一种检测cyp 1a1酶的近红外荧光探针
阅读说明：本技术 一种检测cyp 1a1酶的近红外荧光探针 (Near-infrared fluorescent probe for detecting CYP 1A1 enzyme ) 是由 祁争健 代艳鹏 薛珂 赵鑫鑫 于 2021-05-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种检测CYP 1A1酶的近红外荧光探针,该荧光探针通过对分子结构进行修饰,使分子结构能够实现对CYP 1A1酶的特异性检测,从而具有高选择性；同时荧光探针中的荧光基团发出的荧光波长在近红外区域,因此在进行荧光检测时能够避免受生物体发绿光的干扰；其次,BrDXMM荧光性能很弱,而在相同条件下HDXMM具有良好的荧光发射光谱特性(590-800nm),从而能很好的进行区分,因此本发明荧光探针在体内外均具有高的信噪比；并且本发明荧光探针还具有良好的生物相容性,用含有BrDXMM(100μM)的培养基孵育细胞24小时,细胞活度仍大于85％；本发明荧光探针可用于溶液中重组单酶、活细胞、离体组织、活斑马鱼及荷瘤裸鼠体内CYP 1A1酶活性的测定,应用范围广。(The invention discloses a near-infrared fluorescent probe for detecting CYP 1A1 enzyme, which modifies a molecular structure to enable the molecular structure to realize specific detection of CYP 1A1 enzyme, thereby having high selectivity; meanwhile, the fluorescent wavelength emitted by the fluorescent group in the fluorescent probe is in a near infrared region, so that the interference of green light emitted by an organism can be avoided during fluorescence detection; secondly, the fluorescence property of BrDXMM is very weak, and HDXMM has good fluorescence emission spectral characteristics (590-800nm) under the same condition, so that the HDXMM can be well distinguished, and therefore, the fluorescent probe has high signal-to-noise ratio both inside and outside the body; the fluorescent probe also has good biocompatibility, and the cell activity is still more than 85 percent after the cell is incubated for 24 hours by using a culture medium containing BrDXMM (100 mu M); the fluorescent probe can be used for measuring the activity of the CYP 1A1 enzyme in recombinant single enzyme, living cells, isolated tissues, living zebra fish and tumor-bearing nude mice in a solution, and has wide application range.)
技术领域
本发明涉及一种检测CYP 1A1酶的近红外荧光探针。
背景技术
细胞色素P450酶(CYP450)是一种含亚铁血红素的单氧化酶超家族，是生物体内最重要的代谢酶。CYP450酶参与包括致癌物、化学品、药物以及许多内源性化合物的生物转化，对维持生物体正常生理功能起到重要作用。CYP450酶催化I相反应是人体代谢外源性和内源性化合物的关键步骤，其通常是药物从体内清除的限速步骤，对化合物的半衰期、清除率等至关重要。然而，CYP 1A1的分布存在很大的个体差异性，CYP 1A1酶的表达与遗传、性别、年龄、疾病、环境和共服药物等因素密切相关。为了解CYP 1A1酶在不同生物样品中的表达，荧光成像技术是最有力的工具之一。现有能够检测CYP 1A1酶的荧光探针基本都是发绿光，由于生物体本身也是发绿光，因此在进行荧光成像时会出现干扰问题，同时这些荧光探针能够同时检测多种亚型的细胞色素P450酶，如CYP 1A1、CYP 1A2，从而选择性不高，不能实现CYP 1A1酶的特异性选择。
发明内容
发明目的：本发明针对现有技术中CYP 1A1酶荧光探针存在的发绿光导致检测时受生物体干扰以及选择性不高的问题，提供一种检测CYP 1A1酶的近红外荧光探针，该荧光探针通过对结构进行修饰，使分子结构能够实现CYP 1A1酶的特异性检测，同时荧光探针中的荧光基团发出的荧光波长在近红外区域，因此能够避免受生物体发绿光的干扰。
技术方案：本发明所述的检测CYP 1A1酶的近红外荧光探针，所述荧光探针的结构式为：
本发明荧光探针检测CYP 1A1酶活性的具体流程如下：选择CYP 1A1酶催化的BrDXMM水解反应为探针反应，在特定时间内通过检测其水解产物2-((6-羟基-2,3-二氢-1H-黄酮-4-基)亚甲基)丙二腈(HDXMM)的生成量来评估活细胞、活体及离体组织中CYP 1A1酶的实际活性。酶促反应探针底物BrDXMM和水解产物HDXMM的荧光性能在相同条件下具有明显差异，因此BrDXMM可对多种生物体系中CYP 1A1酶的活性和分布进行评价。
其中，所述荧光探针对体外细胞中CYP 1A1酶的检测过程为：针对体外细胞，将荧光探针溶于PBS缓冲溶液中，其中，PBS缓冲溶液的pH值为7.4～7.5，溶液的温度为37℃，PBS缓冲溶液中，荧光探针的浓度为10μM；将细胞HepG2或LO2活细胞用含有荧光探针的培养基孵育，测定60分钟后细胞中荧光探针与CYP 1A1酶反应产生的水解产物的生成量作为CYP1A1酶活性的评价指标。
其中，所述荧光探针对斑马鱼体内CYP 1A1酶的检测过程为：将斑马鱼用含有荧光探针的培养液在室温下孵育，培养液中荧光探针的浓度为10μM，60分钟后测定斑马鱼体内荧光探针与CYP 1A1酶反应产生的水解产物的生成量作为评价斑马鱼体内CYP 1A1酶活性的指标。
其中，所述荧光探针对荷瘤裸鼠体内细胞中CYP 1A1酶的检测过程为：配制含荧光探针的生理盐水，将生理盐水注射至小鼠体内的肿瘤内，生理盐水中荧光探针的浓度为20μM，测定60分钟后细胞中荧光探针与CYP 1A1酶反应产生的水解产物的生成量作为CYP 1A1酶活性的评价指标。
上述检测CYP 1A1酶的近红外荧光探针的制备方法，将2-((6-羟基-2,3-二氢-1H-黄酮-4-基)亚甲基)丙二腈(HDXMM)、碳酸钾(作为碱中和反应生成的溴化氢)以及4-(2-溴乙氧基)苄溴置于反应瓶中，往反应瓶中再加入N,N-二甲基甲酰胺(在反应体系的作用是溶剂)，混合物料在氮气保护下加热至不低于90℃，反应后冷却至室温，将反应液加入到冷水中，剧烈搅拌，析出大量固体，过滤，滤饼采用柱层析法分离即可。
其中，所述2-((6-羟基-2,3-二氢-1H-黄酮-4-基)亚甲基)丙二腈(HDXMM)、碳酸钾和4-(2-溴乙氧基)苄溴的混合摩尔比为1：2：1.2。
其中，反应时间为至少1小时。
本发明荧光探针2-((6-((4-(2-溴乙氧基)苄基)氧基)-2,3-二氢-1H-黄嘌呤-4-基)亚甲基)丙二腈(BrDXMM)特定的分子结构只能进入CYP 1A1的酶腔中并与之发生酶催化的氧化水解反应，因此能够实现对CYP 1A1酶的特异性检测，2-((6-((4-(2-溴乙氧基)苄基)氧基)-2,3-二氢-1H-黄嘌呤-4-基)亚甲基)丙二腈中的2-溴乙氧基的碳氧键可被CYP1A1酶进行水解，然后通过分子内1,6-消除反应生成水解产物2-((6-羟基-2,3-二氢-1H-黄酮-4-基)亚甲基)丙二腈(HDXMM)，HDXMM被光激发后产生强烈的荧光发射；通过检测一定时间内HDXMM的生成量来测定不同生物样品中CYP 1A1酶的活性。
反应式为：
有益效果：1、本发明荧光探针通过对分子结构进行修饰，使分子结构能够实现对CYP 1A1酶的特异性检测，从而具有高选择性；2、荧光探针中的荧光基团发出的荧光波长在近红外区域，因此在进行荧光检测时能够避免受生物体发绿光的干扰；3、BrDXMM荧光性能很弱，而在相同条件下HDXMM具有良好的荧光发射光谱特性(590-800nm)，从而能很好的进行区分，因此本发明荧光探针在体内外均具有高的信噪比；4、本发明荧光探针具有良好的生物相容性，用含有BrDXMM(100μM)的培养基孵育细胞24小时，细胞活度仍大于85％；5、本发明荧光探针可用于溶液中重组单酶、活细胞、离体组织、活斑马鱼及荷瘤裸鼠体内CYP1A1酶活性的测定，应用范围广。
附图说明
图1为BrDXMM对单酶的荧光选择性响应；
图2为BrDXMM与不同酶反应后荧光强度的对比；
图3为白芦藜醇对CYP 1A1酶活性的抑制性；
图4为BrDXMM对HepG2和LO2细胞毒性；
图5为BrDXMM在HepG2细胞中的荧光成像；
图6为BrDXMM在LO2细胞中的荧光成像；
图7为BrDXMM在HepG2细胞中的时间依赖荧光成像；
图8为BrDXMM在LO2细胞中的时间依赖荧光成像；
图9为BrDXMM在斑马鱼体内的荧光成像；
图10为BrDXMM在荷瘤裸鼠活体的时间依赖荧光成像；
图11为BrDXMM在离体组织中的荧光成像。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
实施例1
本发明荧光探针2-((6-((4-(2-溴乙氧基)苄基)氧基)-2,3-二氢-1H-黄嘌呤-4-基)亚甲基)丙二腈(BrDXMM)采用如下方法制备而成：
将1mmol的HDXMM(本发明HDXMM采用下述文献公开的合成方法制得：Sensors&Actuators:B.Chemical 273(2018)167-175)，2mmol的碳酸钾以及1.2mmol的4-(2-溴乙氧基)苄溴置于25mL的两口瓶中，再往两口瓶中加入8mL的N,N-二甲基甲酰胺，在氮气保护条件下将反应物料加热至90℃，反应搅拌1个小时；反应后冷却至室温，将反应液加入到冷水中，剧烈搅拌，析出大量暗红色固体，过滤，滤饼采用柱层析法分离(展开剂为：乙酸乙醋：石油醚＝5:1，v:v)，得到暗红色固体(收率65.2％)。1H NMR(600MHz,DMSO)δ8.17(s,1H),7.44(d,J＝8.6Hz,1H),7.41(d,J＝8.7Hz,2H),7.36–7.34(m,2H),7.02–6.98(m,2H),6.93(dd,J＝8.6,2.4Hz,1H),5.11(s,2H),4.28–4.25(m,2H),3.96–3.94(m,2H),2.74(t,J＝6.0Hz,2H),2.63–2.59(m,2H),1.75(dt,J＝12.2,6.2Hz,2H).13C NMR(150MHz,DMSO)δ161.14,159.19,157.95,153.66,149.83,132.27,129.81,128.63,128.43,125.75,117.71,116.22,114.75,114.60,113.79,109.24,101.42,69.70,67.95,43.08,28.04,24.24,19.99.
实施例2：测定荧光探针BrDXMM对CYP450各个亚型的选择性
磷酸盐缓冲溶液(PBS)的配制：用分析天平称取二水合磷酸二氢钠(0.7410g)、十二水合磷酸氢二钠(7.2495g)和六水合氯化镁(0.2030g)置于100mL烧杯中，分4次往烧杯中加入二次蒸馏水(共200mL)充分溶解，静置，转移至250mL容量瓶中，并补加二次蒸馏水定容，充分振荡均匀，再用pH计检验缓冲液的pH。配制得到PBS缓冲液(0.1M,pH 7.4,c(MgCl2)＝4.0mM)，置于4℃储存。
反应底物溶液的配置：称取BrDXMM用二甲基亚砜溶解配置成浓度为5mM的母液。取40μL的母液加入到4.96mL的PBS缓冲液中，配置成40μM的反应底物溶液备用。
孵育体系NADPH还原系统的构成：β-烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(1.0mM)；葡萄糖-6-磷酸(10.0mM)；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(1.0unit/mL)；上述三种辅助酶均由0.1M的PBS缓冲液(0.1M,pH 7.4,c(MgCl2)＝4.0mM)进行溶解。CYP450单酶(CYP 1A1、CYP 1A2、CYP 2A6、CYP 2C9、CYP 2C19、CYP 2D6、CYP 2E1、CYP 2J2、CYP 3A4或CYP 3A5)。
在终体积为400μL孵育体系中分别加入上述葡萄糖-6-磷酸溶液100μL，β-烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸溶液50μL，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液5μL，以及5μL的CYP单酶(终浓度50nM)和10μL 40μM的反应底物溶液(BrDXMM在孵育体系中的终浓度10μM)，最后加入30μL的PBS缓冲液。然后将上述混合物混匀，在37℃恒温水浴下孵育60分钟。结束孵育时，向反应体系内加入的二甲基亚砜(200μL)以终止反应并混匀。将混合物低温离心(13,300×g,4℃)20分钟，取上清液用于荧光分析，通过图1可知，本发明荧光探针BrDXMM对CYP 1A1具有高的选择性。通过图2可知，本发明荧光探针BrDXMM对CYP 1A1的响应相对于其他亚型具有较高的对比度。
实施例3：荧光探针BrDXMM的化学抑制实验
在终体积为400μL的孵育体系中分别加入上述葡萄糖-6-磷酸溶液100μL，β-烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸溶液50μL，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液5μL，以及5μL的CYP 1A1(终浓度50nM)，白藜芦醇(终浓度25μM，CYP 1A1特异性抑制剂)，混匀后加入10μL、40μM的BrDXMM(终浓度10μM)，最后用PBS缓冲液稀释到响应的浓度。然后将上述混合物混匀，在37℃恒温水浴下孵育60分钟。结束孵育时，向反应体系内加入的二甲基亚砜(200μL)以终止反应并混匀。将混合物低温离心(13,300×g，4℃)20分钟，取上清液用于荧光分析，通过图3可知，本发明荧光探针BrDXMM确实由于CYP 1A1氧化水解产生了荧光响应。
实施例4：荧光探针BrDXMM的细胞毒性检测
通过MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)法测定细胞活性。首先分别将HepG2细胞(人类肝癌细胞)和LO2细胞(人类正常肝细胞)接种在96孔培养板中，加入含有10％胎牛血清(FBS)的培养基(100μL)，并在5％CO2中于37℃恒温培育24小时。将HepG2和LO2细胞的培养基换为含不同浓度BrDXMM(0,5,10,20,30,40,80,100μM)的培养基(100μL)继续培育24小时。吸除培养基并用PBS(100μL)洗涤细胞，向每个孔中加入100μL含有0.05％MTT的培养基，继续培育4小时。培养结束后，除去培养基并向各孔中加入150μL二甲基亚砜，低速振荡10分钟使孔内生成的甲臜溶解。最后，用酶标仪测量每个孔在490nm处的吸光度，并与对照组的吸光度(100％存活率)进行比较，得到荧光探针不同浓度下细胞的相对存活率，通过图4可知，本发明荧光探针具有良好的生物相容性。
实施例5：荧光探针BrDXMM细胞荧光成像实验
将HepG2或LO2细胞接种至共聚焦成像用细胞培养皿中，加入1mL相应的培养基(含10％胎牛血清)，在恒温培养箱中(5％CO2,37℃)培育24小时。然后用PBS(1mL)洗涤3次，再加入含有BrDXMM(10μM)的培养基与细胞共同孵育。30分钟后，用PBS(1mL)洗涤细胞3次。在抑制剂对照组中，细胞先用含白藜芦醇(25μM)抑制剂的培养液培养30分钟，然后用PBS(1mL)洗涤3次，最后含有BrDXMM(10μM)的培养基与细胞共同孵育。30分钟后，用PBS(1mL)洗涤细胞3次。最后在共聚焦显微镜下观察细胞内的荧光分布状态。激发波长561nm，荧光采集范围570-670nm，通过图5～6可知，本发明荧光探针BrDXMM可用于HepG2和LO2细胞内CYP1A1酶的定性检测。
实施例6：荧光探针BrDXMM在活细胞中的时间依赖的荧光成像实验
将HepG2或LO2细胞分别接种至共聚焦成像用细胞培养皿中，加入1mL相应的培养基(含10％胎牛血清)，在恒温培养箱中(5％CO2,37℃)培育24小时；然后用PBS(1mL)洗涤3次，再加入含有BrDXMM(10μM)的培养基与细胞共同孵育；30分钟后，用PBS(1mL)洗涤细胞3次；最后在共聚焦显微镜下观察不同时间点的细胞内的荧光发射强度变化。激发波长561nm，荧光采集范围570-670nm，通过图7～8可知，本发明荧光探针BrDXMM可用于HepG2和LO2细胞内CYP 1A1酶的快速(荧光响应时间短)定性检测。
实施例7：荧光探针BrDXMM在斑马鱼内的荧光成像实验
将购买来得斑马鱼胚胎放置在干净的培养皿中，加入E3培养液室温培养4天。荧光成像前，斑马鱼用含有BrDXMM(10μM)的E3培养液培养30分钟，然后用E3培养液洗涤斑马鱼三次。在抑制剂对照组中，斑马鱼先用含白藜芦醇(25μM)抑制剂的培养液培养30分钟，用E3培养液洗涤3次后再加入含有BrDXMM(10μM)的E3培养液培养30分钟，然后用E3培养液洗涤斑马鱼三次。最后在共聚焦显微镜下观察斑马鱼体内的荧光分布状态。激发波长561nm，荧光采集范围570-670nm，通过图9可知，本发明荧光探针BrDXMM可用于斑马鱼体内CYP 1A1酶的定性检测。
实施例8：荧光探针BrDXMM在荷瘤裸鼠体内时间依赖的荧光成像实验
将购买来的荷瘤裸鼠停止喂养24小时，期间只给蒸馏水喂食。活体成像前，将含有BrDXMM(20μM)的氯化钠注射液用一次性注射器直接注入裸鼠瘤体内，注射后立刻进行不同时间点的活体荧光成像拍照。激发波长580nm，荧光采集范围600～700nm，通过图10可知，荧光响应时间短，荧光探针能够与体内的CYP 1A1酶迅速发生反应，本发明荧光探针BrDXMM可用于荷瘤裸鼠体内CYP 1A1酶的快速定性检测。
实施例9：荧光探针BrDXMM离体组织中荧光成像实验
荷瘤裸鼠停止喂养24小时，期间只给蒸馏水喂食。解剖前，将含有BrDXMM(20μM)的氯化钠注射液用一次性注射器直接注入裸鼠瘤体内，60分钟后解剖出荷瘤裸鼠的各种组织(包括心、肝、脾、肺、肾和瘤体)进行生物成像拍照。激发波长580nm，荧光采集范围600～700nm，如图11所示，本发明荧光探针BrDXMM用于荷瘤裸鼠体内CYP 1A1酶检测后可长时间停留在肿瘤内不发生扩散，即说明荧光探针可在响应区域内特异性发光，而不会很快的扩散至其他内脏，从而其可以对肿瘤或体内CYP 1A1酶表达高的组织进行荧光示踪。
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