一种烟草NtCLC-f基因突变体及分子鉴定方法和应用

文档序号：1948448 发布日期：2021-12-10 浏览：6次 >En<

阅读说明：本技术 一种烟草NtCLC-f基因突变体及分子鉴定方法和应用 (Tobacco NtCLC-f gene mutant and molecular identification method and application thereof ) 是由谢贺白戈张慧李勇苏家恩杨大海逄涛邹聪明费明亮范志勇刘家红于 2021-11-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种烟草NtCLC-f基因突变体及分子鉴定方法和应用,所述烟草NtCLC-f基因突变体为Ntclc-f,其为烟草NtCLC-f基因第1003位的C突变为T,形成终止密码子,使该基因提前终止；所述基因突变体Ntclc-f的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。本发明通过系统研究,首次提出了一种烟草NtCLC-f基因突变体及分子鉴定方法和应用,本发明提出的降低烟草烟叶中氯离子含量的NtCLC-f基因突变体Ntclc-f获得的烟草植株,烟叶中氯离子含量比对照降低28.6％,使烟叶的氯离子含量显著降低。(The invention discloses a tobacco NtCLC-f gene mutant and a molecular identification method and application thereof, wherein the tobacco NtCLC-f gene mutant is Ntclc-f, which is characterized in that C at the 1003 th site of the tobacco NtCLC-f gene is mutated into T to form a stop codon, so that the gene is stopped in advance; the nucleotide sequence of the gene mutant Ntclc-f is shown as SEQ ID N0.2. The invention provides a tobacco NtCLC-f gene mutant, a molecular identification method and application for the first time through systematic research, the content of chloride ions in tobacco leaves of tobacco plants obtained by the NtCLC-f gene mutant Ntclc-f for reducing the content of the chloride ions in the tobacco leaves is reduced by 28.6% compared with that of a reference, and the content of the chloride ions in the tobacco leaves is obviously reduced.)

技术领域

本发明涉及植物分子生物学技术领域，更具体地，涉及一种烟草NtCLC-f基因突变体及分子鉴定方法和应用。

背景技术

氯离子含量是烟草中重要的质量参数，烟叶中的氯离子含量以0.3％～0.8％作为合适，如果烟叶中氯离子含量过高，会影响卷烟制品的燃烧性，会造成卷烟制品的阴燃，从而会使卷烟制品的烟气中具有更多的一氧化碳及焦油，这样会危害消费者的健康。并且当氯离子含量更高的时候，会直接造成熄火的现象。

目前我国在种植蔬菜和粮食作物的时候，会使用大量的化肥农药，现在的化肥中含量大量的氯离子，而这些含有氯离子的化肥在使用的过程中会造成耕作土壤中氯离子含量的超标。而土壤氯离子含量的超标会造成栽培作物过量的吸收氯离子从而造成作物体内的氯离子含量超标，这样会影响农作物的品质。

为解决烟叶氯离子含量偏高的问题，采用低氯含量化肥是最直接的手段，但是考虑到低氯化肥的生产成本要显著的高于高氯含量化肥，因此化肥生产厂家与农民考虑到成本的因素，往往不会使用低氯化肥而使用高氯离子含量的化肥。另外现在中国的耕作土壤中氯离子含量超标已经较为严重，即便现在开始使用低氯离子含量的化肥也不能很快的解决作物尤其是烟草中氯离子超标的问题；因此传统的农艺措施很难改变目前烟叶中氯离子超标的问题。

因此，鉴于以上情况，有必要研究一种烟草NtCLC-f基因突变体及分子鉴定方法和应用以解决上述技术问题。

发明内容

本发明的第一个目的在于获得降低烟草烟叶中氯离子含量的烟草NtCLC-f基因突变体，第二个目的在于提供烟草NtCLC-f基因突变体Ntclc-f的分子鉴定方法，第三个目的在于上述烟草NtCLC-f基因突变体在降低烟草烟叶中氯离子含量的应用。

本发明的第一个目的是这样实现的，所述烟草NtCLC-f基因突变体为Ntclc-f，其为烟草NtCLC-f基因第1003位的C突变为T，形成终止密码子，使该基因提前终止；所述基因突变体Ntclc-f的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。

本发明的第二个目的是这样实现的，NtCLC-f基因突变体Ntclc-f的分子鉴定方法，所述突变体Ntclc-f的DNA片段是由以下引物对扩增得到，所述引物对的上游引物为NtCLC-fF，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示；下游引物为NtCLC-fR，其核苷酸序列如SEQID N0.4所示。

本发明的第三个目的是这样实现的，所述的烟草NtCLC-f基因突变体Ntclc-f在降低烟草烟叶中氯离子含量的应用。

本发明还提供一种NtCLC-f基因突变体的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

1、EMS诱变烟草种子：

先将烟草种子用次氯酸钠清洗消毒，然后用蒸馏水洗干；再将烟草植株用磷酸缓冲液浸泡，以增加种子的萌发率；将浸泡获得的烟草种子放置于0.5％的EMS(甲基磺酸乙酯)溶液中浸泡10-15小时，然后进行离心滤干烟草种子。将离心滤干的烟草种子用蒸馏水漂洗50次，充分洗去EMS溶液，将EMS废液用氢氧化钠处理，以免造成污染。

2、筛选获得突变体植株：

首先提取突变体烟草DNA；以突变体材料的DNA为模板设计特异引物进行PCR扩增；

上游引物为NtCLC-fF:CCATTGTATCTGATACTGGGGATG

下游引物为NtCLC-fR：CATTCCCTGGAATAGCTGAATTTAT

将扩增获得的PCR产物进行测序分析，分析测序结果获得突变体材料，挑选提前终止的烟株为候选突变体材料；将所述候选突变体材料自交收种获得M2种子；种植所述M2种子获得M2突变体植株，用上游引物NtCLC-fF和下游引物NtCLC-fR鉴定突变体，最终获得纯合突变植株；检测所述纯合突变体烟株中氯离子含量。

本发明的有益效果是：

1、本发明提供的烟草NtCLC-f基因突变体是将烟草种子经诱变后造成烟草NtCLC-f基因第1003位的C突变为T而获得，该突变可显著降低烟草烟叶中氯离子含量。

2、本发明采用EMS诱变的手段，在栽培烟草中直接敲除氯离子转运相关基因创制低氯离子含量烟草品种，通过采用此分子手段敲除烟草中特定的吸收氯离子通道的分子鉴定方法，在降低烟草烟叶氯离子含量中具有良好的应用前景。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为本发明突变体测序结果图；

图2为本发明突变体扩增条带图；

图3为本发明突变体与野生型单株氯离子含量对比示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

随着分子生物学技术的发展，采用分子手段敲除烟草中特定的吸收氯离子的通道是解决烟草烟叶中的氯离子含量高的一种手段；通过采用EMS诱变的手段在栽培烟草中直接敲除氯离子转运相关基因是创制低氯离子含量烟草品种的有效方法。

实施例1，本发明的第一方面，提供了降低烟草烟叶中氯离子含量的烟草NtCLC-f基因突变体的获得，所述烟草NtCLC-f基因突变体为Ntclc-f，与核苷酸序列为SEQ ID No：1所示的野生型烟草基因相比，突变体含有NtCLC-f基因序列的1003位的C突变为T，于是碱基发生从谷氨酰胺到终止突变的变化，形成终止密码子，使该基因提前终止；所述基因突变体Ntclc-f的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。

烟草野生型烟草植株NtCLC-f基因的cDNA序列如下所示：

如图1所示，本发明发生NtCLC-f基因的第1003位的C突变为T，获得突变体Ntclc-f，在上述野生型烟草植株序列的加框示出处突变为T。该位点的单核苷酸改变将导致NtCLC-f基因编码的氨基酸序列在突变位点之后发生改变，形成终止密码子，使该基因提前终止。

通过测序筛选纯合突变植株并收种，获得具有突变体Ntclc-f的可显著降低烟叶氯离子含量的M2代烟草种子；根据本发明的实施例，该突变体的核酸为培育低氯离子含量烟草品种提供基因资源。

本申请中的基因序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。

通过对比发现，与SEQ ID NO.1相比，本发明的烟草NtCLC-f基因突变体Ntclc-f的cDNA具有c.1003C>T突变，进而，其编码产物与野生型的NtCLC-f氨基酸序列相比，在突变位点之后发生改变，形成终止密码子，使该基因提前终止。综上，存在c.1003C>T突变可显著改变NtCLC-f基因的功能。

实施例2，请参考图2，根据本发明的第二方面，提出了烟草NtCLC-f基因突变体Ntclc-f的分子鉴定方法，突变体Ntclc-f的DNA片段是由以下引物对扩增得到，所述引物对的上游引物为NtCLC-fF，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示；下游引物为NtCLC-fR，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。

1、烟草突变材料的获得方法：

(1)先将烟草种子用次氯酸钠清洗消毒，然后用蒸馏水洗干；

(2)将烟草植株用磷酸缓冲液浸泡，以增加种子的萌发率；

(3)将浸泡获得的烟草种子放置于0.5％的EMS(甲基磺酸乙酯)溶液中浸泡10-15小时，然后进行离心滤干种子；

(4)将种子用蒸馏水漂洗50次，充分洗去EMS溶液，获得烟草突变材料。将EMS废液用氢氧化钠处理，以免造成污染。

2、具体的烟草NtCLC-f基因突变体Ntclc-f的制备方法为：

筛选获得突变体Ntclc-f：

(1)将上述获得的突变体材料DNA为模板设计特异引物进行PCR扩增，

上游引物为NtCLC-fF:CCATTGTATCTGATACTGGGGATG

下游引物为NtCLC-fR：CATTCCCTGGAATAGCTGAATTTAT

PCR反应条件如下：

扩增条带如图2所示。

(2)将扩增获得的PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，采用Qiagen公司PCR产物纯化试剂盒，按照产品说明回收纯化所述的PCR产物，并用Invitrogen测序，验证序列结果如图1所示；

(3)将候选突变体材料自交收种获得M2种子；

(4)种植M2种子获得M2突变体植株，用上游引物NtCLC-fF和下游引物NtCLC-fR鉴定突变体，最终获得突变体为Ntclc-f的纯合突变植株。基因突变体Ntclc-f与核苷酸序列为SEQ ID No：1所示的野生型烟草基因相比，突变体含有NtCLC-f基因序列的第1003位的C突变为T，于是碱基发生从谷氨酰胺到终止突变的变化，形成终止密码子，使该基因提前终止，所述基因突变体Ntclc-f的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。

实施例3：本实施例分别对野生型烟草、及实施例2中获得的具有基因突变体Ntclc-f的烟草进行氯离子含量测定。氯离子含量测定依据YC/T 162-2011《烟草及烟草制品氯的测定连续流动法》进行测定。

原理：用5％乙酸水溶液萃取烟草样品中的氯离子，萃取出的氯离子与硫氰酸汞进行反应，释放出硫氰酸根，进而硫氰酸根与三价铁反应形成络合物，反应产物在460nm或480nm进行比色测定。

本实施例所用仪器设备为：连续流动分析仪-(美国API)(德国SEAL AA3)(法国ALLIANCE)。

本实施例所用实验器皿：水平振荡摇床、天平-感量0.0001g、150mL三角瓶或塑料瓶、橡胶塞子、滤纸。

配置试剂Brij 35溶液(聚乙氧基月桂醚)：1L水中加5滴22％Brij35后搅拌均匀。

本实施例所用显色剂的制备方法为：(1)称取硫氰酸汞[Hg(SCN)₂]2.1g于烧杯中，加入甲醇溶解，转入500mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到硫氰酸汞储备液；(2)称取硝酸铁[Fe(NO3)₃·9H2O]101.0g于烧杯中，加入15.8mL硝酸(HNO3)，用水溶解，转入500mL容量瓶中，用水定容至刻度，得到硝酸铁储备液；(3)分别取硫氰酸汞储备液和硝酸铁储备液240mL于1000mL容量瓶中，用水定容至刻度，加入1mLBrij35，可得到显色剂。

显色试剂：在1L的烧瓶中，将520mg Hg(SCN)₂溶于200mL甲醇，加入600mL蒸馏水，摇匀；加入63mLHNO3，摇匀；加40g Fe(NO3)₃.9H20并使之溶解，加纯水稀释到1000mL。

分析步骤：分别称取0.3g烟样于150mL三角瓶或塑料瓶中(精确至0.0001g)；加入50mL乙酸(5％)溶液盖上塞子；振荡器上振荡萃取30min；用滤纸过滤上机。(如样品液浓度超出工作标准液的浓度范围，则应稀释)。

以干基计的氯含量，由以下公式计算得出：

式中：

C——样品液总植物碱的仪器观测值，单位为毫克(mg/mL)；

V——萃取液的体积，单位为毫升(mL)；

m——试料的质量，单位为毫克(mg)；

W——试样的水分含量。

经过测定，没有突变的野生型烟草中氯离子平均含量为0.35％，而NtCLC-f位点发生突变烟草的氯离子平均含量为0.25％(如图3所示)，NtCLC-f位点发生突变烟草相对于没有突变的野生型烟草的氯离子平均含量降低了近28.6％，氯离子有了极大的降低，因此NtCLC-f位点发生突变的烟草对于烟草育种具有极大的价值，可见，所述烟草NtCLC-f基因突变体Ntclc-f对于烟草育种具有极大的应用价值。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

序列表

<110> 云南省烟草农业科学研究院

<120> 一种烟草NtCLC-f基因突变体及分子鉴定方法和应用

<130> 2021

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2178

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

atgacgggag gcgagtacag cgatcacaat gttttattac gttctacttc atcggcgtca 60

gaaggcgatt tagaaagcca gtcgccgagg agaacgaata ccagaagcat taaggatcta 120

ttaaagcggt tggatcgagg gttttcgggt cggcgatcag agagggacca aaactcgtcg 180

tcttctcctt cttctaatcg cggtgtttcg gatgaagttc tcggcgatag tgctccaccg 240

gaatgggcga tgttgcttgt tggatgtctc cttggccttg ctactggcct ttgtgttgct 300

gcctttaacc gcggggtaca cgtaatacac gagtgggcgt gggctggtac tcctaatgat 360

ggtgctgctt ggcttcgttt gcaaaggcta gctgatactt ggcaccggat acttttaata 420

ccagttttgg gtggagtcat tgttggcatg ctgcatggtc tgcttgaaat attggaccaa 480

ataacacagt ccagctcttc tcagggacaa ggatttgatt tgattgctgg aatcttccct 540

acagtgaagg ccactcaggc tgctatcact ctgggtactg gttgttcttt gggtcctgaa 600

ggccctagtg tagatattgg gaagtcatgt gcctatggat gctccatgat gatggaaaac 660

aaccgggaaa ggagaatagc tctcattgca gctggtgcag ctgctggaat tgcttcaggt 720

ttcaatgcag cggtagcagg ttctttcttt gcgattgaaa cagttttaag accactccgt 780

gcagaaaatt cacccccatt tacaactgca atgatcatat tggcttctgt tatatcatca 840

actgtatcaa atgcagtact tggcgagaaa caggctttca cagtgcccac gtatgatatg 900

aaatctgctg ctgagcttcc attgtatctg atactgggga tgctgtgtgg agtagtaagt 960

gtggctttca ctcgattggt gtcctggttc accaaggggt ttcagttcct caaggaaaaa 1020

tttggacttc ctgatgttgt ctgccctgcc ttggggggtt taggagctgg tgtaatagct 1080

cttagatatc ctggaattct ctattggggt ttcactaatg ttgatgaaat ccttcatact 1140

gggaagactg catctgcacc tggaatcgga ttgctagccc aattagttgc tgctaaagtc 1200

gtggccactg ctttgtgcaa agggtctggc cttgttggtg gattgtatgc accaagttta 1260

atgataggtg ctgctgtagg tgctgtattt ggagggctag ctggggaact aataaattca 1320

gctattccag ggaatgctgc tattgcccag ccacaggcat atgcactggt gggaatggct 1380

gctacactag cttccgtttg ctcagtgcct ttgacttcag tgctcttatt gtttgagttg 1440

acaaaagatt atagaatttt gcttcctctc atgggtgctg ttggactggc aatatgggtg 1500

ccttctgtta cagaccagcc aaaggaaacg gaggtatcag aagcgaaatt tgcatcaaaa 1560

ggttactcaa ttctttcacc ggttgatgag aaaaatgaag ggaatgttcc gaggaaatct 1620

ggtgagggaa atgacttgga actattggtg attgggagtc ataatagtcg tgaatcattt 1680

gatgaaggtc tcattctgga agatctaaag gtttctcagg ccatgtcaaa tgattatttg 1740

aaggtctctc caagccaaac tgtgaaagaa gctttagagt gcatgcatga cggccaacag 1800

aattgcgttg ttgtggttga tgctgaaggt tacttggaag gaattttaac atatggtgac 1860

gtcaaaagaa gtttgtttaa gagccatggg gattcttcta acagtgattt atcagtcaca 1920

gatgcaaata cttgtcttgt gtcctctata tgcataagag gaataagcta tcgtggccaa 1980

gattgtggac tcctaacttg ttatcctgat acggatctag caactgcaaa gcaactaatg 2040

gaggccaaag gaattaaaca attgcctgtg gtcaaacgtg gtggagaatt cagaagagaa 2100

agaaagcgca gaactattgc tattttgcgt tatgattcaa tagaggagtc aatcaggttt 2160

tgcatctttt caatgtag 2178

<210> 2

<211> 2178

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2