一种从枳实中分离橙皮素的方法
阅读说明：本技术 一种从枳实中分离橙皮素的方法 (Method for separating hesperetin from immature bitter orange ) 是由 李伟 黄华学 贺进军 黄�俊 宋谷良 江小龙 吴国亮 于 2021-09-01 设计创作，主要内容包括：一种从枳实中分离橙皮素的方法,包括以下步骤：(1)酶解：将木质素酶溶于水,加入至破碎的枳实原料中,混合均匀,室温酶解,得枳实酶解物；(2)加压水解：将所述枳实酶解物置于高压反应釜内,加入酸水,加热、加压水解,得反应液；然后将所述反应液冷却至室温,离心过滤,收集滤饼,用水将滤饼洗涤至中性,干燥滤饼,得枳实水解物；(3)回流提取：将所述枳实水解物用有机溶剂回流提取,得有机溶剂提取液；(4)脱色；(5)浓缩、结晶,即得橙皮素产品。本发明操作简便、对设备要求低、生产成本低、所得橙皮素产品的橙皮素含量高,收率高。(A method for separating hesperetin from immature bitter orange comprises the following steps: (1) enzymolysis: dissolving ligninase in water, adding the ligninase into the crushed immature bitter orange raw material, uniformly mixing, and performing enzymolysis at room temperature to obtain immature bitter orange zymolyte; (2) pressurized hydrolysis: placing the immature bitter orange zymolyte in a high-pressure reaction kettle, adding acid water, heating, pressurizing and hydrolyzing to obtain reaction liquid; then cooling the reaction liquid to room temperature, carrying out centrifugal filtration, collecting a filter cake, washing the filter cake to be neutral by using water, and drying the filter cake to obtain an immature bitter orange hydrolysate; (3) reflux extraction: carrying out reflux extraction on the immature bitter orange hydrolysate by using an organic solvent to obtain an organic solvent extracting solution; (4) decoloring; (5) concentrating and crystallizing to obtain the hesperetin product. The method has the advantages of simple and convenient operation, low requirement on equipment, low production cost, high hesperetin content of the obtained hesperetin product and high yield.)
技术领域
本发明涉及一种分离橙皮素的方法，尤其涉及一种从枳实中分离橙皮素的方法。
背景技术
橙皮素（hesperetin）属于二氢黄酮类化合物，是芸香科（Rutaceae）柑橘属（CitrusL.）植物果实中的主要活性成分。橙皮素在自然界中并非以橙皮素的形式存在，而是主要以橙皮苷（hesperidin）的形式存在。橙皮素是橙皮苷的糖基配体，其结构中含有酮羰基、醚基、甲氧基以及多个酚羟基，广泛应用于有机化学、医学、农学、食品等多个领域。
橙皮素不会在任何器官中积累，使用安全、无明显副作用。早期对橙皮素的药理作用研究主要集中在抗菌、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗变态反应、调血脂、增强免疫及抗癌等方面。近年来，有研究发现橙皮素及其衍生物还具有抗阿尔茨海默病，抗帕金森病，抗高血糖，抗蛇毒血凝酶，抗肺、肾、肝纤维化及对一些新的肿瘤的抑制作用等。
现有技术中，以橙皮苷为原料制备橙皮素的方法主要有：酸水解、碱水解和酶法水解。但这些方法都必须依赖于以高含量的橙皮苷成品为原料。而高含量的橙皮苷，首先必须从枳实、柑橘等天然植物资源中经提取、分离纯化、精制、干燥等步骤获得，且橙皮苷的每个生产步骤都会产生不同程度的损耗。因此，采用传统方法制备橙皮素，不仅步骤冗长、成本高昂，且橙皮苷的利用率也低。
CN103159725A公开了一种高纯度橙皮素的清洁化制备工艺，该方法是以橙皮苷为原料，经酸性甲醇水解、浓缩、沉淀、压滤、干燥，得到橙皮素。
CN101302210A公开了通过酸水解释放特定黄烷酮和二氢查尔酮的方法，该方法是以橙皮苷为原料，溶于含有有机酸的有机溶剂水溶液中，加热、加压水解，得到橙皮素。
CN101445530A公开了一种橙皮苷的高生物利用率衍生物的制备方法，是以橙皮苷为原料，经碱液溶解、添加有机溶剂溶解、预热、加盐酸回流反应、调酸、分离纯化得到橙皮素-7-葡萄糖苷和橙皮素。
CN106148446A公开了一种通过酶促水解新橙皮苷或橙皮苷制备橙皮素的方法，是以新橙皮苷或橙皮苷为原料，在α-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶以及激活剂的作用下酶解、制备色谱分离，得到橙皮素。
以上所述方法均是以橙皮苷或新橙皮苷为原料，成本高昂，且橙皮苷的利用率低。
CN102432575B公开了一种从枳实中提取高纯度橙皮素的方法，是以枳实为原料，经醇溶液回流提取三次、过滤、合并滤液减压浓缩、加入无机酸水解、乙醇精制等步骤，得到高纯度橙皮素。该方法虽然不需要获得高含量的橙皮苷产品，也省略了橙皮苷分离纯化、精制和干燥步骤，但是仍然需要橙皮苷提取和浓缩步骤，假如橙皮苷提取不彻底，橙皮苷的利用率仍然偏低。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种操作简便、对设备要求低、生产成本低、所得橙皮素产品的橙皮素含量高，收率高的从枳实中分离橙皮素的方法。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：一种从枳实中分离橙皮素的方法，包括以下步骤：
（1）酶解：将木质素酶溶于水，加入至破碎的枳实原料中，混合均匀，室温酶解，得枳实酶解物；
（2）加压水解：将步骤（1）所得的枳实酶解物置于高压反应釜内，加入酸水，加热、加压水解，得反应液；然后将所述反应液冷却至室温，离心过滤，收集滤饼，用水将滤饼洗涤至中性，干燥滤饼，得枳实水解物；
（3）回流提取：将步骤（2）所得的枳实水解物用有机溶剂回流提取，得有机溶剂提取液；
（4）脱色：往步骤（3）所得的有机溶剂提取液中加入脱色剂，保温搅拌脱色，趁热过滤，得脱色滤液；
（5）浓缩、结晶：将步骤（4）所得的脱色滤液减压浓缩，将所得浓缩液冷冻，搅拌析晶，过滤，将所得晶体干燥，即得橙皮素产品。
优选的，步骤（1）中，所述木质素酶的用量为枳实原料重量的0.5%～5%，优选1%～3%。使用木质素酶的目的，是将枳实原料的木质部组织结构软化并破坏，使枳实原料组织内部的橙皮苷与酸充分接触，从而节省酸的用量并缩短水解时间。若木质素酶的用量过少，将无法充分的达到上述目的；若木质素酶的用量过多，将增加生产成本、造成浪费。
优选的，步骤（1）中，所述水的体积用量为枳实原料重量的0.5～2倍（L/kg），优选1~1.5倍（L/kg）。加水的目的之一是将木质素酶溶解并活化，目的之二是将枳实原料充分浸润，使木质素酶与原料充分接触。
优选的，步骤（1）中， 木质素酶溶于水后，调节溶液pH值为4～7，优选4.5～6。调节至该pH值范围的原因是，木质素酶在该范围内能发挥最大的催化效果。
优选的，步骤（1）中，所述破碎的枳实原料的粒径为1～2mm。
优选的，步骤（1）中，所述酶解的时间为12～24小时，优选15~20小时。
优选的，步骤（2）中，所述酸水为盐酸或硫酸的水溶液；所述酸水的质量百分比浓度为0.5%～2.0%；所述酸水的体积用量为枳实原料重量的10～20倍（L/kg）。使用酸水的目的之一，是将枳实原料中的橙皮苷直接水解为橙皮素；目的之二是将枳实原料中的大分子杂质（果胶、蛋白质、纤维素等）水解为水溶性的小分子，从而除去。
优选地，步骤（2）中，所述水解的温度为98～140℃，优选105～120℃；所述水解的压力为0.05～0.5MPa，优选0.10～0.30MPa；所述水解的时间为1～3小时。本发明采用加压水解的方式，目的是减少酸的用量并缩短水解的时间。若水解的温度过低、压力过小或时间过短，会导致水解不完全，造成橙皮素的收率偏低；若水解的温度过高、压力过大或时间过长，不但会造成能源和物料的浪费，而且还有可能导致橙皮素分子结构破坏、造成橙皮素的收率偏低。
优选地，步骤（3）中，所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮中的一种或多种；所述有机溶剂的体积用量为枳实原料重量的5～10倍（L/kg）。
优选地，步骤（3）中，所述回流提取的时间为2～4小时。使用有机溶剂回流提取的目的，是将枳实水解物中的橙皮素浸出。若有机溶剂的用量过少或回流提取的时间过短，会无法充分的达到上述目的，造成橙皮素的收率偏低；若有机溶剂的用量过多或回流提取的时间过长，会造成能源和物料的浪费。
优选地，步骤（4）中，所述的脱色剂为活性炭、活性白土、硅藻土或氧化铝；所述脱色剂的用量为枳实原料重量的1%～5%；所述保温搅拌脱色的温度为50～80℃；所述保温搅拌脱色的时间为1～3小时。使用脱色剂搅拌脱色的目的，是除去有机溶剂提取液中的脂溶性色素和杂质，从而提高脱色滤液中产品的纯度。
优选地，步骤（5）中，所述浓缩液的固形物含量为10%～20%。
优选地，步骤（5）中，所述冷冻的温度为-10～10℃；所述搅拌的速度为30～90r/min；所述析晶的时间为12～24小时。冷冻、搅拌析晶的目的，是将浓缩液中的橙皮素充分析出，同时抑制和减少杂质的析出，提高橙皮素产品的收率和含量。若冷冻的温度过高、搅拌的速度过快或析晶的时间过短，都将导致橙皮素析出不充分，造成橙皮素的收率偏低；若冷冻的温度过低、搅拌的速度过慢或析晶的时间过长，都将导致杂质的析出，造成橙皮素的含量偏低。
本发明的原理是：枳实原料经木质素酶酶解后，植物组织被软化，加压水解过程中，被水解的成分更容易被无机酸水解。枳实中的果胶、蛋白质、纤维素等大分子杂质被酸水解为可溶于水的小分子杂质，可以通过离心过滤，水洗彻底除去。枳实中的橙皮苷被酸水解为不溶于水的橙皮素，从而保留在枳实水解物中。枳实水解物中的橙皮素经有机溶剂回流提取、脱色、浓缩、结晶，即得到高含量的橙皮素。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明操作简便、对设备要求低、生产成本低、适宜工业化生产；
（2）本发明所得橙皮素产品，橙皮素含量高；收率高；
（3）本发明不需要以高含量的橙皮苷成品为原料，省略了从天然植物资源中提取、分离纯化、精制、干燥等获得橙皮苷的步骤，避免了橙皮苷各个生产步骤的损耗，从而实现了自然资源中橙皮苷的充分利用，降低了生产成本。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明实施例所使用的原料枳实购于湖南新宁，其中，橙皮苷的含量为26.76%（折算为橙皮素的理论含量为13.24%）；本发明实施例所使用的原料或化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
本发明实施例中，采用高效液相色谱（HPLC）外标法测定橙皮苷和橙皮素的含量。
实施例1
（1）酶解：取枳实原料50kg，破碎至粒径为1～2mm，待用；将0.5kg木质素酶溶解于50 L纯水，并调节pH值4.5，再加入至破碎后的枳实原料中，搅拌混合均匀，室温酶解24小时，得枳实酶解物；
（2）加压水解：将步骤（1）所得的枳实酶解物置于高压反应釜内，加入1000 L酸水（质量百分比浓度为2.0%的稀盐酸），在温度为110℃、压力为0.15Mpa的条件下加压水解3小时，水解结束，将反应液冷却至室温，离心过滤，收集滤饼，用水将滤饼洗涤至中性，滤饼干燥，得枳实水解物；
（3）回流提取：将步骤（2）所得的枳实水解物用400 L乙酸乙酯回流提取2.5h，得乙酸乙酯提取液；
（4）脱色：往步骤（3）所得的乙酸乙酯提取液中加入2.3kg氧化铝，70℃保温搅拌脱色2小时，趁热过滤，得脱色滤液；
（5）浓缩、结晶：将步骤（4）所得的脱色滤液减压浓缩至固形物浓度为12.6%，将所得浓缩液冷冻至0℃，以45r/min的速度搅拌，析晶20小时，将晶体过滤，干燥，得橙皮素产品6.20kg。
经高效液相色谱（HPLC）外标法测定，本实施例所得橙皮素产品的橙皮素含量为98.07%，橙皮素的收率为91.85%。
实施例2
（1）酶解：取枳实原料50kg，破碎至粒径为1～2mm，待用；将1.2kg木质素酶溶解于100 L纯水，并调节pH值5.0，再加入至破碎后的枳实原料中，搅拌混合均匀，室温酶解20小时，得枳实酶解物；
（2）加压水解：将步骤（1）所得的枳实酶解物置于高压反应釜内，加入800 L酸水（质量百分比浓度为1.6%的稀盐酸），在温度为120℃、压力为0.26Mpa的条件下加压水解2.5小时，水解结束，将反应液冷却至室温，离心过滤，收集滤饼，用水将滤饼洗涤至中性，滤饼干燥，得枳实水解物；
（3）回流提取：将步骤（2）所得的枳实水解物用300 L甲醇回流提取3h，得甲醇提取液；
（4）脱色：往步骤（3）所得的甲醇提取液中加入2.0kg活性炭，56℃保温搅拌脱色3小时，趁热过滤，得脱色滤液；
（5）浓缩、结晶：将步骤（4）所得的脱色滤液减压浓缩至固形物浓度为14.9%，将所得浓缩液冷冻至-3℃，以90r/min的速度搅拌，析晶16小时，将晶体过滤，干燥，得橙皮素产品6.22kg。
经高效液相色谱（HPLC）外标法测定，本实施例所得橙皮素产品的橙皮素含量为97.71%，橙皮素的收率为91.81%。
实施例3
（1）酶解：取枳实原料50kg，破碎至粒径为1～2mm，待用；将0.9kg木质素酶溶解于70 L纯水，并调节pH值4.7，再加入破碎后的枳实原料中，搅拌混合均匀，室温酶解18小时，得枳实酶解物；
（2）加压水解：将步骤（1）所得的枳实酶解物置于高压反应釜内，加入900 L酸水（质量百分比浓度为0.8%的稀硫酸），在温度为107℃、压力为0.12Mpa的条件下加压水解2小时，水解结束，将反应液冷却至室温，离心过滤，收集滤饼，用水将滤饼洗涤至中性，滤饼干燥，得枳实水解物；
（3）回流提取：将步骤（2）所得的枳实水解物用300 L丙酮回流提取3.5h，得丙酮提取液；
（4）脱色：往步骤（3）所得的丙酮提取液中加入1.5kg硅藻土，50℃保温搅拌脱色3小时，趁热过滤，得脱色滤液；
（5）浓缩、结晶：将步骤（4）所得的脱色滤液减压浓缩至固形物浓度为16.2%，将所得浓缩液冷冻至5℃，以60r/min的速度搅拌，析晶24小时，将晶体过滤，干燥，得橙皮素产品6.14kg。
经高效液相色谱（HPLC）外标法测定，本实施例所得橙皮素产品的橙皮素含量为98.23%，橙皮素的收率为91.11%。
本申请说明书中所述室温指室内环境温度。
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