一种水稻胚乳粉质相关基因OsPDC-E1-α1及其编码蛋白质和应用
阅读说明：本技术 一种水稻胚乳粉质相关基因OsPDC-E1-α1及其编码蛋白质和应用 (Rice endosperm flour-associated gene OsPDC-E1-alpha 1 and encoding protein and application thereof ) 是由 万建民 王益华 雷洁 田云录 滕烜 刘喜 刘世家 江玲 张文伟 于 2021-10-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种水稻胚乳粉质相关基因OsPDC-E1-α1及其编码蛋白质和应用。本发明提供的基因OsPDC-E1-α1,为如下1)或2)或3)或4)所述的DNA分子：1)SEQ ID NO.1所示的DNA分子；2)SEQ ID NO.2所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性,且编码植物造粉体发育相关蛋白的DNA分子。本发明还提供所述基因编码的蛋白质,将所述蛋白的编码基因导入造粉体发育异常的植物中,可以培育造粉体发育正常的转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。(The invention discloses a rice endosperm aleurone related gene OsPDC-E1-alpha 1 and a coding protein and application thereof. The gene OsPDC-E1-alpha 1 provided by the invention is a DNA molecule as shown in 1) or 2) or 3) or 4): 1) DNA molecule shown in SEQ ID NO. 1; 2) DNA molecule shown in SEQ ID NO. 2; 3) a DNA molecule which hybridizes with the DNA sequence defined in 1) or 2) under stringent conditions and encodes said protein; 4) DNA molecule which has more than 90% of homology with the DNA sequence limited by 1) or 2) or 3) and codes the plant amyloplast development related protein. The invention also provides a protein coded by the gene, and the coded gene of the protein is introduced into a plant with amyloplast dysplasia, so that a transgenic plant with amyloplast dysplasia can be cultivated. The protein and the coding gene thereof can be applied to plant genetic improvement.)
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种水稻胚乳粉质相关基因OsPDC-E1-α1及其编码蛋白质和应用。
背景技术
水稻是重要的粮食作物，也是植物研究的模式植物之一。水稻种子在成熟过程中积累大量的淀粉，为种子萌发和幼苗生长发育提供主要的能量，同时这些数量可观的淀粉也成为人类重要的食物来源。水稻种子中，淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成，其合成和积累不仅影响了种子的大小，还决定这稻米的品质。造粉体是造粉体发育和储藏的主要场所，维持其结构的完整性对于正常的造粉体发育和贮存是极为重要的。在种子发育的过程中，淀粉以淀粉粒的形式在造粉体中合成和存储，随着造粉体中淀粉的不断合成，淀粉粒逐渐增大最终几乎占据造粉体所有内部空间。因此，造粉体的发育对淀粉的积累至关重要，研究造粉体的发育对提高产量和改良稻米品质有重要意义。
高等植物中，淀粉是植物储存的主要碳水化合物，大量存在于块茎、块根、种子中，叶片、花器官中也有存在，它不仅是人类主要的能量来源，而且是重要的工业原料。淀粉的合成是一个复杂且精密的过程，需要许多酶类和调控因子的参与，一直以来都是研究的重点，但是关于调控造粉体发育的分子机理，特别是造粉体膜结构，目前研究得还不够清楚。因此，新的调控因子的挖掘对研究水稻造粉体发育和未来稻米品质改良工作具有重要意义。
水稻胚乳造粉体发育异常突变体包括胚乳粉质、皱缩、垩白等突变体，这些突变体中的淀粉粒形态和大小几乎都不同程度地受到了影响。在水稻中，筛选胚乳发育异常的突变体是挖掘新的造粉体发育关键因子的重要方法。随着分子生物学和分子遗传学方法与技术的快速发展，已经有一些调节水稻造粉体发育的基因被精细定位和克隆，但是其调控机制还不清楚，这就需要我们定位和克隆更多的相关基因来进一步揭示水稻造粉体发育的机制。
发明内容
本发明的目的在于公开一种水稻胚乳粉质相关基因OsPDC-E1-α1及其编码蛋白质和应用。
本发明提供的基因OsPDC-E1-α1，为如下1)或2)或3)或4)所述的DNA分子：
1)SEQ ID NO.1所示的DNA分子；
2)SEQ ID NO.2所示的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码植物造粉体发育相关蛋白的DNA分子。
序列表中的SEQ ID NO.1，由3829个核苷酸组成。
本发明还提供了一种上述基因OsPDC-E1-α1编码的蛋白质。
具体的，本发明提供的蛋白质，选自如(a)或(b)所示的任一种：
(a)由SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将SEQ ID NO.3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与造粉体发育相关的由SEQ ID NO.3衍生的蛋白质。
序列表中的SEQ ID NO.3，由425个氨基酸组成。
本发明还提供了含有所述基因OsPDC-E1-α1的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。
所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。
使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
所述重组过表达载体可为在限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切载体pCAMBIA1390的重组位点插入所述基因(OsPDC-E1-α1)得到的重组质粒。将含有OsPDC-E1-α1的pCAMBIA1390命名为pCAMBIA1390-OsPDC-E1-α1。
含有以上任一所述基因(OsPDC-E1-α1)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。
扩增所述基因(OsPDC-E1-α1)全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围，所述的引物对优选Primer1/Primer2、Primer3/Primer4。
在精细定位此基因过程中涉及到的定位引物(见表1)，InDel引物为本实验需要而自行设计的引物，这些自行设计的引物也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了所述基因，所述蛋白质，所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在植物育种中的应用。
本发明还提供了所述基因，所述蛋白质，所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在培育造粉体发育正常的转基因植物中的应用。
本发明还提供了一种培育造粉体发育正常的转基因植物的方法，是将所述基因导入造粉体发育异常植物中，得到造粉体发育正常的转基因植物。
具体的，可以将所述基因通过所述重组表达载体导入造粉体发育异常的植物中。
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。
有益效果：
本发明首次发现、定位并克隆得到一个新的植物胚乳粉质相关蛋白的基因OsPDC-E1-α1。本发明的植物胚乳粉质相关蛋白影响植物的造粉体的发育过程。抑制该蛋白编码基因的表达可导致植物种子中造粉体发育异常，从而可以培育胚乳变异的转基因植物和植物造粉体异常的转基因植物。将所述蛋白的编码基因导入造粉体发育异常的植物中，可以培育造粉体发育正常的植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。
附图说明
图1为野生型DJY与突变体flo19的籽粒外型。
图2为野生型DJY与突变体flo19的千粒重测定。
图3为野生型DJY与突变体flo19籽粒扫描电镜观察。
图4为野生型DJY与突变体flo19籽粒半薄切片观察。
图5为突变基因在第4染色体上的精细定位。
图6为转pCAMBIA1390-OsPDC-E1-α1的T0代植株的T1籽粒表型。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1、水稻造粉体发育相关位点及其编码基因的发现
一、水稻胚乳粉质突变体flo19的淀粉含量分布分析及遗传分析
在利用EMS化学诱变产生的DJY突变体中，筛选出一个胚乳粉质突变体，命名为flo19。
与DJY比较，flo19的主要特征是：种子具有粉质不透明的表型(见图1)，且种子的千粒重明显下降(见图2)。图1显示DJY具有透明的胚乳，flo19的胚乳具有中心不透明、四周透明的表型。这说明基因突变影响了造粉体的发育，导致淀粉粒的结构和性质发生了变化，使胚乳在表观上表现出差异。
对野生型和突变体flo19种子的横截面进行了扫描电镜观察(见图3)，野生型种子的横截面的淀粉片层结构比较规则整齐，而突变体比较松散。对发育早期的胚乳进行了半薄切片观察(见图4)，发现野生型DJY的造粉体发育为大小均匀，每个造粉体内含几到十几个淀粉颗粒，可以清晰的看出造粉体的龟甲结构。在突变体flo19中，可以看到发育异常的造粉体，造粉体内淀粉颗粒排列松散，同时单粒的淀粉颗粒增多。由此可以推断，这些异常发育的造粉体可能导致突变体中胚乳呈现粉质的表型。
二、突变基因位点的图位克隆
1、突变基因的定位
首先，配制了突变体flo19和另一野生型IR36的杂交组合F1，自交一代后获得了F2种子。将F2种子去壳，以表型不透明为标准筛选10株极端个体进行连锁，将目的基因确定在水稻第4染色体上。
挑选与突变体表型一致的F2种子发苗，获得2000株隐性极端个体的叶片，利用公用引物与自己设计的引物，最终将目的基因确定在标记P4和P5之间，区段大小80.5kb(图5)。
上述SSR标记分析的方法如下所述：
(1)提取上述选取单株的总DNA作为模板，具体方法如下：
①取0.2克左右的水稻幼嫩叶片，置于2.0mL Eppendorf管中，管中放置一粒钢珠，把装好样品的Eppendorf管在液氮中冷冻5min，置于2000型GENO/GRINDER仪器上粉碎样品1min。
②加入660μL提取液(含100mM Tris-HCl(pH 8.0)，20mM EDTA(pH 8.0)，1.4MNaCl,0.2g/mL CTAB的溶液)，漩涡器上剧烈涡旋混匀，冰浴30min。
③加入40μL 20％SDS，65℃温浴10min，每隔两分钟轻轻上下颠倒混匀。
④加入100μL 5M NaCl，温和混匀。
⑤加入100μL 10×CTAB，65℃温浴10min，间断轻轻上下颠倒混匀。
⑥加入900μL氯仿，充分混匀，12000rpm离心3min。
⑦转移上清液至1.5mL Eppendorf管中，加入600μL异丙醇，混匀，12000rpm离心5min。
⑧弃上清液，沉淀用70％(体积百分含量)乙醇漂洗一次，室温凉干。
⑨加入100μL 1×TE(121g Tris溶于1升水中，用盐酸调pH值至8.0得到的溶液)溶解DNA。
⑩取2μL电泳检测DNA质量，并用DU800分光光度仪测定浓度(Beckman InstrumentInc.U.S.A)。
(2)将上述提取的DNA稀释成约20ng/μL，作为模板进行PCR扩增；
PCR反应体系(10μL)：DNA(20ng/μL)1μL，上游引物(2pmol/μL)1μL，下游引物(2pmol/μL)1μL，10×Buffer(MgCl2 free)1μL，dNTP(10mM)0.2μL，MgCl2(25mM)0.6μL，rTaq(5U/μL)0.1μL，ddH2O 5.1μL，共10μL。
PCR反应程序：94.0℃变性5min；94.0℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共循环35次；72℃延伸7min；10℃保存。PCR反应在MJ Research PTC-225热循环仪中进行。
(3)SSR标记的PCR产物检测
扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。以50bp的DNA Ladder为对照比较扩增产物的分子量大小，银染显色。
上述引物开发过程如下：
(1)SSR标记开发
将公共图谱的SSR标记与水稻基因组序列进行整合，下载突变位点附近的BAC/PAC克隆序列。用SSRHunter(李强等，遗传，2005，27(5):808-810)或SSRIT在线软件(http://archive.gramene.org/db/markers/ssrtool)搜索克隆中潜在的SSR序列(重复次数≥6)；将这些SSR及其邻近400～500bp的序列在NCBI通过BLAST程序在线与相应的籼稻序列进行比较，如果两者的SSR重复次数有差异，初步推断该SSR引物的PCR产物在籼、粳间存在多态性；再利用Primer Premier 5.0软件设计SSR引物，并由上海英骏生物技术有限公司合成。将自行设计的SSR成对引物等比例混合，检测其在DJY和IR36之间的多态性，表现多态者用作精细定位的分子标记。用于精细定位的分子标记见表1。
表1用于精细定位的分子标记
2、粉质基因的获得
经过对80.5kb区间内的测序，发现了OsPDC-E1-α1基因存在一个单碱基的突变，
根据网上公布的序列设计引物，序列如下所述：
Primer1：5'ATGGTTCTTGGCCGTATTTTCGAGG 3'(SEQ ID NO.4)；
Primer2：5'TCAGACTTGGGCCGTGCCTTGCGTG 3'(SEQ ID NO.5)。
以Primer1和Primer2为引物，以DJY的发育中胚乳cDNA为模板，进行PCR扩增获得目的基因。扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，55℃1min，72℃10min，35个循环；72℃5min。将PCR产物回收纯化后连接到pMD18-T(日本Takara公司上)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京Tiangen公司CB101)，挑选阳性克隆后，进行测序。
序列测定结果表明，PCR反应获得的片段具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，编码425个氨基酸残基组成的蛋白质(见序列表的SEQ ID NO.3)。将SEQ ID NO.3所示的蛋白命名为OsPDC-E1-α1，将SEQ ID NO.3所示的蛋白的编码基因命名OsPDC-E1-α1。
实施例2、转基因植物的获得和鉴定
一、重组表达载体构建
以DJY(来自南京农业大学水稻所种质资源库)的基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得OsPDC-E1-α1基因，PCR引物序列如下：
Primer3：
5'CCGGCGCGCCAAGCTTGCAGCGAGAAATCCATGGCA 3'(SEQ ID NO.6)；
Primer4：
5'GAATTCCCGGGGATCCTCAGACTTGGGCCGTGCCTT 3'(SEQ ID NO.7)。
上述引物位于SEQ ID NO.2所示基因的上游2.27kb和下游3.16kb，扩增产物包含了该基因的启动子部分和基因组部分，将PCR产物回收纯化。采用INFUSION重组试剂盒(日本Takara公司)将PCR产物克隆到载体pCAMBIA1390中。INFUSION重组反应体系(10μL)：PCR产物2.0μL，pCAMBIA1305 5.0μL，5×infusion buffer 2.0μL，infusion enzyme mix 1μL。短暂离心后将混合体系37℃水浴15分钟，而后50℃水浴15分钟，取2.5μL反应体系用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京Tiangen公司；CB101)。将全部转化细胞均匀涂布在含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。37℃培养16h后，挑取克隆阳性克隆，进行测序。测序结果表明，得到了含有SEQ ID NO.1所示基因的重组表达载体，将含有OsPDC-E1-α1的pCAMBIA1390命名为pCAMBIA1390-OsPDC-E1-α，OsPDC-E1-α基因片段利用INFUSION重组试剂盒(日本Takara公司)插入到该载体的HindIII和BamHI酶切位点之间。
二、重组农杆菌的获得
用电击法将pCAMBIA1390-OsPDC-E1-α1转化农杆菌EHA105菌株(购自美国英俊公司)，得到重组菌株，提取质粒进行PCR及酶切鉴定。将PCR及酶切鉴定正确的重组菌株命名为EH-pCAMBIA1390-OsPDC-E1-α1。
用pCAMBIA1390作为对照载体转化农杆菌EHA105菌株，方法同上，得到转空载体对照菌株。
三、转基因植物的获得
分别将EH-pCAMBIA1390-OsPDC-E1-α1和转空载体对照菌株转化水稻造粉体发育异常突变体flo19，具体方法为：
(1)28℃培养EH-pCAMBIA1390-OsPDC-E1-α1(或转空载体对照菌株)16小时，收集菌体，并稀释到N6液体培养基(Sigma公司，C1416)中至浓度为OD600≈0.5，获得菌液；
(2)将培养至一个月的flo19水稻成熟胚胚性愈伤组织与步骤(1)的菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基(N6固体共培养培养基，Sigma公司)中，24℃共培养3天；
(3)将步骤(2)的愈伤接种在含有100mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基上第一次筛选(16天)；
(4)挑取健康愈伤转入含有100mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基上第二次筛选，每15天继代一次；
(5)挑取健康愈伤转入含有50mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基上第三次筛选，每15天继代一次；
(6)挑取抗性愈伤转入分化培养基上分化；得到分化成苗的T0代阳性植株。
四、转基因植株的鉴定
1、PCR分子鉴定
将步骤三获得的T0代植株提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用Primer1和Primer2为引物进行扩增。
PCR反应体系：DNA(20ng/μL)2μL，Primer1(10pmoL/μL)2μL，Primer2(10pmol/μL)2μL，10xBuffer(MgCl2 free)2μL，dNTP(10mM)0.4μL，MgCl2(25mM)1.2μL，rTaq(5U/μL)0.4μL，ddH2O 10μL，总体积20μL。
扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30s，55℃1min，72℃2.5min，35个循环；72℃5min。
PCR产物用8％的非变性PAGE胶分离，银染。确定转基因阳性植株。
2、表型鉴定
分别将T0代转pCAMBIA1390-OsPDC-E1-α1阳性植株、T0代转空载体对照植株、突变体flo19和DJY种植在南京农业大学土桥水稻育种基地转基因田内。种子成熟后，收取各材料种子，观察到pCAMBIA1390-OsPDC-E1-α1植株的种子中出现了透明的种子(图6)。因此证明flo19中的突变表型是由OsPDC-E1-α1的突变造成的。pCAMBIA1390-OsPDC-E1-α1可以使flo19株系的种子恢复透明的表型。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种水稻胚乳粉质相关基因OsPDC-E1-α1及其编码蛋白质和应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3829
<212> DNA
<213> 稻属水稻(Oryza sativa var. Diangengyou 1)
<400> 1
cagttagttt ccacggtata ttttcccggt ttgggttagg ccatccatcc tccatccctg 60
ggcgcttgct gggcctcggc ggatcccccg aagcagccgc cgcaacaacg agagaaaggc 120
aacaaatcaa tcaattcccc catcttcctc gttctctccg cctcctcccc actctccatt 180
tatactcctc ttctcctctc catcgccgca ttgctcgcca ccccgacgac gacgacgacg 240
acggcgacgg cggaggagta gagacagaga gatggccgcc gcgtcctcct tcaccgccgc 300
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ccaaaatata tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata 600
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actcatgatg tttttttatt ggtctatatc tgaaactata ttctcattat tcattttatg 3060
gtttgtatca tcacacagtt attgaatcct taagtcagct gtacagtttc tttcctccta 3120
atttgctctg actaaatcgt cttatgacat tgtgcacaga tgagaaatct cattacgccg 3180
caagggaccc cattacagcc ttgaagaagt acatcatcga acagaacctt gcaactgaat 3240
ccgagctgaa gagcatcgag aaaaagatcg atgatgttgt tgaagaggcc gtggagttcg 3300
ctgacgcaag cccgctccct ccccggagcc agcttctgga aaacgtgttc tcagatccca 3360
agggctttgg aattggccct gacgggaagt accggtgtga ggatcccttg ttcacgcaag 3420
gcacggccca agtctgagag gctcaacgag cacgcttatc agttattatg tcatgctttt 3480
tcttgtctct ctctagctct accctatcct agtttttgtc gaacccatcg tcgtgttaag 3540
cgtaatgtaa gcacaaccta cttcttcatt tgtttcattc ttagacctcc catatcaata 3600
tgctcaactg ctgccccagt ttttgctcag tgtgttcgat ttgctcttca gtagttctat 3660
tggtttcaga acagctgggc ctgtaatcac tcactcctat gtctggacat gcaaagatac 3720
ttctggttta gagtttcagc tgagttacag tgattagttt cctgcctgtt atactatatt 3780
tataaacatc atgatggaat gtgagacaat atctgctgtc cttgtttta 3829
<210> 2
<211> 1278
<212> DNA
<213> 稻属水稻(Oryza sativa var. Diangengyou 1)
<400> 2
atggccgccg cgtcctcctt caccgccgcc gccaagttct tggcgccggt gtccgcgaga 60
tccgccgggg actacaagcc gccgctcccg ctcccggcct ccgcctccct caggcccggg 120
aggaagcccg cgccccgcct ccgcaccgcg ctcgccgtct cctccgacgt gctccccggg 180
aacaaggccg cccccgccgc cgccgcccac tccgctgtca cgcgggaaga ggctttggag 240
ctgtacgagg acatggttct tggccgtatt ttcgaggata tgtgcgcgca aatgtactac 300
cgtggcaaga tgtttggttt tgtccattta tacaatgggc aagaagctgt ctccactggc 360
ttcatcaagc tgctcaacca agctgactgt gttgtcagca cataccgtga ccacgtccat 420
gccctatcca agggtgtccc tgcacgttct gtcatggctg agcttttcgg taaggccact 480
ggctgctgcc gtggacaagg tggttctatg cacatgttct ctgaacccca caacctcctt 540
ggaggttttg ccttcatcgg agagggcatc cctgttgcta ctggtgctgc ctttgctgct 600
aaataccgcc atgaggtgct caagcagtct agccctgatg gacttgatgt aaccctggca 660
ttctttggtg atggtacctg taacaatggc caattctttg agtgcctgaa catggctcag 720
ctttggaagc ttcctattgt gtttgttgtg gagaacaatc tatgggcaat tgggatgtcg 780
catcttaggg ctacttcaga cccagagatt tataagaagg gtccagcgtt tggaatgccc 840
ggcgtgcatg ttgatgggat ggatgtcctg aaggtcaggg aggtggctaa ggaggccatt 900
gagagggcaa ggagaggtga aggaccgact cttgtggagt gtgagactta ccggttcaga 960
gggcattctc ttgctgatcc agatgagctc aggagacctg atgagaaatc tcattacgcc 1020
gcaagggacc ccattacagc cttgaagaag tacatcatcg aacagaacct tgcaactgaa 1080
tccgagctga agagcatcga gaaaaagatc gatgatgttg ttgaagaggc cgtggagttc 1140
gctgacgcaa gcccgctccc tccccggagc cagcttctgg aaaacgtgtt ctcagatccc 1200
aagggctttg gaattggccc tgacgggaag taccggtgtg aggatccctt gttcacgcaa 1260
ggcacggccc aagtctga 1278
<210> 3
<211> 425
<212> PRT
<213> 稻属水稻(Oryza sativa var. Diangengyou 1)
<400> 3
Met Ala Ala Ala Ser Ser Phe Thr Ala Ala Ala Lys Phe Leu Ala Pro
1 5 10 15
Val Ser Ala Arg Ser Ala Gly Asp Tyr Lys Pro Pro Leu Pro Leu Pro
20 25 30
Ala Ser Ala Ser Leu Arg Pro Gly Arg Lys Pro Ala Pro Arg Leu Arg
35 40 45
Thr Ala Leu Ala Val Ser Ser Asp Val Leu Pro Gly Asn Lys Ala Ala
50 55 60
Pro Ala Ala Ala Ala His Ser Ala Val Thr Arg Glu Glu Ala Leu Glu
65 70 75 80
Leu Tyr Glu Asp Met Val Leu Gly Arg Ile Phe Glu Asp Met Cys Ala
85 90 95
Gln Met Tyr Tyr Arg Gly Lys Met Phe Gly Phe Val His Leu Tyr Asn
100 105 110
Gly Gln Glu Ala Val Ser Thr Gly Phe Ile Lys Leu Leu Asn Gln Ala
115 120 125
Asp Cys Val Val Ser Thr Tyr Arg Asp His Val His Ala Leu Ser Lys
130 135 140
Gly Val Pro Ala Arg Ser Val Met Ala Glu Leu Phe Gly Lys Ala Thr
145 150 155 160
Gly Cys Cys Arg Gly Gln Gly Gly Ser Met His Met Phe Ser Glu Pro
165 170 175
His Asn Leu Leu Gly Gly Phe Ala Phe Ile Gly Glu Gly Ile Pro Val
180 185 190
Ala Thr Gly Ala Ala Phe Ala Ala Lys Tyr Arg His Glu Val Leu Lys
195 200 205
Gln Ser Ser Pro Asp Gly Leu Asp Val Thr Leu Ala Phe Phe Gly Asp
210 215 220
Gly Thr Cys Asn Asn Gly Gln Phe Phe Glu Cys Leu Asn Met Ala Gln
225 230 235 240
Leu Trp Lys Leu Pro Ile Val Phe Val Val Glu Asn Asn Leu Trp Ala
245 250 255
Ile Gly Met Ser His Leu Arg Ala Thr Ser Asp Pro Glu Ile Tyr Lys
260 265 270
Lys Gly Pro Ala Phe Gly Met Pro Gly Val His Val Asp Gly Met Asp
275 280 285
Val Leu Lys Val Arg Glu Val Ala Lys Glu Ala Ile Glu Arg Ala Arg
290 295 300
Arg Gly Glu Gly Pro Thr Leu Val Glu Cys Glu Thr Tyr Arg Phe Arg
305 310 315 320
Gly His Ser Leu Ala Asp Pro Asp Glu Leu Arg Arg Pro Asp Glu Lys
325 330 335
Ser His Tyr Ala Ala Arg Asp Pro Ile Thr Ala Leu Lys Lys Tyr Ile
340 345 350
Ile Glu Gln Asn Leu Ala Thr Glu Ser Glu Leu Lys Ser Ile Glu Lys
355 360 365
Lys Ile Asp Asp Val Val Glu Glu Ala Val Glu Phe Ala Asp Ala Ser
370 375 380
Pro Leu Pro Pro Arg Ser Gln Leu Leu Glu Asn Val Phe Ser Asp Pro
385 390 395 400
Lys Gly Phe Gly Ile Gly Pro Asp Gly Lys Tyr Arg Cys Glu Asp Pro
405 410 415
Leu Phe Thr Gln Gly Thr Ala Gln Val
420 425
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggttcttg gccgtatttt cgagg 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcagacttgg gccgtgcctt gcgtg 25
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccggcgcgcc aagcttgcag cgagaaatcc atggca 36
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaattcccgg ggatcctcag acttgggccg tgcctt 36