢噻肟治疗血液病合并感染的患者，临床反应最佳，杀菌作用时间维持较长，但对铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌杀菌作用较差。
头孢噻肟在肠道中不吸收。肌内注射0.5g和1.0g，0.5h后达血药浓度峰值，分别为12μg/ml和25μg/ml。静脉注射1g和2g，血药浓度峰值分别为102μg/ml和215μg/ml。30min内静脉滴注1g，滴注完毕时血药浓度为41μg/ml，4h后血药浓度为1.5μg/ml。药物吸收后在组织穿透力强，体内分布广泛，可在各组织、体腔液、体液中达到有效抗菌浓度，尤以胆汁、尿液中浓度较高。头孢噻肟不易透过正常脑膜，但脑膜有炎症时可增加透入量。头孢噻肟蛋白结合率为30％～50％。药物在肝内代谢为去乙酰头孢噻肟(抗菌活性为头孢噻肟的1/10)和其他无活性的代谢产物。肌内注射和静脉注射的半衰期分别为0.92-1.35h和0.84-1.25h。其代谢产物去乙酰头孢噻肟的半衰期为1.5h。头孢噻肟80％可经肾脏排泄，其中50％-60％为原形药，10％-20％为去乙酰头孢噻肟，另10％-20％为无活性的代谢产物。头孢噻肟经胆汁排泄量较少，约为给药量的0.01％-0.1％。血液透析能将62.3％的药物自体内清除，腹膜透析对头孢噻肟的药动学无影响。
临床上常用的是头孢噻肟钠，单用或与舒巴坦合用。然而临床应用时，对于高血钠患者来说，钠盐并不适合。
发明内容
为了解决现有技术存在的以上问题，本发明提供了一种抗菌效果增强同时具有补镁功效的头孢噻肟镁化合物、其制备方法及应用。本发明通过采用头孢噻肟与镁结合，能起到协同增效的作用，头孢噻肟能抑制病原菌细胞壁合成，对革兰阴性菌的作用强，联合镁元素后显著抑制细菌细胞壁的合成，使用效果显著增强。提高头孢噻肟药物的稳定性，同时为临床上不适合钠盐的患者提供一种选择。
本发明所采用的技术方案为：
一种头孢噻肟镁化合物，结构式如下：
分子式为：Mg(C16H17N5O7S2)2；
分子量为：932.9。
所述的头孢噻肟镁化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备头孢噻肟酸混悬液：
将头孢噻肟酸过筛，加入纯化水中，混匀，得到头孢噻肟酸混悬液；
(2)制备镁化合物溶液或混悬液：
将镁化合物粉碎成细粉，过筛，加入纯化水中，混匀，得到镁化合物溶液或混悬液；
(3)反应：
将步骤(2)所述的镁化合物溶液或混悬液加入到步骤(1)所述头孢噻肟酸混悬液中，搅拌条件下使充分反应，过滤得到滤液；
(4)干燥：
将步骤(3)得到的滤液进行干燥、纯化，即得所述的头孢噻肟镁化合物。
步骤(1)中，所述过筛的筛子孔径为60-120目。
所述头孢噻肟酸混悬液中的头孢噻肟酸与所述镁化合物溶液或混悬液中的镁元素的摩尔比为2:1。
步骤(2)中，所述镁化合物为氢氧化镁、碳酸氢镁、乙酸镁中的一种或几种的混合物。
步骤(3)中，进行所述反应的温度为15-30℃。
步骤(3)中，进行所述搅拌反应的同时还加入脱色剂。
所述脱色剂为活性炭。
步骤(4)中，所述干燥为喷雾干燥或冷冻干燥。
所述的喷雾干燥是采用喷雾干燥设备将步骤C的滤液分散成微粒，并且让其微粒与热空气接触，在瞬间除去其水分，得到水含量为以重量计2.0％以下的头孢噻肟镁化合物。本发明使用的喷雾干燥设备是目前市场上销售的产品，例如由江苏锡山市林州干燥机厂公司以商品名QZR-5型销售的产品。
所述的冷冻干燥是采用冷冻干燥设备将步骤C的滤液冷冻至0℃以下，并在高真空下通过加热使水分直接从固态升华为水汽，除去其水分，得到水含量为以重量计2.0％以下的头孢噻肟镁化合物。本发明使用的冷冻干燥设备是目前市场上销售的产品，例如由北京四环科学仪器厂有限公司以商品名LGJ-22D型销售的产品。
步骤(4)中，所述纯化采用重结晶、十八烷基硅烷反相柱、制备液相色谱法进行纯化，以达到产品中头孢噻肟镁化合物的含量为以重量计95％以上。
重结晶纯化是在乙醇-水(1:9-9:1)溶剂中在25℃条件下进行的。十八烷基硅烷反相柱(ODS)是一种常用的反相色谱柱，也叫C18柱；由于它是长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类型的生物大分子有更强的适应能力，因此在生物化学分析工作中应用的最为广泛。使用ODS柱纯化是在使用由YMC公司以商品名GEL C18 AAG12S50销售的ODS柱在5％-50％乙腈-甲醇-水作为洗脱液条件下进行的。
使用制备液相色谱法纯化所用仪器为岛津公司以商品名CTO-10A销售的制备液相，制备色谱柱为C18，液相条件为乙腈-甲醇-水(5:50:45)。
头孢噻肟镁化合物含量是根据高效液相色谱法测定的，所用仪器为Agilent1260，色谱柱为ODS C18，液相条件为0.1％磷酸水-乙腈(70:30)，流速为1mL/min，检测波长230nm。
一个镁离子(Mg2+)与两个头孢噻肟上的羧基发生反应，生成头孢噻肟镁，分子式为Mg(C16H17N5O7S2)2，分子量为932.9。
所述的头孢噻肟镁化合物在制备抗菌药物中的应用。
镁是一种参与生物体正常生命活动及新陈代谢过程的必不可少的元素。镁影响细胞的多种生物功能，影响钾离子和钙离子转运，调控信号传递，参与能量代谢、蛋白质和核酸合成；催化酶的激活和抑制及对细胞周期、细胞增殖及细胞分化的调控；镁还参与维持基因组的稳定性，并且还与机体氧化应激和肿瘤发生有关。本申请发明人在长期研究中发现，通过将镁元素与头孢噻肟合用，对一些炎症有益处，起到协同增效的作用。
本发明的有益效果为：
(1)本发明所述的头孢噻肟镁化合物，通过采用头孢噻肟与镁结合，能够起到协同增效的作用，头孢噻肟能抑制病原菌细胞壁的合成，对革兰阴性菌的作用强，联合镁元素后可显著抑制细菌细胞壁的合成，使用效果显著增强。本发明通过利用头孢噻肟酸与镁离子反应生成头孢噻肟镁化合物，提高头孢噻肟药物的稳定性，简化制剂生产工艺，同时为临床上不适合钠盐的患者提供一种选择。本申请所述头孢噻肟镁化合物为含镁抗生素，同时具有抗菌治疗效果和补镁的效果，镁元素与头孢噻肟合用，对一些炎症有益处，起到协同增效的作用。
(2)本发明所述头孢噻肟镁的制备方法，操作简单，不使用有机溶剂，无有毒有害物质生成，产品纯度高，便于工业化生产。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施病例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种头孢噻肟镁化合物的制备方法，所述头孢噻肟镁化合物的分子式为：Mg(C16H17N5O7S2)2，分子量为932.9，结构式如下：
所述的头孢噻肟镁化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备头孢噻肟酸混悬液：
将0.2mol头孢噻肟酸过60目筛，加入100mL纯化水中，混匀，得到头孢噻肟酸混悬液；
(2)制备碳酸氢镁溶液：
将0.1mol碳酸氢镁粉碎成细粉，过60目筛，加入20mL纯化水中，混匀，得到碳酸氢镁溶液；
(3)反应：
将步骤(2)所述的碳酸氢镁溶液加入到步骤(1)所述头孢噻肟酸混悬液中，在25℃下搅拌使充分反应，再加入0.1％活性炭进行搅拌脱色，过滤得到滤液；
(4)干燥：
将步骤(3)得到的滤液先在70帕压力条件下进行冷冻干燥，得到水含量低于2％的初品，之后在25℃条件下、采用乙醇-水(1:9-9:1)溶剂进行重结晶纯化，即得所述的头孢噻肟镁化合物产品。
经高效液相色谱法测定，产品中头孢噻肟镁化合物的含量为以重量计95％以上。高效液相色谱法所用仪器为Agilent 1260，色谱柱为ODS C18，液相条件为0.1％磷酸水-乙腈(70∶30)，流速为1mL/min，检测波长230nm。
实施例2
本实施例提供一种所述头孢噻肟镁化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备头孢噻肟酸混悬液：
将0.2mol头孢噻肟酸过120目筛，加入200mL纯化水中，混匀，得到头孢噻肟酸混悬液；
(2)制备乙酸镁溶液：
将0.1mol乙酸镁粉碎成细粉，过120目筛，加入40mL纯化水中，混匀，得到乙酸镁溶液；
(3)反应：
将步骤(2)所述的乙酸镁溶液加入到步骤(1)所述头孢噻肟酸混悬液中，在15℃下搅拌使充分反应，再加入活性炭进行搅拌脱色，过滤得到滤液；
(4)干燥：
将步骤(3)得到的滤液先在10帕压力条件下进行喷雾干燥，得到水含量低于2％的初品，之后采用十八烷基硅烷反相柱进行纯化，即得所述的头孢噻肟镁化合物产品。经检测，产品中头孢噻肟镁化合物的含量为以重量计95％以上。
实施例3
本实施例提供一种所述头孢噻肟镁化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备头孢噻肟酸混悬液：
将0.2mol头孢噻肟酸过80目筛，加入150mL纯化水中，混匀，得到头孢噻肟酸混悬液；
(2)制备氢氧化镁混悬液：
将0.1mol氢氧化镁粉碎成细粉，过100目筛，加入50mL纯化水中，混匀，得到氢氧化镁混悬液；
(3)反应：
将步骤(2)所述的氢氧化镁混悬液加入到步骤(1)所述头孢噻肟酸混悬液中，在30℃下搅拌使充分反应，再加入活性炭进行搅拌脱色，过滤得到滤液；
(4)干燥：
将步骤(3)得到的滤液先在50帕压力条件下进行喷雾干燥，得到水含量低于2％的初品，之后制备液相色谱法进行纯化，即得所述的头孢噻肟镁化合物产品。经检测，产品中头孢噻肟镁化合物的含量为以重量计95％以上。
实验例
1、采用紫外吸收光谱(紫外吸收光谱分析设备Agilent 8453)对实施例1制备的头孢噻肟镁化合物进行结构分析。
将现有技术中的头孢噻肟钠与本发明制得的头孢噻肟镁在200-400nm下仪器自动扫描紫外吸收光谱。采用对照品比较法测定紫外吸收光谱。
将2mg头孢噻肟钠与2mg本发明实施例1制备的头孢噻肟镁分别溶于10ml甲醇中，然后测定最大吸收波长，其结果列于表1中。
表1-头孢噻肟钠与头孢噻肟镁的最大吸收波长
化合物
最大吸收波长
头孢噻肟酸
233nm
头孢噻肟钠
233nm
头孢噻肟镁
233nm
从表1可以看出，头孢噻肟钠与头孢噻肟镁化合物的紫外最大吸收波长(λmax)相同，它们都在233nm处有最大吸收；这些紫外吸收光谱结果表明，镁离子的结合对头孢噻肟的离域共振结构影响不大。
2、头孢噻肟钠与头孢噻肟镁化合物在水中溶解度的比较
采用常规溶解度测定方法，在温度25℃水中，测定了头孢噻肟钠与头孢噻肟镁的溶解度，其结果列于表2中。
表2-头孢噻肟钠与头孢噻肟镁化合物在水中的溶解度
样品
溶解度(g/mL)
头孢噻肟钠
10.34
头孢噻肟镁
13.17
从表2可以看出，头孢噻肟镁的水溶性较好，是头孢噻肟钠的1.27倍。
3、稳定性
分别精密称取头孢噻肟钠、头孢噻肟镁各10mg，置于容量瓶中，加蒸馏水至刻度，配制浓度为1mg/ml的贮备液，置于冰箱中备用。然后分别取0.9％氯化钠，5％葡萄糖注射液加贮备液配置成10ug/ml的待测样品液，将各样品分别放置于35℃的恒温水溶中，分别于1、3、5、8h取样测定，计算各待测溶液的药物浓度，取平均值。结果列于表3中。
表3-头孢噻肟钠与头孢噻肟镁的稳定性结果
由表3可见，本发明所述头孢噻肟镁在不同注射液中的稳定性，含量变化比头孢噻肟钠变化更小，稳定性更好。
4、体外抑菌试验
根据徐淑云编写的《药理实验方法学》(第三版)，第63章中抗菌药物实验法，进行体外抑菌实验。
液体培养基的制备：精密称取牛肉膏2g、酵母3g、氯化钠5g、蒸馏水700ml混合，调节液体培养基的pH值为7.0左右，在蒸汽灭菌锅里高压灭菌30min，温度调至120℃，灭菌完毕后取出，分别放入6个锥形瓶中，每一个锥形瓶中液体培养基的体积为100ml，密封好，备用。
药液的制备：按照等摩尔的β-内酰胺环数精密称取头孢噻肟钠和头孢噻肟镁，加蒸馏水定容至10ml，稀释后使头孢噻肟钠和头孢噻肟镁药液浓度分别为32μg/ml、31.24μg/ml，采用0.22μm滤膜过滤，取续滤液，备用。
菌液的制备：将大肠埃希菌、白葡萄球菌第二代细菌从营养琼脂斜面上分别挑取一接种环的量，接种到2个带有液体培养基的锥形瓶中，轻轻摇晃锥形瓶后，放置在气浴恒温振荡器中，温度调节至37℃，培养24-48h后，观察液体变浑浊，即细菌复活成功。
比浊法实验：实验前，将所需实验用品120℃下高压灭菌30分钟，用紫外灯消毒实验室30min。在无菌操作条件下，取32支试管，分为四组，每支试管加入液体培养基，倍比稀释头孢噻肟钠和头孢噻肟镁药液。其中16支加入50μl白葡萄球菌液，其余16支加入50μl大肠杆菌液，再次放入恒温培养箱中培养18～24h，观察浊度。
抑菌效果评价：通过紫外分光光度计测量OD600值，3次重复实验均有抑菌效果，视为抑菌作用有效。
结果见表4、表5。
表4-头孢噻肟钠及头孢噻肟镁对白葡萄球菌的抑菌效果
表5-头孢噻肟钠及头孢噻肟镁对大肠杆菌的抑菌效果
从表4和表5可以看出，根据测量OD600值，确定头孢噻肟钠和头孢噻肟镁对2种耐药性细菌均有一定的抑制作用，随着药物浓度的升高，抑菌效果越明显。通过对比相同摩尔的β-内酰胺环数的头孢噻肟钠和头孢噻肟镁的OD值，在对白葡萄球菌的抑制作用上，头孢噻肟镁在31.24、7.81、3.9、1.95、0.49μg/ml浓度时，抑菌效果分别强于相同摩尔的β-内酰胺环数对应头孢噻肟钠在32、8、4、2、0.5μg/ml浓度；在对大肠杆菌的抑制作用上，头孢噻肟镁在3.9、1.95μg/ml浓度时，抑菌效果分别强于相同摩尔的β-内酰胺环数对应头孢噻肟钠在4、2μg/ml浓度，综合考虑，头孢噻肟镁盐对白葡萄球菌的抑制作用较强，强于头孢噻肟钠。
5、体内抗菌实验
(1)检测方法
将真空冻干保存的肺炎链球菌标准株用液体培养基溶解后，加入到含有10％小牛血清的营养肉汤中，7.5％二氧化碳，37℃培养24h。将复苏后的细菌传代至血琼脂平板培养基上，7.5％二氧化碳，37℃培养24h。使用前，在无菌超净台上用取菌环将细菌挑出，用无菌生理盐水稀释至适当浓度并检测600nm吸光度(A600nm)值为2.489。
大鼠适应性饲养一周后，每天早晚监测体温，连续监测3d。选择体温浮动小于0.5℃的大鼠纳入实验，随机分为6组，分别为空白组、模型组、头孢噻肟钠低剂量组、头孢噻肟钠高剂量组、头孢噻肟镁低剂量组、头孢噻肟镁高剂量组，每组10只。大鼠麻醉后，撑开大鼠口腔，充分暴露咽喉部，用连接注射器的气管导管经口缓慢插入气管，推入0.6ml菌液，空白组推入相同体积的生理盐水。接种后立即竖立大鼠，使大鼠保持直立位约20s，以保证接种菌液因重力作用而入肺。
头孢噻肟钠低剂量组22.5㎎/㎏，头孢噻肟钠高剂量组45㎎/㎏，头孢噻肟镁低剂量组21.2㎎/㎏，头孢噻肟镁高剂量组42.4㎎/㎏。尾静脉注射给药，一日两次，连续三天，空白组和模型组给予等体积生理盐水。
(2)观察内容及检测指标
观察大鼠生理病理状况是否主动摄食摄水；是否呆滞、竖毛、嗜睡；鼻腔及眼眶有无分泌物；有无气促，有无喘鸣音；尿色、量及粪便变化等。
末次给药12h后，腹腔注射4％水合氯醛10mg/kg麻醉，腹主动脉取血1.5mL于加有EDTA抗凝真空采血管中，混匀，血液分析仪测定全血WBC计数及分类。
取双肺用10％甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，切片，苏木素-伊红(HE)染色，于光镜下观察肝组织病理学变化。
采用SPSS 19.0统计软件处理实验数据，计量数据以x±s表示。组间均数比较采用单因素方差分析，以P＜0.05表示有统计学意义。
(3)检测结果
(3.1)一般状态
动物接种后第1天,给药组和模型组开始出现呼吸急促、嗜睡、进食减少、卷毛、对周围环境反应差。第2天动物进食、活动度明显下降，毛发直竖，卷曲于饲养笼角落，尤以模型组动物明显。头孢噻肟钠低、高剂量组较头孢噻肟镁组低、高剂量组呼吸急促，且进食量明显少于头孢噻肟镁组。第3天，给药组动物食欲、活动度上升，头孢噻肟钠组大鼠较头孢噻肟镁组呼吸依旧急促，模型组大鼠可闻及明显呼吸喘鸣声，体质量减轻，出现明显骨感。空白组大鼠食欲、活动度、体质量、体温较接种前无明显变化。
(3.2)血常规
(3.2.1)对白细胞数的影响
与空白组比较，模型组大鼠白细胞数显著上升(P＜0.01)；与模型组比较，各给药组大鼠白细胞数显著降低(P＜0.01)，说明头孢噻肟钠、头孢噻肟镁均对大鼠肺炎有治疗作用，并且与头孢噻肟钠低剂量组比较，头孢噻肟镁低剂量组的白细胞数降低更为显著(P＜0.05)。与空白组比较，头孢噻肟钠高剂量组差异显著(P＜0.01)，头孢噻肟镁高剂量组无明显差异。
(3.2.2)对中性粒细胞百分比的影响
与对照组比较，模型组大鼠中性粒细胞百分比显著上升(P＜0.01)；与模型组比较，各给药组大鼠中性粒细胞数显著降低(P＜0.01，P＜0.05)，说明头孢噻肟钠、头孢噻肟镁均对大鼠肺炎有治疗作用，并且与头孢噻肟钠低剂量组比较，头孢噻肟镁低剂量组的中性粒细胞百分比降低更为显著(P＜0.05)。与空白组比较，头孢噻肟钠高剂量组差异显著(P＜0.01)，头孢噻肟镁高剂量组无明显差异。
(3.2.3)对淋巴细胞百分比的影响
与对照组比较，模型组大鼠淋巴细胞百分比显著下降(P＜0.01)；与模型组比较，各给药组大鼠淋巴细胞数显著升高(P＜0.01，P＜0.05)。说明头孢噻肟钠、头孢噻肟镁均对大鼠肺炎有治疗作用，并且与头孢噻肟钠低剂量组比较，头孢噻肟镁低剂量组的淋巴细胞百分比升高更为显著(P＜0.05)。
结果见表6所示。
表6-头孢噻肟镁体内药效实验结果
注：与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与空白组比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与头孢噻肟钠低剂量组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
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