具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

近年来随着我国经济实力的飞速提高，花卉行业也得到了前所未有的发展，如今人们已经不再满足于常见的花卉种类，而是追求有一定观赏价值和收藏价值的奇特花卉和名贵花卉，人们更加青睐于花卉的组合盆栽，既美观又小巧，可以摆放在桌面等任何需要装饰的地方。小兰屿蝴蝶兰作为一种当代最具观赏性的兰科植物，因其艳丽的花色和独特的花型而受到大家的青睐，而小兰屿蝴蝶兰的叶片长而宽，为组花带来了操作的困难，且杂乱无章使其观赏性极具下降。因此如何提供一种小巧美观的小兰屿蝴蝶兰受到了越来越多的关注。下面以具体地实施例对本发明的技术方案以及本申请的技术方案如何解决上述技术问题进行详细说明。

小兰屿蝴蝶兰基因的提取

1、使用试剂盒为RNAplant(市售)提取小兰屿蝴蝶兰叶片总RNA，利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA；

2、根据转录组测序结果设计引物，引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，采用RT-PCR方法从蝴蝶兰cDNA中扩增出一条1746bp的条带，将PCR产物回收，获取其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因，命名为PeGRF6。该核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，由581个氨基酸组成，分子量为63.061千道尔顿。

PeGRF6在小兰屿蝴蝶兰叶片发育的不同时期的表达谱验证

1、使用试剂盒为RNAplant(市售)提取小兰屿蝴蝶兰发育不同时期的叶片的RNA，利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA；

2、根据转录组测序数据设计荧光实时定量的引物(按照实验要求扩增片段为100-300bp，所以筛选出最适宜的一对引物来扩增PeGRF6的部分片段来反映PeGRF6在叶片发育各个时期的相对表达量的变化情况)，引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；

3、以不同发育时期的小兰屿蝴蝶兰(图1a所示的五组叶片)反转录得到的cDNA为模板，对PeGRF6基因进行表达谱验证。观察PeGRF6的表达在小兰屿蝴蝶兰叶片发育不同时期的表达量，结果如图1b所示，PeGRF6在叶0表达较高，说明PeGRF6可能参与小兰屿蝴蝶兰幼嫩新叶发育的形成。

CymMV病毒诱导小兰屿蝴蝶兰PeGRF6基因沉默

1、将PeGRF6基因的开放阅读框200-300bp可操作地连接于CymMV病毒载体，形成含有该基因片段的CymMV-PeGRF6载体，然后将载体转入农杆菌(GV3101)，得到重组表达转化体；

2、将重组表达转化体，在5ml含有100μM的乙酰丁香酮和50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，在28℃，200rpm培养16h，从而实现农杆菌菌体的活化，使农杆菌菌体大量扩繁并达到侵染植物体的最适浓度；随后继续在5ml含有100μM的乙酰丁香酮和50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，在28℃，200rpm培养13-16h，将培养得到的重组表达转化体进行继代培养直到OD600达到0.8-1.0；

3、取步骤2中含有重组表达转化体的农杆菌菌液，转移至50ml离心瓶中，并在4℃，3000g下离心10分钟，离心后，除去上清液。加入300μl含100μM乙酰丁香酮的MS培养基，使细胞沉淀重悬，在室温下静置0.5h；

4、使用带有针头的1ml注射器吸取静置后的农杆菌转化液，注射于小兰屿蝴蝶兰叶片；

5、注射后培养30-40天，观察小兰屿蝴蝶兰叶片，处理后的小兰屿蝴蝶兰为实验组，命名为pCymMV-PeGRF6，同时设置对照组，命名为pCymMV-EV。

如图2-3所示，实验组pCymMV-PeGRF6的叶片较于对照组生长缓慢，出现“瘦身化”的生长趋势。

CymMV病毒诱导小兰屿蝴蝶兰叶片细胞数目和体积的观察

1、选取如图2所示的实验组和对照组新长出的叶片，用切割刀在叶片表皮切割部分表皮组织，之后放置在载玻片上并加水、盖上盖玻片，制作简易的植物组织切片；

2、将所述植物组织切片放置在显微镜台上用40×镜观察切片并保存图片，如图4a-4b所示，实验组pCymMV-PeGRF6新叶中细胞数量明显多于对照组新叶中的细胞数量，细胞体积明显低于对照组；

3、将图片进行细胞数目和体积的详细计算，并汇总数据通过prism的绘图软件进行制作，得到如图5-6所示的结果，其结果与图4a-4b呈现出相同规律。

CymMV病毒诱导小兰屿蝴蝶兰突变株系中，PeGRF6基因及细胞周期蛋白基因的表达验证

1、使用试剂盒为RNAplant(市售)提取如图2所示实验组和对照组新长出的叶片的总RNA，利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA；

2、根据转录组测序数据设计引物，引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；

3、以如图2所示的叶片的反转录得到的cDNA为模板，对PeGRF6进行基因表达效率验证。观察到PeGRF6和细胞周期蛋白家族基因(PeCycs家族的基因名为横坐标)的表达量在VIGS沉默突变株系的叶片中的表达量均下降，如图7-8所示。

CymMV病毒诱导小兰屿蝴蝶兰叶片花青素含量和叶绿素含量的测定

1、选取如图2所示的实验组和对照组新长出的叶片，分别称取6组，每组0.2g。在40X显微镜下观察细胞状态，如图9a-9b所示。

为了进一步验证细胞中叶绿素和花青素含量，本实施例将材料均分，一半的实验组新叶与对照组株系的新叶材料置于加入叶绿素提取液(70％丙酮+20％乙醇+10％水)，使叶片全部浸没在提取液中，4℃摇床轻摇过夜，直至叶片中的叶绿素全部进入提取液中；一半的小兰屿蝴蝶兰VIGS沉默株系与对照组株系的新叶材料置于加入5ml花青素提取液(90％(V/V)乙醇：0.4mol·L-1盐酸＝1：1)，水浴高温40℃，浸提24h；

2、将所述材料的叶绿素提取液在选用相应的波长(663nm和645nm)，在分光光度计上测定吸光度；将所述材料的花青素提取液摇匀后在519nm波长处测定吸光度；

3、将所述材料的叶绿素提取液的吸光度作为数据，带入下列公式中计算叶绿素总含量，公式如下：

Chla(mg/L)＝12.7×A663-2.69×A645

Chlb(mg/L)＝22.9×A645-4.68×A663

叶绿素总量Chl(mg/L)＝Chla+Chlb＝20.2×A645+8.02×A663

样品中叶绿素含量(mgChl/g)＝比色杯中叶绿素含量×稀释倍数/样品量(g)

A645和A663分别为645nm和663nm处的吸光度；

将所述材料的花青素提取液的吸光度作为数据，带入下列公式中计算花青素总含量，公式如下：花青素含量(μg)＝A519×n×V/0.0772

A519为519nm处的吸光度，n为稀释倍数，V为花青素提取液总体积，0.0772为吸收系数；

5、将数据最终通过prism的绘图软件进行图标数据的呈现，根据图10-11可知，CymMV病毒诱导小兰屿蝴蝶兰突变株系的新叶中叶绿素和花青素含量明显提高。

此外，本发明还提供了如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列，其分别为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列衍生产生的核苷酸序列、与SEQ ID NO.1具有至少80％同源性的核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO.1所示的序列相同的效果。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 上海师范大学

<120> 一种调控蝴蝶兰叶片发育的基因PeGRF6及其应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1746

<212> DNA

<213> 小兰屿蝴蝶兰（Phalaenopsis equestris）

<400> 1

atggacttgg gttgttccct gagcacggat ggcttggtcc ctgtctcgtc tgaccccaat 60

gttctcatcc cctccttttt tcccttggac tccgaaccca gcaagcaaag ggggctgttt 120

caatccagtt tctccaagca tggaagatct gtcgtggttg aggaggatga tgagtactgg 180

actcgtttga agacggctag aggggatcca atgctcacat caacaagcaa ggcggcaact 240

tgcctccttg gatccggctc tcactccctc ttccctgatg gagagcaaat gctgaacttt 300

tcttcatgga aatcagatgc tctggtgctc aataatcatt ggaactcacc ttccttcaac 360

catccttcat catcttcagc ttaccctact ttcaggaatg cagcgtgctc tggcaatcca 420

acccttaaca ttcaaggagc tgtgtctgag atcagtggac ccttcaccac ttctcagtgg 480

tcagaactgg agcaacagac tctgatctac aaatatattg atgcaaaagt tccattacca 540

tctaatttgc tcttgtcaat cagacgaagc atcaaccctt ctgggttgtc ttccttcatt 600

gctggaactt atagaccagc aggcacattg ggatggggaa atttccatct gggtttggct 660

ggaagtgctg atccggagcc tggcagatgc cgtcgaacag atgggaaaaa atggcggtgt 720

tcgagggatg cagttgtgga tcagaagtac tgcgagcgac acatgaaccg tggtcgccat 780

cgttcaagaa agcgtgtgga aggccacaat ggccatgctg ccaaggctgc tgtgcctgct 840

gccattactt cgtcgcaatc ggcatcggct ctttccagtg gtggttcttc taataatctc 900

gccgtggctc agcagcagag caaaaacata caaccaagct tcacggaacc ttcatctctg 960

caattggata ggttactgat gaacagagac aatacaaatg tacaaagaca agatgccaaa 1020

ggcctctccg tgctgactga tgtaaactca aaatccacag gtaccttgtt gcccatgtcc 1080

aaacaactaa atccctttga agaaacttca acccgtgtag acttgggact tgtatcaact 1140

gattctgtac ttaataatga agggaactgc tcctcagaga atctcagttt tgttttttat 1200

cactctgaaa tgaatgatca gcacactcga tcccatccct ttcccttccg acattttatt 1260

gatgactggt ccaaaacacc atctgatggg atggaaaaga agcaatcaaa cagaactgaa 1320

ctctccattt caatccccat ctcctcctcc gccaaccaag acaagctgtc attttcccct 1380

ctcaggctat cttgtgagtt caatcctacg aatgatggca cccaaagggg tttaagttgg 1440

atacccattt cgtgggagcc aaacattggc ggacctcttg gggaggtttt gaccaacacg 1500

agcagtacta ccccaaagga tcttagtagc aatttatcag cttcatctct gaacctcatg 1560

actgatgggt ggaactccaa ggctagattt gaatcatcgc ccacaggagt gttgcaggag 1620

tctggctttg gttcgttgtc cagcagtgca ggaagcagcc cccgggcaga gaaccataag 1680

gctcacgaaa gtgatgacct acttggctca acctttgtga atttatcaac gaacccctcg 1740

ctctaa 1746

<210> 2

<211> 581

<212> PRT

<213> 小兰屿蝴蝶兰（Phalaenopsis equestris）

<400> 2

Met Asp Leu Gly Cys Ser Leu Ser Thr Asp Gly Leu Val Pro Val Ser

1 5 10 15

Ser Asp Pro Asn Val Leu Ile Pro Ser Phe Phe Pro Leu Asp Ser Glu

20 25 30

Pro Ser Lys Gln Arg Gly Leu Phe Gln Ser Ser Phe Ser Lys His Gly

35 40 45

Arg Ser Val Val Val Glu Glu Asp Asp Glu Tyr Trp Thr Arg Leu Lys

50 55 60

Thr Ala Arg Gly Asp Pro Met Leu Thr Ser Thr Ser Lys Ala Ala Thr

65 70 75 80

Cys Leu Leu Gly Ser Gly Ser His Ser Leu Phe Pro Asp Gly Glu Gln

85 90 95

Met Leu Asn Phe Ser Ser Trp Lys Ser Asp Ala Leu Val Leu Asn Asn

100 105 110

His Trp Asn Ser Pro Ser Phe Asn His Pro Ser Ser Ser Ser Ala Tyr

115 120 125

Pro Thr Phe Arg Asn Ala Ala Cys Ser Gly Asn Pro Thr Leu Asn Ile

130 135 140

Gln Gly Ala Val Ser Glu Ile Ser Gly Pro Phe Thr Thr Ser Gln Trp

145 150 155 160

Ser Glu Leu Glu Gln Gln Thr Leu Ile Tyr Lys Tyr Ile Asp Ala Lys

165 170 175

Val Pro Leu Pro Ser Asn Leu Leu Leu Ser Ile Arg Arg Ser Ile Asn

180 185 190

Pro Ser Gly Leu Ser Ser Phe Ile Ala Gly Thr Tyr Arg Pro Ala Gly

195 200 205

Thr Leu Gly Trp Gly Asn Phe His Leu Gly Leu Ala Gly Ser Ala Asp

210 215 220

Pro Glu Pro Gly Arg Cys Arg Arg Thr Asp Gly Lys Lys Trp Arg Cys

225 230 235 240

Ser Arg Asp Ala Val Val Asp Gln Lys Tyr Cys Glu Arg His Met Asn

245 250 255

Arg Gly Arg His Arg Ser Arg Lys Arg Val Glu Gly His Asn Gly His

260 265 270

Ala Ala Lys Ala Ala Val Pro Ala Ala Ile Thr Ser Ser Gln Ser Ala

275 280 285

Ser Ala Leu Ser Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asn Leu Ala Val Ala Gln

290 295 300

Gln Gln Ser Lys Asn Ile Gln Pro Ser Phe Thr Glu Pro Ser Ser Leu

305 310 315 320

Gln Leu Asp Arg Leu Leu Met Asn Arg Asp Asn Thr Asn Val Gln Arg

325 330 335

Gln Asp Ala Lys Gly Leu Ser Val Leu Thr Asp Val Asn Ser Lys Ser

340 345 350

Thr Gly Thr Leu Leu Pro Met Ser Lys Gln Leu Asn Pro Phe Glu Glu

355 360 365

Thr Ser Thr Arg Val Asp Leu Gly Leu Val Ser Thr Asp Ser Val Leu

370 375 380

Asn Asn Glu Gly Asn Cys Ser Ser Glu Asn Leu Ser Phe Val Phe Tyr

385 390 395 400

His Ser Glu Met Asn Asp Gln His Thr Arg Ser His Pro Phe Pro Phe

405 410 415

Arg His Phe Ile Asp Asp Trp Ser Lys Thr Pro Ser Asp Gly Met Glu

420 425 430

Lys Lys Gln Ser Asn Arg Thr Glu Leu Ser Ile Ser Ile Pro Ile Ser

435 440 445

Ser Ser Ala Asn Gln Asp Lys Leu Ser Phe Ser Pro Leu Arg Leu Ser

450 455 460

Cys Glu Phe Asn Pro Thr Asn Asp Gly Thr Gln Arg Gly Leu Ser Trp

465 470 475 480

Ile Pro Ile Ser Trp Glu Pro Asn Ile Gly Gly Pro Leu Gly Glu Val

485 490 495

Leu Thr Asn Thr Ser Ser Thr Thr Pro Lys Asp Leu Ser Ser Asn Leu

500 505 510

Ser Ala Ser Ser Leu Asn Leu Met Thr Asp Gly Trp Asn Ser Lys Ala

515 520 525

Arg Phe Glu Ser Ser Pro Thr Gly Val Leu Gln Glu Ser Gly Phe Gly

530 535 540

Ser Leu Ser Ser Ser Ala Gly Ser Ser Pro Arg Ala Glu Asn His Lys

545 550 555 560

Ala His Glu Ser Asp Asp Leu Leu Gly Ser Thr Phe Val Asn Leu Ser

565 570 575

Thr Asn Pro Ser Leu

580

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

atggacttgg gttgttccct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

ttagagcgag gggttcgttg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 5

tccgaaccca gcaagcaaag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 6

tgagagccgg atccaaggag 20

<210> 7

<211> 1749

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 7

atggacttgg gttgttccct gagcacggat ggcttggtcc ctgtctcgtc tgaccccaat 60

gttctcatcc cctccttttt tcccttggac tccgaaccca gcaagcaaag ggggctgttt 120

caatccagtt tctccaagca tggaagatct gtcgtggttg aggaggatga tgagtactgg 180

actcgtttga agacggctag aggggatcca atgctcacat caacaagcaa ggcggcaact 240

tgcctccttg gatccggctc tcactccctc ttccctgatg gagagcaaat gctgaacttt 300

tcttcatgga aatcagatgc tctggtgctc aataatcatt ggaactcacc ttccttcaac 360

catccttcat catcttcagc ttaccctact ttcaggaatg caggagcgtg ctctggcaat 420

ccaaccctta acattcaagg agctgtgtct gagatcagtg gacccttcac cacttctcag 480

tggtcagaac tggagcaaca gactctgatc tacaaatata ttgatgcaaa agttccatta 540

ccatctaatt tgctcttgtc aatcagacga agcatcaacc cttctgggtt gtcttccttc 600

attgctggaa cttatagacc agcaggcaca ttgggatggg gaaatttcca tctgggtttg 660

gctggaagtg ctgatccgga gcctggcaga tgccgtcgaa cagatgggaa aaaatggcgg 720

tgttcgaggg atgcagttgt ggatcagaag tactgcgagc gacacatgaa ccgtggtcgc 780

catcgttcaa gaaagcgtgt ggaaggccac aatggccatg ctgccaaggc tgctgtgcct 840

gctgccatta cttcgtcgca atcggcatcg gctctttcca gtggtggttc ttctaataat 900

ctcgccgtgg ctcagcagca gagcaaaaac atacaaccaa gcttcacgga accttcatct 960

ctgcaattgg ataggttact gatgaacaga gacaatacaa atgtacaaag acaagatgcc 1020

aaaggcctct ccgtgctgac tgatgtaaac tcaaaatcca caggtacctt gttgcccatg 1080

tccaaacaac taaatccctt tgaagaaact tcaacccgtg tagacttggg acttgtatca 1140

actgattctg tacttaataa tgaagggaac tgctcctcag agaatctcag ttttgttttt 1200

tatcactctg aaatgaatga tcagcacact cgatcccatc cctttccctt ccgacatttt 1260

attgatgact ggtccaaaac accatctgat gggatggaaa agaagcaatc aaacagaact 1320

gaactctcca tttcaatccc catctcctcc tccgccaacc aagacaagct gtcattttcc 1380

cctctcaggc tatcttgtga gttcaatcct acgaatgatg gcacccaaag gggtttaagt 1440

tggataccca tttcgtggga gccaaacatt ggcggacctc ttggggaggt tttgaccaac 1500

acgagcagta ctaccccaaa ggatcttagt agcaatttat cagcttcatc tctgaacctc 1560

atgactgatg ggtggaactc caaggctaga tttgaatcat cgcccacagg agtgttgcag 1620

gagtctggct ttggttcgtt gtccagcagt gcaggaagca gcccccgggc agagaaccat 1680

aaggctcacg aaagtgatga cctacttggc tcaacctttg tgaatttatc aacgaacccc 1740

tcgctctaa 1749

<210> 8

<211> 1779

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 8

atggatttag gttgttctct gagctctgat ggcttggtct ctgtctattc tgaccccaat 60

attcgtatgc cctcctcttt gtttcccttg gaatctgaac ccagcaagca aaggggactg 120

ttccaatcca gtttctccaa gcatggaagg tccattgtgg ttgaggacaa tgatgaatac 180

tggagtcgtt tgaagacggc tagatgtgat acaatgctca cagcaacaag caaggcggca 240

gcttgcctcc ttagatccgg ctctcatacc cttttccctg atggagagca aatgctgaac 300

ttttcttcat ggaaaccaga agctttggtg ctcaataatc attggaactt acctttcttc 360

aaccatccat catcatcttc atgctcttca gcttacccta ccttcaggaa cgcaggagtg 420

tgctctgaca actcaaccct taacatgcat ggagctgtgt ctgggatcag aggacccttc 480

accacttcgc agtggttaga actggagcac caggctctga tctacaagta tatagatgca 540

aaaatgtcaa taccatcaaa tttgctcatg acaatcagac gaagcaacaa ccaatctggg 600

ttctcatcct tcactgctgg atcttttaga caaacaggca cattgggatg gggaaatttc 660

catccaggtt tctctggagg tgctgaccca gagcctggca gatgccgtcg aaccgatgga 720

aaaaagtggc ggtgttcgag ggatgcagtt gttgatcaga agtactgcga gcgacacatg 780

aaccgcggtc gccatcgttc aagaaagcgt gtggaaggcc accttggcca tgctgcaaag 840

gcagctgtgc ctgccatcac ttcttcacaa tccgcatcag ctgtttccag tggtggttct 900

tctaacaacc ttaccactgc tcagcagcag agcgaaaact tacaatcaag tgggacagaa 960

ccttcatccc tgcaattgga taggttgcta ataaacaaag acaatacagg cgaccaaaga 1020

cgaaattccc aaggtctctc catgatgact gatttaatat ccaaatccac aggtaccttg 1080

ttacctattt ccaagcaaca aaatcccttt gaagaaacat cgacccgtgt agacttggga 1140

ctgatatcta ctgattccct acctaacagt caaggaaact gctcctcaga gaaccttagt 1200

tttgttttct ataaccctga aatgaatgat caacatatta gatcccatcc ctttcgacat 1260

tttattgatg attggtcgaa aaacccttct gatgctgatg tggccgataa gatgcaatca 1320

tacagaaccg aactctctat ttcgatcccc atctcttctt tgggcttctc atcatcccct 1380

tgctccccca tccaagacaa actgtcattt ccccccttca gattatcttc tgagttggat 1440

cctctgaatg ctggcagcca aagaggttta agttgggtac caatttcttg ggaaccaacc 1500

attggaggac ctcttggcga ggttttgact aacacaagca ccaccccgaa ggacctgggt 1560

agtaatttat cgacttcatc gctgaacttc atgactgatg gttggaacat gaggacaaga 1620

tttgaatcat caccaacagg agtgttgcag gattctggat ttggttcaat gtccagtagt 1680

acaggaagta gtccccgggc agagaaccat aaggcgcacg aaagtgatga cctccttggc 1740

acaacctttg tgaatctatc ggtgaatccc tctctctaa 1779