具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、青蒿中介体AaMED25基因的克隆

提取青蒿RNA，反转为cDNA，然后根据青蒿基因组序列，设计扩增AaMED25上游和下游的引物：

上游引物:5’-atggcggcggataagaaa-3’(SEQ ID NO.1)；下游引物：5’-tcagtttatgaagcttccacctgacat-3’(SEQ ID NO.2)；

然后以反转的cDNA为模板，以AaMED25上、下游引物进行PCR扩增，扩增条件为94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸150秒，共32个循环；72℃延伸2分钟，4℃保存，进行PCR扩增，扩增产物经回收后经测序获得AaMED25基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码的氨基酸如SEQ ID NO.4所示。

实施例2、构建青蒿中介体MED25基因(AaMED25)的植物表达载体

A、AaMED25-pHB的构建

根据克隆到的AaMED25基因序列，分析其编码区的酶切位点和pHB载体上的多克隆位点，选择BamHI和XhoI作为载体构建的限制性酶切位点，在AaMED25全长的上游引入BamHI酶切位点，在AaMED25下游引入XhoI酶切位点，所用引物为：

AaMED25-F-BamH1：5’-atggcggcggataagaaacag-3’(SEQ ID NO.5)；

AaMED25-R-XhoI：5’-aggtggaagcttcataaacct-3’(SEQ ID NO.6)；

用该对引物扩增AaMED25，然后将扩增的AaMED25序列和pHB同时用内切酶BamHI和XhoI酶切后进行T4连接。

B、AaMED25-pBin19的构建

选取AaMED25基因组上200bp的特异片段作为干扰片段，设计一对引物，具体引物如下：AaMED25-RI-F：5’-gcttgtgtgttgaaggta-3’(SEQ ID NO.7)；AaMED25-RI-R：5’-cactgtcagttatatgcc-3’(SEQ ID NO.8)。

并在上下游引物5’端分别引入HindIII和XbaI酶切位点，将该片段正向克隆到干扰载体pHANNIBAL上；继续在上下游引物5’端再分别引入KpnI和XhoI酶切位点，将该片段反向克隆到引入了正向片段的干扰载体pHANNIBAL上，SacI和SpeI消化该载体，回收含有正反向AaMED25片段的干扰表达框，通过T4连接酶将该片段连接到经SacI和XbaI消化的植物表达载体pBin19大骨架上，最终形成AaMED25的RNAi载体。

实施例3、转基因青蒿的获得

青蒿苗的准备，具体步骤如下：

(1)取适量青蒿种子于1.5mL的Ep管中，加入1mL体积分数为75％酒精，浸泡1min，然后吸去酒精，用无菌水清洗3-5次；

(2)加入1mL质量分数为10％的次氯酸钠溶液，10μL 0.1％Triton-100溶液，涡旋混匀，消毒10min，用无菌水洗3-5次；

(3)吸取1mL无菌水，将种子一起吸入移液枪中，均匀涂布在1/2MS培养基上，吸掉多余的水，吹干；4℃春化2-3d，放于光照培养室培养。培养条件为：温度：25℃；光周期：16h光/8h暗；光照强度：80-220μmol·m^-2·s-1，湿度60％)培养一周左右，待幼苗长出第一对真叶，将其第一对真叶在叶柄基部剪下用于青蒿的遗传转化。

青蒿的遗传转化：

(1)将构建的过表达载体(pHB-AaMED25)转化农杆菌EHA105；

(2)在抗性板(Rif+Kan)上进行筛选，挑取单克隆菌斑进行PCR检测；

(3)扩大培养：在250mL三角瓶中加入50mL YEP(Rif+Kan)液，加入100μL阳性菌液，28℃，200rpm，过夜培养；

(4)待工程菌的菌液浓度培养至OD 600为0.6左右时，4000rpm，离心5min，收集菌体。菌体沉淀用1/2MS液体培养基重悬至OD 600为0.3-0.5，28℃，200rpm培养30min；

(5)将培养好的菌液侵染青蒿叶片外植体20min，平铺于MS板(MS+NAA 0.1mg/L+6-BA 1.0mg/L)上，25℃，暗培养2d，2d后将其转至分化板(MS+NAA+6-BA+潮霉素)上；每隔10天更换一次筛选培养基，一个月后，大量的丛生芽从分化培养基板上长起；

(6)将丛生芽剪下，依次转到壮苗培养基和生根培养基上，直到形成一颗完整的植株；

(7)将生根的青蒿植株经鉴定为阳性的植株移栽到土中生长。

结果筛选到3株干扰表达转基因青蒿植株和3株过表达转基因青蒿植株。通过荧光定量PCR分别检测干扰表达转基因植株和过表达转基因植株的AaMED25基因表达量。检测使用的引物如下：

AaMED25-qF：5’-atatgatgggtggtgtcggt-3’(SEQ ID NO.9)；

AaMED25-qR：5’-gtgttcgcatacctgggact-3’(SEQ ID NO.10)。

检测结果如图1所述。结果显示，干扰表达转基因植株中AaMED25基因表达量降低，过表达转基因植株中AaMED25基因表达量升高。

实施例4、AaMED25过表达和干扰青蒿植株中青蒿素的含量测定

青蒿素的提取：

(1)采集青蒿地上部分组织，于40℃烘箱中，烘烤至完全干燥，将其研磨成粉末；

(2)60℃恒温水浴锅预热石油醚；

(3)称取0.2g粉末于50mL Ep管中，加入25mL石油醚，80Hz超声40min；

(3)用滤纸过滤，50mL小烧杯收集滤液；再用25mL石油醚清洗滤纸上残渣，同一烧杯再次收集滤液；

(4)将液体转移到100mL的旋转蒸发瓶中，于50℃水浴中减压旋转蒸发，至石油醚挥发完全。

(5)向旋转蒸发瓶中加入1mL色谱级甲醇，超声1min；将重悬液体转移至1.5mL Ep管中，12000rpm，离心10min；上清液用0.22μm的滤膜过滤，滤液用高效液相色谱联合蒸发光散射检测(HPLC-ELSD)测定青蒿素含量，具体方法如下：

HPLC仪器为SPD20A系统控制器，蒸发光散射检测器(Evaporative Light-Scattering Detector，ELSD)。使用Waters C18色谱柱，流动相：乙腈和水，体积比60％∶40％，流速：1mL/min；ELSD检测系统为water alliance 2420，蒸发光散射检测器漂移管温度为40℃，载气压力5bar；标准样品进样20μL，每个样品进样20μL，重复3次进样。青蒿素标准品的出峰时间为9.703min，样品的保留时间为9.673min，根据标准品的浓度和峰面积计算出样品中的青蒿素的含量，再除以青蒿粉末干重，从而计算出青蒿素占样品干重的含量，结果如图2所示。结果显示，在干扰表达转基因植株中青蒿素产量有的升高，有的降低，并且差异不显著。而在过表达转基因植株中，青蒿素产量均提高，且差异显著。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 西南大学

<120> 青蒿中介体AaMED25基因及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcggcgg ataagaaa 18

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcagtttatg aagcttccac ctgacat 27

<210> 3

<211> 2442

<212> DNA

<213> 青蒿(Artemisia annua)

<400> 3

atggcggcgg ataagaaaca gctgattttg tgtgttgaag gtactgctgc tttgggtcct 60

tattggcgga ctattctttc tgattatctt gataaagtta tcaggtcttt ctgtgataac 120

gagactttga aatcacctgg gactattgtt gagctcgctc tcattgtatt caactctcat 180

ggatgttaca gttcttgctt ggtacgacgg agtggctgga ctagaaacgt tgactatttt 240

ttcgagtggc tatcggctat acacttttct ggtggcggtt tttgtgacgc cgcaattgca 300

gagggtcttg gtgaagcttt aatgatgttt cctgtaaatg cggcacaaaa tcaacataat 360

atcggtgttc aaaggcattg catacttgtt gctgcaagta atccatatcc attgccgaca 420

ccagtttacc gaccaccaat acaaaaaacg gagccgactg ataatactga ggcacagtca 480

gaaagcaggc tatcagatgc tgaaaccatc gctaaaacat ttccacagtg tcccgtctca 540

ctgtcagtta tatgcccgaa acagcttcca aaattaaaag caatctataa tgcgggaaaa 600

aggaacccat cagcaggcga acctactatt gatgtggtga aaaatccaca ttatcttgtg 660

ctaatatcgg aaacatttat ggaagctcgt gcggctttaa gtcgatcagg cattacaact 720

ttgccctctc agagtcctat aaaagttgat caaagttcag ttcctccggt atcagggcca 780

cctccaactt cagttccacc agtaaatgga tctatgatga gccgtcaacc agttcctgta 840

ggaagtgttc ctcccacaac tgttaaagtt gaaccaacca cagttccttc aatgccacct 900

gcaccagtac ccgtaccagc gccctcgttt cagcatgttc cgccagttgc tcgtcccacc 960

tcgcaaggaa tcccgacaat gcaaacttct tcaccgttat ctgtttctca aggtatgcta 1020

tcaaataacg atactgtgat gcaagatatg aaaccaaatg tcactggtat gcaacaaccg 1080

gcacgtcctg ctggtcccgt aaacgtcagc atactcaata atctttcaca agcacggttg 1140

atgaacaacg ggacatcgat ggggataccg tcaatcggcg ggaatccgat ggctatgcat 1200

atgtccaaca tgatatctag tggaatggcc tcaactgtac ccgtttctca aaccgtgatt 1260

tcatcgggtc aaccgggtat tgccccaatt tccggaacgg tgcagagtac ggtaccagta 1320

ccaagttcat ttacttcaac cacttcaaac atgactggga gtccgagcca accattgggt 1380

aatcttcaag gaagtgtcgg aatgggtcaa cccgtttcgg gaatcagcca aggaaatctt 1440

ccaggcactg gctcgcaaat ggtgcaaagt ggaatgggaa tgaatcagaa tatgatgggt 1500

ggtgtcggtc agggtcaatc gggtatgacg ggagtgggaa cgggaacggg aaccggttca 1560

ggacctggga tgatgccgac acctggcatt ggtcagcaag tcccaggtat gcgaacactc 1620

ggtgtaaata acaatacggc tgctaatgct ggtcttccgc aacaaacatc gggtggtggt 1680

gcactgcaat cagcacagtc aaaatatgtt aaagtttggg aggggaactt atctgggcag 1740

cgacaaggtc aacctgtgtt tattaccaga ttagaagggt accggagtgc atcagcttct 1800

gaatcgcttg ctgctaattg gccacctaca atgcaaatag ttcggcttat atctcaagat 1860

cacatgaata acaagcaata tgttggaaaa gcagattttc tagtttttcg cgcaatgaat 1920

cagcatggat ttcttggaca attgcaagaa aagaagcttt gtgcagtcat acagttgcca 1980

tcacaaacac ttctactgtc tgtttctgat aaagcatgcc gattgattgg aatgcttttc 2040

cctggggaca tggtggtgtt caaaccacag atatcaggtc aacaacagcc acagcagctt 2100

caacctcaac aacaccccgg tcaaatgcaa ccacaacaac agcaaatgca acacatgcaa 2160

caacagcagc aacagattcc gccgttgcag caacagcaac agcagatgca acagccgtca 2220

caacaaccaa tgcaacaaca gccgatgcaa caacagccta tgcaacaaca gcaacagccg 2280

caacaaccga tgcaacagca acagcagcaa ccacagatgg ttgggacagg gatgaaccaa 2340

ggttatgttc aaggtccagg gggccgaaca caaatggtgc cccaggggca agtttcttcg 2400

cagggcccgc aaagcatgtc aggtggaagc ttcataaact ga 2442

<210> 4

<211> 813

<212> PRT

<213> 青蒿(Artemisia annua)

<400> 4

Met Ala Ala Asp Lys Lys Gln Leu Ile Leu Cys Val Glu Gly Thr Ala

1 5 10 15

Ala Leu Gly Pro Tyr Trp Arg Thr Ile Leu Ser Asp Tyr Leu Asp Lys

20 25 30

Val Ile Arg Ser Phe Cys Asp Asn Glu Thr Leu Lys Ser Pro Gly Thr

35 40 45

Ile Val Glu Leu Ala Leu Ile Val Phe Asn Ser His Gly Cys Tyr Ser

50 55 60

Ser Cys Leu Val Arg Arg Ser Gly Trp Thr Arg Asn Val Asp Tyr Phe

65 70 75 80

Phe Glu Trp Leu Ser Ala Ile His Phe Ser Gly Gly Gly Phe Cys Asp

85 90 95

Ala Ala Ile Ala Glu Gly Leu Gly Glu Ala Leu Met Met Phe Pro Val

100 105 110

Asn Ala Ala Gln Asn Gln His Asn Ile Gly Val Gln Arg His Cys Ile

115 120 125

Leu Val Ala Ala Ser Asn Pro Tyr Pro Leu Pro Thr Pro Val Tyr Arg

130 135 140

Pro Pro Ile Gln Lys Thr Glu Pro Thr Asp Asn Thr Glu Ala Gln Ser

145 150 155 160

Glu Ser Arg Leu Ser Asp Ala Glu Thr Ile Ala Lys Thr Phe Pro Gln

165 170 175

Cys Pro Val Ser Leu Ser Val Ile Cys Pro Lys Gln Leu Pro Lys Leu

180 185 190

Lys Ala Ile Tyr Asn Ala Gly Lys Arg Asn Pro Ser Ala Gly Glu Pro

195 200 205

Thr Ile Asp Val Val Lys Asn Pro His Tyr Leu Val Leu Ile Ser Glu

210 215 220

Thr Phe Met Glu Ala Arg Ala Ala Leu Ser Arg Ser Gly Ile Thr Thr

225 230 235 240

Leu Pro Ser Gln Ser Pro Ile Lys Val Asp Gln Ser Ser Val Pro Pro

245 250 255

Val Ser Gly Pro Pro Pro Thr Ser Val Pro Pro Val Asn Gly Ser Met

260 265 270

Met Ser Arg Gln Pro Val Pro Val Gly Ser Val Pro Pro Thr Thr Val

275 280 285

Lys Val Glu Pro Thr Thr Val Pro Ser Met Pro Pro Ala Pro Val Pro

290 295 300

Val Pro Ala Pro Ser Phe Gln His Val Pro Pro Val Ala Arg Pro Thr

305 310 315 320

Ser Gln Gly Ile Pro Thr Met Gln Thr Ser Ser Pro Leu Ser Val Ser

325 330 335

Gln Gly Met Leu Ser Asn Asn Asp Thr Val Met Gln Asp Met Lys Pro

340 345 350

Asn Val Thr Gly Met Gln Gln Pro Ala Arg Pro Ala Gly Pro Val Asn

355 360 365

Val Ser Ile Leu Asn Asn Leu Ser Gln Ala Arg Leu Met Asn Asn Gly

370 375 380

Thr Ser Met Gly Ile Pro Ser Ile Gly Gly Asn Pro Met Ala Met His

385 390 395 400

Met Ser Asn Met Ile Ser Ser Gly Met Ala Ser Thr Val Pro Val Ser

405 410 415

Gln Thr Val Ile Ser Ser Gly Gln Pro Gly Ile Ala Pro Ile Ser Gly

420 425 430

Thr Val Gln Ser Thr Val Pro Val Pro Ser Ser Phe Thr Ser Thr Thr

435 440 445

Ser Asn Met Thr Gly Ser Pro Ser Gln Pro Leu Gly Asn Leu Gln Gly

450 455 460

Ser Val Gly Met Gly Gln Pro Val Ser Gly Ile Ser Gln Gly Asn Leu

465 470 475 480

Pro Gly Thr Gly Ser Gln Met Val Gln Ser Gly Met Gly Met Asn Gln

485 490 495

Asn Met Met Gly Gly Val Gly Gln Gly Gln Ser Gly Met Thr Gly Val

500 505 510

Gly Thr Gly Thr Gly Thr Gly Ser Gly Pro Gly Met Met Pro Thr Pro

515 520 525

Gly Ile Gly Gln Gln Val Pro Gly Met Arg Thr Leu Gly Val Asn Asn

530 535 540

Asn Thr Ala Ala Asn Ala Gly Leu Pro Gln Gln Thr Ser Gly Gly Gly

545 550 555 560

Ala Leu Gln Ser Ala Gln Ser Lys Tyr Val Lys Val Trp Glu Gly Asn

565 570 575

Leu Ser Gly Gln Arg Gln Gly Gln Pro Val Phe Ile Thr Arg Leu Glu

580 585 590

Gly Tyr Arg Ser Ala Ser Ala Ser Glu Ser Leu Ala Ala Asn Trp Pro

595 600 605

Pro Thr Met Gln Ile Val Arg Leu Ile Ser Gln Asp His Met Asn Asn

610 615 620

Lys Gln Tyr Val Gly Lys Ala Asp Phe Leu Val Phe Arg Ala Met Asn

625 630 635 640

Gln His Gly Phe Leu Gly Gln Leu Gln Glu Lys Lys Leu Cys Ala Val

645 650 655

Ile Gln Leu Pro Ser Gln Thr Leu Leu Leu Ser Val Ser Asp Lys Ala

660 665 670

Cys Arg Leu Ile Gly Met Leu Phe Pro Gly Asp Met Val Val Phe Lys

675 680 685

Pro Gln Ile Ser Gly Gln Gln Gln Pro Gln Gln Leu Gln Pro Gln Gln

690 695 700

His Pro Gly Gln Met Gln Pro Gln Gln Gln Gln Met Gln His Met Gln

705 710 715 720

Gln Gln Gln Gln Gln Ile Pro Pro Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Met

725 730 735

Gln Gln Pro Ser Gln Gln Pro Met Gln Gln Gln Pro Met Gln Gln Gln

740 745 750

Pro Met Gln Gln Gln Gln Gln Pro Gln Gln Pro Met Gln Gln Gln Gln

755 760 765

Gln Gln Pro Gln Met Val Gly Thr Gly Met Asn Gln Gly Tyr Val Gln

770 775 780

Gly Pro Gly Gly Arg Thr Gln Met Val Pro Gln Gly Gln Val Ser Ser

785 790 795 800

Gln Gly Pro Gln Ser Met Ser Gly Gly Ser Phe Ile Asn

805 810

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggcggcgg ataagaaaca g 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aggtggaagc ttcataaacc t 21

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcttgtgtgt tgaaggta 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cactgtcagt tatatgcc 18

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atatgatggg tggtgtcggt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtgttcgcat acctgggact 20