一种文冠果抗旱基因、snp及其应用
阅读说明：本技术 一种文冠果抗旱基因、snp及其应用 (Xanthoceras sorbifolia drought-resistant gene, SNP and application thereof ) 是由 刘肖娟 王利兵 毕泉鑫 于海燕 李迎超 于 2021-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种文冠果抗旱基因、SNP及其应用。属于分子标记技术领域。本发明利用全基因组的重测序和关联分析,找到与文冠果重要表型抗旱节水相关联的遗传位点SNP1以及候选基因XsGIR1。XsGIR1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示,变异位点SNP1为XsGIR1的205bp C→G。文冠果XsGIR1SNP标记的应用可以实现抗旱节水文冠果种质资源的快速识别,极大加快传统育种进程,是有效的遗传研究手段。(The invention discloses a xanthoceras sorbifolia drought-resistant gene, SNP and application thereof. Belongs to the technical field of molecular marking. The invention utilizes the re-sequencing and association analysis of the whole genome to find the genetic locus SNP1 and the candidate gene XsGIR1 associated with the important phenotype drought resistance and water conservation of the shinyleaf yellowhorn. The nucleotide sequence of the XsGIR1 is shown in SEQ ID No.1, and the variation site SNP1 is 205bp C → G of the XsGIR 1. The application of the xanthoceras sorbifolia XsGIR1SNP marker can realize the rapid identification of drought-resistant water-saving xanthoceras sorbifolia germplasm resources, greatly accelerate the traditional breeding process, and is an effective genetic research means.)
技术领域
本发明涉及分子标记技术领域，更具体的说是涉及一种文冠果抗旱基因、SNP及其应用。
背景技术
文冠果(Xanthoceras sorbifolium)为无患子科文冠果属植物，落叶亚乔木或大灌木，适应性和抗逆性较强，种质资源丰富，是固沙保土、涵养水源和改善生态环境的优良乡土经济树种。然而文冠果主要分布于水资源紧缺的地区，干旱严重抑制了文冠果的正常生长发育，干旱已经成为文冠果适生区拓展、造林成活率、丰产优产的重要限制因素。因此大力挖掘木本油料资源，进行文冠果抗旱性状的选育与改良工作，具有非常重要的现实意义。
近年来，随着测序技术的快速发展，全基因组重测序和关联分析(GWAS)已经被广泛应用于检测变异位点、优质性状定位、和群体进化等研究中。GWAS有别于传统的分子育种如限制性片段长度多态性(RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、SSR，利用的是基因组中数以百万计的单核苷酸多态性(SNP)标记，是复杂数量性状定位的有效手段，具有高分辨率和高通量的优点，可同时对多个复杂性状进行关联，检测多个等位基因。但在具体研究中也存在一定的不足，如候选基因确定的精度不够，假阳性等。为获得更精准的研究结果，在文冠果基因组测序完成的基础上，利用较大群体的全基因组的重测序和关联分析，找到与文冠果重要表型相关联的遗传位点以及候选基因，可以极大加快传统育种进程，是有效的遗传研究手段。
综上，提供一种与文冠果抗旱相关联的遗传位点及候选基因是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种文冠果抗旱基因、SNP及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种文冠果抗旱基因，所述抗旱基因命名为XsGIR1，其核苷酸序列如下：
ATGAGTCGAAGAAGTAATGGTCCCAAGCTTGAACTGAAGCTGAACCTATCACCTCCTAGGAATAGAGACCAGCAAGTTCAATCGCCCAACGGATCGGTTTCGTCATGGGAAATTTCAACGGAGAGTTCATGCGTGTCATCGGAGCCGGAAGACACGACCATGCATTATACAAGCAGCCCAGACACGACAAATTCAATGTTGTTGNTGGGGTGTCCTCGATGCTTTATGTATGTCATGTTGTCTGATGTCAATCCAAAATGTCCCAAGTGCAAGAGCACCGTTTTGCTTGATTTTCTCAACGAAGACAACCCCAAGAAGACTAGCAACTGA；SEQ.ID.NO.1；
其中N为C或G；
其氨基酸序列如下：
MSRRSNGPKLELKLNLSPPRNRDQQVQSPNGSVSSWEISTESSCVSSEPEDTTMHYTSSPDTTNSMLLXGCPRCFMYVMLSDVNPKCPKCKSTVLLDFLNEDNPKKTSN.；SEQ.ID.NO.2；
其中X为L或V。
一种与文冠果抗旱性状相关的SNP标记，命名为SNP1，所述SNP1位于XsGIR1基因的第205位，该位置的核苷酸为C或G。
文冠果抗旱基因XsGIR1及SNP标记的发现：本发明利用GWAS的方法，通过对320份文冠果种质资源进行重测序，得到了1个基因中1个显著性SNP位点与文冠果抗旱节水相关。根据NCBI的比对结果，该基因命名为XsGIR1，其cDNA全长为330bp，编码110个氨基酸，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。变异位点SNP1为XsGIR1的205bp C→G，氨基酸由Leu→Val。
一组用于检测文冠果抗旱性状的引物对，所述引物对的核苷酸序列如下：
5’-ATGAGTCGAAGAAGTAATGG-3’；SEQ.ID.NO.3；
3’-TCAGTTGCTAGTCTTCTTGG-5’；SEQ.ID.NO.4。
一种用于检测文冠果抗旱性状的试剂盒，包括上述的引物对。
上述的SNP标记、引物对或试剂盒在文冠果育种中的应用。
一种检测文冠果抗旱性状的方法，通过检测XsGIR1基因上的SNP1来确定，当SNP1的核苷酸为C时，文冠果不耐旱，当SNP1的核苷酸为G时，文冠果耐旱。
XsGIR1的205bp发生了C与G的转变，当205bp为C位点时可以被BseYI识别酶切。PCR扩增产物经BseYI酶切后，205bp处为C位点的目的片段被酶切成204bp和126bp两个片段，而突变成G位点的由于缺少BseYI识别位点，不能被酶切。不被酶切的大片段与文冠果的耐旱性关联，被酶切的小片段与文冠果的不耐旱性关联。
进一步的，包括如下步骤：
(1)提取待测文冠果的基因组DNA；
(2)利用上述的引物对对文冠果基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
(3)对所述PCR扩增产物进行检测分析。
提取待测文冠果质资源的基因组DNA，利用上述引物对进行PCR扩增，扩增产物进行BseYI酶切，并经琼脂糖凝胶电泳观察条带情况。根据条带数量识别抗旱节水文冠果种质资源，实现抗旱文冠果种质资源的选择性育种。
进一步的，所述PCR的扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，62℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
进一步的，所述PCR扩增体系如表1所示：
表1 PCR扩增体系
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：本发明利用全基因组的重测序和关联分析，找到与文冠果重要表型抗旱节水相关联的遗传位点SNP1，以及候选基因XsGIR1。文冠果XsGIR1 SNP标记的应用可以实现抗旱节水文冠果种质资源的快速识别，可以极大加快传统育种进程，是有效的遗传研究手段。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明实施例1中PCR结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；实施例中未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。
实施例1
(1)文冠果抗旱性检测
水分利用效率(WUE)是评价植物抗旱性的一个重要指标，δ13C(碳同位素比)是目前检测WUE最可信的方法之一。基于全球范围内调查的植物δ13C平均值(-28.74)，从而区分节水耐旱植物和耗水不耐旱植物。从2016年冬季至2017年6月中旬，试验地(辽宁省阜新市彰武县的文冠果种质资源圃)所在地连续200多天无有效降水，降雨量比同期均值减少80％，同时这一期间试验地无人工灌溉，根据水行业标准(SL424-2008)已达重度干旱。于2017年6月取上述24份文冠果成年树叶片，使用基于PDB的DELTA V Advantage同位素比率质谱仪(Pee Dee Belemnite)测量叶片δ13C值。结果如表2所示。
表2 24份文冠果成年树叶片的δ13C值
结果发现11份文冠果叶片δ13C值在-26.34～-27.39，为耐旱性文冠果；16份文冠果叶片δ13C值在-29.12～30.58，为不耐旱性文冠果。
(2)文冠果基因组DNA的提取
利用多糖多酚基因组DNA提取试剂盒提取上述27份不同抗旱性的成年树叶片的基因组DNA。
(3)PCR扩增与酶切
以文冠果基因组DNA为模板，以5’-ATGAGTCGAAGAAGTAATGG-3’，SEQ.ID.NO.3；3’-TCAGTTGCTAGTCTTCTTGG-5’，SEQ.ID.NO.4为引物，扩增XsGIR1目的片段。扩增产物用BseYI酶切，酶切产物用12％的琼脂糖凝胶进行电泳分离，紫外显影照相统计基因条带组成。结果如图1所示。
结果发现，27份文冠果成年树中有16份酶切产物中存在两条带，11份酶切产物中只存在一条特异条带，为XsGIR1-G等位变异。且该结果与上述δ13C值判定结果相对应。
综合发现耐旱型文冠果XsGIR1 205 bp位点为C，不耐旱型文冠果XsGIR1 205bp位点突变为G。XsGIR1 CAPS分子标记与文冠果抗旱性密切相关，开发的分子标记可进行抗旱节水文冠果种质资源的筛选鉴定。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 中国林业科学研究院林业研究所
<120> 一种文冠果抗旱基因、SNP及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (205)..(205)
<223> n=c或g
<400> 1
atgagtcgaa gaagtaatgg tcccaagctt gaactgaagc tgaacctatc acctcctagg 60
aatagagacc agcaagttca atcgcccaac ggatcggttt cgtcatggga aatttcaacg 120
gagagttcat gcgtgtcatc ggagccggaa gacacgacca tgcattatac aagcagccca 180
gacacgacaa attcaatgtt gttgntgggg tgtcctcgat gctttatgta tgtcatgttg 240
tctgatgtca atccaaaatg tcccaagtgc aagagcaccg ttttgcttga ttttctcaac 300
gaagacaacc ccaagaagac tagcaactga 330
<210> 2
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<222> (69)..(69)
<223> X为L或V
<220>
<221> UNSURE
<222> (69)..(69)
<223> The 'Xaa' at location 69 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (69)..(69)
<223> The 'Xaa' at location 69 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 2
Met Ser Arg Arg Ser Asn Gly Pro Lys Leu Glu Leu Lys Leu Asn Leu
1 5 10 15
Ser Pro Pro Arg Asn Arg Asp Gln Gln Val Gln Ser Pro Asn Gly Ser
20 25 30
Val Ser Ser Trp Glu Ile Ser Thr Glu Ser Ser Cys Val Ser Ser Glu
35 40 45
Pro Glu Asp Thr Thr Met His Tyr Thr Ser Ser Pro Asp Thr Thr Asn
50 55 60
Ser Met Leu Leu Xaa Gly Cys Pro Arg Cys Phe Met Tyr Val Met Leu
65 70 75 80
Ser Asp Val Asn Pro Lys Cys Pro Lys Cys Lys Ser Thr Val Leu Leu
85 90 95
Asp Phe Leu Asn Glu Asp Asn Pro Lys Lys Thr Ser Asn
100 105