一种促进种子萌发的寒兰基因表达载体、构建方法及应用
阅读说明：本技术 一种促进种子萌发的寒兰基因表达载体、构建方法及应用 (Cymbidium kanran gene expression vector for promoting seed germination, construction method and application ) 是由 罗火林 杨柏云 熊冬金 于 2021-09-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种促进寒兰种子萌发的基因表达载体、构建方法及应用,所述的基因表达载体由寒兰种子萌发基因CkARF与植物表达载体构成,所述植物表达载体是将含有CkARF片段的T-载体和表达载体pCAMBIA 1301-220质粒,经BamHⅠ和XbaⅠ双酶切后,将CkARF插入到线性化的pCAMBIA 1301-220质粒而得到的。本发明中所构建的含有寒兰种子萌发基因CkARF的植物表达载体pCAMBIA 1301-220-CkARF,可直接通过农杆菌介导的遗传转化,将所构建的基因表达载体导入花卉中,使CkARF基因在CaMV35S启动子的启动下超量表达,大量合成ARF蛋白,调控下游基因的表达,使寒兰种子提前萌发,并提高其萌发质量。(The invention discloses a gene expression vector for promoting germination of cymbidium kanran seeds, a construction method and application thereof, wherein the gene expression vector is composed of cymbidium kanran seed germination gene CkARF and a plant expression vector, and the plant expression vector is obtained by inserting CkARF into linearized pCAMBIA 1301-220 plasmid after double enzyme digestion of a T-vector containing CkARF fragment and an expression vector pCAMBIA 1301-220 plasmid through BamHI and XbaI. The plant expression vector pCAMBIA 1301-220-CkARF containing the cymbidium kanran seed germination gene CkARF constructed in the invention can directly introduce the constructed gene expression vector into flowers through agrobacterium-mediated genetic transformation, so that the CkARF gene is excessively expressed under the starting of a CaMV35S promoter, a large amount of ARF protein is synthesized, the expression of downstream genes is regulated, the cymbidium kanran seed is germinated in advance, and the germination quality is improved.)
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种促进种子萌发的寒兰基因表达载体、构建方法及应用。
背景技术
ARF(auxin response factor,ARF)是1997年在拟南芥中发现的一类调控生长素响应基因表达的转录因子。目前对于模式植物拟南芥的ARF转录因子研究较为深入，被认为广泛参与生长素信号转导。胚胎形成早期，该基因不但能够促进生长素运输到相邻胚柄细胞，还包括根尖分生组织的静止中心前体。该基因突变后，胚胎不能形成胚轴和胚根。
寒兰(cymbidium kanran makino)隶属于兰科(Orchidaceae)兰属(Cymbidium)，是国兰家族的重要成员，具有唇瓣形态变异多样，四季开花和花期长等优点，被誉为“兰中之王”。同其他兰科植物一样，其种子萌发存在显著的障碍。兰花种子萌发有共生萌发和非共生萌发(无菌播种)两种。非共生萌发是指在人工培养基上不需要任何真菌侵染就可以使兰花种子萌发，它能够在短期内获得大量幼小植株，是现阶段经济有效的快速繁殖方法之一，在蝴蝶兰、铁皮石斛、国兰、大花蕙兰等经济价值较高的兰科植物都获得了较大的商业价值。因此，兰花种子的非共生萌发在兰花工业生产中显得尤为重要。通过克隆控制寒兰种子萌发的关键基因，构建表达载体，使其超表达于寒兰，有可能培育易萌发的品种。
参考文献
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发明内容
本发明的目的是提供一种促进种子萌发的寒兰基因表达载体、构建方法及应用，以克服寒兰种子的萌发障碍问题，构建的植物表达载体利用农杆菌介导的遗传转化导入到寒兰花卉中，以改良其植物种子的萌发特性。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种促进寒兰种子萌发的基因，该促进寒兰种子萌发的基因为CkARF，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。
根据上述的寒兰种子萌发基因CkARF，本发明提供了一种促进寒兰种子萌发的基因表达载体，该基因表达载体由上述的寒兰种子萌发基因CkARF与植物表达载体构成。
本发明中所述的植物表达载体是：将含有CkARF片段的T-载体和表达载体pCAMBIA1301-220质粒，经BamHⅠ和XbaⅠ双酶切后，将CkARF插入到线性化的pCAMBIA 1301-220质粒而得到的。
本发明还提供了一种促进寒兰种子萌发的基因表达载体构建方法，该基因表达载体的构建过程包括以下步骤：
1)寒兰种子萌发基因CkARF的克隆
以寒兰种子为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，设计引物并用高保真酶扩增CkARF基因；以反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式PCR反应，产物连接到pMD19-T Simple载体，转化TOP10感受态细胞，进行序列测定；
2)植物表达载体pCAMBIA 1301-220-CkARF的构建
从TOP10菌株中提取pMD19-T Simple-CkARF重组质粒，经BamHⅠ和XbaⅠ双酶切后回收CkARF片段，再将其插入到线性化的pCAMBIA 1301-220质粒，得到的重组质粒pCAMBIA1301-220-CkARF转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒，酶切电泳检测并测序验证。
本发明中所述的设计引物并用高保真酶扩增CkARF基因，引物的设计方法为：利用Primer Premier 5软件分析设计引物，设计的引物序列为：
上游引物CkARF-F:5′-ggatccATGAGGTTTAGGATGAAGTTTGA-3′
下游引物CkARF-R:5′-tctagaTCATCTGCTCTCCTGAATCTTAG-3′。
本发明还提供了一种促进寒兰种子萌发的基因表达载体的应用：所述的基因表达载体可直接用于农杆菌介导的遗传转化，将所构建的基因表达载体导入花卉中，以改良其植物种子的萌发特性。
有益效果：
1.本发明提供的寒兰CkARF是一个新的寒兰生长素转运基因，该基因可调控植物种子非共生萌发；
2.本发明构建的寒兰CkARF基因植物表达载体为首次报道，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，改良植物种子的萌发特性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一种促进寒兰种子萌发的基因表达载体的连接过程示意图；
图2为高保真酶扩增CkARF产物电泳图；
图3为pMD19-T Simple-CkARF质粒BamH I和Xba I双酶切产物电泳图；
图4为pCAMBIA 1301-220-CkARF表达载体BamH I和Xba I双酶切产物电泳图；
图5为植物表达载体pCAMBIA 1301-220-CkARF图谱；
图6为野生型与转基因拟南芥的萌发率对比示意图；
图7为野生型与转基因拟南芥的萌发质量对比示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面参照图1-7描述本发明一些实施例的技术方案。
实施例1
本实施例提供了一种促进寒兰种子萌发的基因，该促进寒兰种子萌发的基因为CkARF，其基因序列如下SEQ ID NO.1所示。
实施例2
根据实施例1中的寒兰种子萌发基因CkARF，本实施例中提供了一种促进寒兰种子萌发的基因表达载体，该基因表达载体由上述的寒兰种子萌发基因CkARF与植物表达载体构成。
如图5所示，本发明中所述的植物表达载体是：将含有CkARF片段的T-载体和表达载体pCAMBIA 1301-220质粒，经BamHⅠ和XbaⅠ双酶切后，将CkARF插入到线性化的pCAMBIA1301-220质粒而得到的。
实施例3
本实施例中提供了一种促进寒兰种子萌发的基因表达载体构建方法，该基因表达载体的构建过程包括以下步骤：
1)寒兰种子萌发基因CkARF的克隆
选用寒兰栽培种“青花梅”作为材料，提取种子总RNA，按照M-MLV反转录试剂盒(TaKaRa)取1μg总RNA反转录成cDNA，用RNase消化cDNA产物，参照寒兰CkARF序列信息(NCBI登录号：AB495345)，经Primer Premier 5软件分析设计引物扩增CkARF；
上游引物CkARF-F:5′-ggatccATGAGGTTTAGGATGAAGTTTGA-3′；
下游引物CkARF-R:5′-tctagaTCATCTGCTCTCCTGAATCTTAG-3′；
以花蕾cDNA为模板，进行PCR反应：
50μL反应体系：10×RCR Buffer 5.0μL，CkARF-F、CkARF-R引物各1.0μL(20μmol·L-1)，dNTP mix 4.0μL(2.5mmol·L-1)，PrimeSTARTM HS DNA Polymerase 0.2μL，cDNA模板1μL，ddH2O 37.8μL；
反应程序：95℃预变性4min，然后94℃解链30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min30sec，反应33个循环，72℃延伸10min；PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收纯化，用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接到pMD19-T Simple载体(TaKaRa)，转化TOP10感受态细胞，进行序列测定，检测结果如图2所示；
2)植物表达载体pCAMBIA 1301-220-CkARF的构建
提取含有目的片段的T-载体及表达载体pCAMBIA 1301-220质粒DNA并双酶切，酶切体系为：10×buffer K 2.5μl，Xba I 2.0μl，BamH I 2.0μl，质粒DNA 10μl，ddH2O up to50μl，37℃过夜充分酶切。将含有CkARF完整开放阅读框的片段和pCAMBIA 1301-220线性化质粒片段分别回收，并将两个片段连接，连接过程如图1所示。
连接反应体系为：T4 Buffer 2.0μl，T4连接酶1.0μl，载体回收液1.0μl，目的基因回收液4.0μl，dd H2O up to 20μl，4℃过夜连接。将连接好的重组质粒pCAMBIA 1301-220-CkARF转化TOP10细胞，提取阳性质粒，酶切电泳检测并测序验证，pMD19-T Simple-CkARF质粒和pCAMBIA 1301-220-CkARF表达载体的双酶切电泳检测结果分别如图3、图4所示。
实施例4
本实施例中提供了一种促进寒兰种子萌发的基因表达载体的应用：所述的基因表达载体可直接用于农杆菌介导的遗传转化，将所构建的基因表达载体导入寒兰中，以改良其植物种子的萌发特性，其效果通过以下对比试验进行展现：
植物表达载体pCAMBIA 1301-220-CkARF转化拟南芥及花发育特性观察
①农杆菌菌株EHA105感受态制备及冻融法转化
从YEB(50ug/mL利福平)平板上挑取EHA105单菌落，接种于50mL含50ug/mL利福平的YEB液体培养基中，200rpm，28℃培养至OD值0.5，而后冰浴菌液30min，离心收集菌体，悬浮于2mL预冷的的100mM CaCl2(20％甘油)溶液中，200uL/管分装，待用。
取10uL pCAMBIA 1301-220-CkARF载体质粒，加入200uL感受态细胞，冰浴30min，液氮冷冻5min，37℃5min，加入800uL YEB液体培养基，28℃200rpm预培养4h，菌液涂板于YEB(50ug/mL利福平+50ug/mL卡那霉素)固体培养基上，28℃暗培养2天，挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，用于拟南芥花序转化。
②拟南芥花序浸染及种子筛选
将阳性单克隆接到50mL的YEB(50ug/mL利福平+50ug/mL卡那霉素)液体培养基中，培养24小时，5000rpm离心20分钟，然后用转化液(1/2MS，添加50克/升的蔗糖，调pH为5.8，然后加200uL/L的Silwet L-77混合)剧烈悬浮沉淀至完全悬起。将拟南芥地上部分直接浸泡于上述悬浮液中1分钟，然后用保鲜膜完全包裹植株以保湿，放回培养室培养12小时，打开保鲜膜，待种子成熟时采收。
种子消毒与播种：将野生型和转基因拟南芥种子分别放入1.5mL的离心管中，加入1mL 75％酒精，添加0.1％的Triton X-100摇晃15分钟，然后在超净台中用95％的酒精洗两次，而后直接把种子连同酒精倒在灭菌过的滤纸上，以吹干种子(放置30分钟)，轻轻敲击滤纸将干种子均匀撒播到筛选培养基上(1/2MS+20mg/L草胺磷+25mg/L氨苄青霉素)筛选培养10天，然后将抗性苗移栽到土中，用透明的盖子覆盖幼苗1周以保湿，记录野生型和转基因拟南芥开花时间，种子萌发的形状，将野生型和转基因拟南芥种子的萌发率和萌发质量(萌发的形状)进行比对，其结果如图6、图7所示。
根据对比结果可得知，本发明所构建的基因表达载体可直接用于农杆菌介导的遗传转化，将所构建的基因表达载体导入花卉中，可以有效改良其植物种子的萌发率和萌发质量。
综上所述，本发明构建的含有寒兰种子萌发基因CkARF的植物表达载体pCAMBIA1301-220-CkARF，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，能够有效解决花卉种子萌发障碍的问题，改善其种子的萌发特性。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。