具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

以下为对本发明进一步对OsMND1基因的上下游基因及其参与的相关调控信号通路进行分析，并分析OsMND1基因是否具有更广泛的增产作用。通过分析该基因在水稻分蘖调控机理研究及高产品种培育中的作用，以期丰富水稻等禾谷类作物分蘖的分子机理积累资料，通过基因工程手段为水稻的高产分子模块设计育种提供新的基因资源。

一、材料与方法

1.植物材料及种植方式

实验材料以水稻(Oryza sativaL.)Ballila分别为背景材料，获得Ballila背景下OsMND1超量表达突变株系OsMND1:OsMND1实验材料均种植于海南大田(冬季)和武汉大田(夏季)以及湖北大学生命科学学院一楼智能温室，生长条件为光照16h，黑暗8h，温度30±5℃。

2.所用试剂

无水乙醇、二甲苯、甘氨酸和其他化学药品均采购于国药集团，ProteaseInhibitor采购于罗氏公司，PCR Mix、高保真酶、蛋白预制胶和其他分子试剂采购于上海翌圣生物科技(上海)有限公司，石蜡切片相关溶剂与耗材采购于江苏世泰和塞维尔生物科技有限公司，引物均由北京擎科新业生物技术有限公司合成。DNA提取试剂盒、RNA提取试剂盒和反转录试剂盒均采购于江苏康为世纪生物科技股份有限公司。

实施例一

超量表达载体的构建、水稻遗传转化及阳性植株的筛选

构建超量表达载体，通过转化水稻品系Ballila以研究其在分蘖过程中的作用，其中，B3Ubi单子叶植物超量表达载体由武汉大学陈荣智博士构建。

1.利用引物osmnd1-br:5'ataggatccatggatatcagaccatctggaagt3'(SEQ IDNO.4)和osmnd1-bf:5'ataggatccctacagtgacaagtcgccaccc3'(SEQ ID NO.5)，将OsMND1基因两端加上BamHI接头，克隆到带有Ubi强启动子的转基因载体B3Ubi上的BamHI位点上。载体经BamHI酶切后需经过去磷酸化反应以降低自连背景，得到正向插入和反向插入的重组质粒，经PCR和酶切验证后将正向插入重组质粒B3Ubi-mnd1测序，结果显示目的基因正确插入且序列一致，获得OsMND1超量表达载体B3Ubi-mnd1。

2.将上述构建超量表达载体B3Ubi-mnd1转化粳稻Ballila愈伤组织作为遗传转化的受体材料，农杆菌介导水稻成熟胚种子愈伤组织实现遗传转化，通过抗性愈伤的筛选、分化和生根等步骤生长阳性植株，具体步骤如下：

农杆菌的转化(冻融法)：取1μg质粒加到100μl农杆菌感受态中，混匀后置于冰上5分钟；转入液氮中处理5min；再置于37℃中水浴5min；加入1ml的LB液体培养基，混匀，28℃振摇培养4hr；3000rpm离心5min，弃上清，加入100μl的LB培养基重悬沉淀；涂布于含50mg/lkan,50mg/lRif的LB平板上，28℃培养两天至单菌落形成。

农杆菌转化愈伤组织：从农杆菌保种平板上挑取一个单菌落接种于LB(50mg/LKan⁺,50mg/L Rif⁺)液体培养基中，28℃培养至OD₆₀₀＝0.5；于4℃预冷10min；4℃，5000rpm离心5min；去上清，将菌体重悬于感染培养基中，使OD₅₉₅＝0.6。将生长旺盛，致密的愈伤组织，浸入含农杆菌的感染培养基中约20min后，取出用无菌滤纸吸干，接种于转化培养基中，24℃暗培养3天。共培养结束后，将愈伤组织转到除菌培养基上，26℃暗培养，培养过程中若见农杆菌菌落，用含500mg/L头孢霉素的无菌水洗涤愈伤组织、再继续培养在新鲜的除菌培养基上。10天后，用含500mg/L头孢霉素的无菌水洗涤愈伤组织，无菌滤纸吸干后，转接到选择培养基(N6培养基+50mg/ml1mL潮霉素)上，于26℃，光周期15小时的条件下继续培养。一个月后，使用反转录-聚合酶链反应进行抗性愈伤筛选，将新长出的淡黄色愈伤组织转接于分化培养基中，分化出苗，生根，移栽，最终获得突变体植株，命名为OsMND1:OsMND1。

RT-PCR鉴定阳性植株中目的基因表达量：RNA提取使用康为世纪公司的植物RNA提取试剂盒，参考方法为较易提取植物组织RNA小量提取法。以1μg的RNA做模板，按照cDNA合成试剂盒操作说明合成第一链cDNA。根据OsMND1基因cDNA全长序列设计特异引物(MND-1-FGGAGGAACTGGCTGCTTATGCT(SEQIDNO.6)和MND-1-RGAGTTGTTCTTTTGCTTGTGGGA(SEQ IDNO.7))。RT-PCR反应体系(20μL)：10×PCR反应缓冲液2μL，dNTP(2.5mmol/L)1μL，引物(10pm/μL)各1μL，Taq聚合酶(5U/μL)0.2μL，模板cDNA2μL，ddH2O12.8μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，33个循环；72℃延伸10min，4℃保存。突变体OsMND1:OsMND1与野生型比对分析结果表明超量表达植株OsMND1:OsMND1茎基部OsMND1表达量相较于野生型ballila则显著上调，表明突变株真实有效(如附图1)。

实施例二野生型和超量表达阳性植株中的表型分析

如图2至图3所示，超表达MND1基因后水稻分蘖数从10-19个增加到45-55个，株高明显降低，水稻分蘖数主要受分蘖芽的生成和分蘖芽的伸长两方面影响，通过持续观察水稻茎基部分蘖的生长发育过程，发现超量表达植株OsMND1:OsMND1分蘖芽整体发育过程明显快于野生型Ballila。

从图4、5可以看出3WAT(插秧后3周)、4WAT(插秧后4周)时期，超量表达植株OsMND1:OsMND1分蘖数相比野生型Ballila显著增加，4WAT左右，野生型Ballila分蘖数已趋于稳定，与此同时，超量表达植株OsMND1:OsMND1分蘖数仍旧继续增加，于5WAT时期数量趋于稳定，最终，超量表达植株OsMND1:OsMND1分蘖数相较于野生型ballila增加225％；株高差异不明显，仅有部分降低株高的趋势。超量表达植株OsMND1:OsMND1抽穗期明显较野生型ballila时间更久，同时更易产生三次分蘖、四次分蘖以及高位分蘖，一次分蘖和二次分蘖灌浆期依旧有新的更高次级分蘖产生。

水稻茎基部石蜡组织切片，具体步骤如下所示：

软化：提取前述步骤中获得超量表达阳性植株OsMND1:OsMND1，以及野生型植株WT，选取不同时期的分蘖芽部位在15％HF溶液中软化两周以上；

固定：软化后的水稻材料在70％FAA固定液中4℃固定至少过夜；

脱水：将固定的植物材料经70％乙醇溶液清洗三次，每次30分钟，共1.5小时，然后在低温保藏箱(4℃)中进行梯度脱水，每步1.5-2小时：70％乙醇溶液(可过夜)，85％乙醇溶液，95％乙醇溶液，100％乙醇溶液，100％乙醇溶液，100％乙醇溶液(v/v)。

透明：依次在不同浓度的二甲苯中分别透明1-2小时：25％(v/v)二甲苯:75％(v/v)乙醇，50％(v/v)二甲苯:50％(v/v)乙醇(可过夜)，75％(v/v)二甲苯:25％(v/v)乙醇，100％二甲苯，100％二甲苯，100％二甲苯。

浸蜡：向容器中加入适量碎蜡36℃2h，接下来3h内待上次蜡溶解后加入新的碎蜡；提高温度到42℃，待上次蜡溶解后加入新的碎蜡，3h；42℃过夜；100％石蜡58℃浸蜡2-3天，其间至少换四次蜡；接着换取新的100％石蜡60℃浸蜡2h。

包埋：预先准备好包埋块和水浴锅，水浴锅温度根据蜡块的熔解温度确定，这里使用58℃的蜡块，水浴锅温度设置为60℃，在电炉上熔化石蜡，置于水浴锅中备用，包埋石蜡温度不宜过高，包埋材料时根据切面调整材料最适包埋位置，可用烧热的镊子调整材料位置。包埋块表面自然冷却后，可放入-20℃冷冻快速凝固，包埋好的蜡块做好标记放入4℃冷藏箱长期保存。

蜡块修整：将材料修整成上窄下宽的梯形台。

切片：用切片机将包埋的组织切成8μm切片。粘片和展片：载玻片磨砂面涂上丹青甘油粘片剂，切好的蜡带放42℃水浴锅中充分展开，置于涂好粘片剂的载玻片上，42℃烘干，玻片可置于玻片盒中长期保存。

脱蜡：将切片在100％二甲苯脱蜡两次，每次2小时；

复水：将切片在50％(v/v)二甲苯:50％(v/v)乙醇处理1.5小时，然后使用100％乙醇溶液处理5分钟，然后分别在95％(v/v)，80％(v/v)，70％(v/v)浓度乙醇中依次放置1.5小时；

番红染色：将切片放入番红溶液，染色4小时以上，可过夜；

流水冲洗：流水冲洗掉多余染液；染色后的切片分别在50％(v/v)，70％(v/v)，85％(v/v)，95％(v/v)乙醇中放置3-5分钟；

固绿复染：切片在1％固绿溶液中染色3sec。流水冲洗：流水冲洗掉多余染液；复染后的切片依次放置于在下列溶液中4分钟：95％(v/v)，100％乙醇，100％乙醇；50％(v/v)乙醇+50％(v/v)二甲苯，100％二甲苯，100％二甲苯。封片：在载片上加入2滴加拿大树脂，并立即加上盖片，42℃烘48h。

水稻分蘖数主要受分蘖芽的生成和分蘖芽的伸长两方面影响，通过观察持续观察室水稻茎基部分蘖的生长发育过程，发现超量表达植株OsMND1:OsMND1分蘖芽整体发育过程明显快于野生型Balila。从图6可以看出，2WAG时期，超量表达植株OsMND1:OsMND1分蘖芽开始生成，并随着时间的推移，分蘖逐渐增多,5WAG时期，已生成4个分蘖芽；野生型ballila从2WAG时期起，分蘖芽生成数量滞后于超量表达植株OsMND1:OsMND1，最后仅生成2个分蘖芽。

水稻茎基部截面扫描电镜观察，具体步骤如下所示：

从培养室中，将超量表达阳性植株OsMND1:OsMND1和野生型WT清洗后转移至实验工作台，使用干净的刀片在2.5％戊二醛固定液中切取适量的茎基部组织，并将基部组织于纵向中心切开，置于容器中，摇晃容器，使材料充分沉底，4℃或室温固定一周以内。使用0.1MPBS溶液清洗三次，每次15分钟。

将固定好的植株OsMND1:OsMND1和野生型WT进行逐级脱水处理，首先植株OsMND1:OsMND1和野生型WT置于30％乙醇处理15min，依次为50％乙醇、70％乙醇，70％乙醇中可长时间保存，再用80％乙醇、90％乙醇分别处理15分钟，无水乙醇需要处理两次，每次需15分钟，脱水期间，适度摇晃材料，帮助材料更好的脱去水分。

逐步利用乙酸异戊酯置换出乙醇，以下步骤均需要在通风橱中操作：

配制体积浓度为50％乙酸异戊酯+50％乙醇的混合液，使用该混合液处理30分钟，再用纯的乙酸异戊酯处理材料1小时，保证乙醇溶液被充分置换。用铅笔在小纸片上写好编号，将对应编号的字片和材料放入临界干燥仪的小笼子中备用。提前打开临界点干燥仪预冷1h以上。将装有样品的小笼子放进预冷的临界点干燥仪样品室内，充分拧紧样品室盖子后注入液体二氧化碳至淹没样品为准，先升温至15℃加温10min，再升温至35℃让二氧化碳气化，观察液体全部气化后慢慢放气。气体放净后开盖取出样品，用于后续实验操作。干燥后的样品保存于干净的EP管中，粘样时，首先在样品台上粘上两条双面导电胶，用平口镊子将样品朝上平衡的粘在样品台上，过程中，镊子只能夹取材料侧边，避免破坏样品表面，干扰实验观察。将贴好材料的多个样品台放入离子溅射仪中，打开仪器开始抽真空，当真空达到8.0Pa后，再次抽真空，直到再次降到8.0Pa以下后，点start按钮进行喷金，喷金工作可提前数小时完成。

根据样品的高度，样品台固定在样品座上，样品台不可过高，容易打到实验仪器，将样品放入扫描电镜样品仓，抽真空，待HT亮起后加高压，根据视野调整观察区域,找到目的区域进行放大聚焦，并调整焦距大小，获得最佳视野，SCAN3慢扫获得照片。比较图7、图8可知，通过扫描电镜观察超量表达植株OsMND1:OsMND1的分蘖芽生长较野生型比较粗壮，且生长速度有所提高，即超量表达植株OsMND1:OsMND1的分蘖生长情况有所提高。

OsMND1序列对应基因的全长

OsMND1序列对应基因的全长序列为1191bp，其中包含完整读码框序列长度为624bp，序列如SEQ ID NO.1；

采用NCBI ORF-finder预测其编码蛋白质为207个氨基酸，序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明中未明确说明实验步骤等均为常规技术，因此不做赘述，如上述成熟其籽粒大小的分析。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 湖北大学

<120> 一种水稻分蘖调控基因OsMND1及相关蛋白与应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5655

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cttgtcttct taattccgag tagcaagagt ctccgagtgt cttccccttc ccaaaagaaa 60

gaaaatctcc cgctccttgc gccgccaacg ccaagacgag tggcggctga acaggggagg 120

ggcggcgatc tctatctggc gagcagagca ggggagagga tcatggtgag catccacatc 180

ctctttctct gattcatctc tctctctctc tttcccatcg ggactacttt tgtctggaat 240

ttgcttgcgt tcattcgtta accctagctt ctcttctaga tctggaagaa gctcttctcc 300

tccttaattt gagagcctta aacctctctt aatacacgta gtaacagttt gtttgttccc 360

cgaaaagttt cccaagttgg atccgcccct gacagataga tatatatgtt catgttgtaa 420

atgatagtga ggtatctgtt gcggggggaa ccagggtttc tataccacgg tcttgatgca 480

tgtcagatgt ttattgaaat gctggtaggt ggatctttac agtgctgctg aaatgtgatg 540

gaattgtatt ctacgcgact taatttgtct tgtcattcga atatgtttta catcatgcca 600

tattgccatc cactaaaaat gtctgaatga agaaacagcc ataagaaata taactgatct 660

taagatgttt aaagcctaca atgctactct tgctaactga tagttccatt aagttatttt 720

ggtccatgag cacagaaatt ttcttctatt tagtatttag caaccacctt tgtttagttt 780

aatttctaac tgttgctctc catatggtgc ttagtcgaag aagaggggtc tttctttgga 840

ggagaagagg gagcagatgc tacaaatatt ttatgacagt caagacttct atctggtaag 900

ttcttctgtc aagatttcat gatatctgcc ctaggattgc cgtattagct gtttgcaagt 960

tatctgtaac aaattcaagg gttatgttgt ttcttctgct aatgtggagg cactggtttg 1020

cagatgtccc agtagctctt ttcattcctt tctgctgctg cattattatg ctttataatg 1080

taggcgaata aatgaaacca atcagcgccc aagtgccaat ctaatactgt gatttgtttc 1140

cagtttcttc ttttttggtt tgggtttgta aagttgacat ggcaatgctt cgttatatgt 1200

atgcaggaaa agtcattatc tgttccaatt tgtagtaaaa ctaactaatc atcaattttc 1260

agaactaatc ctcggatata caattatgca actattaatg ctagtgcaag catacaccca 1320

tatattagtg ccagcaggtt gaggttttga tgcatttgta tttctgttac tacaaattta 1380

gggtcagatg ctcatactgg tcattattat gtatttctgt tgtttgccca tgccatacat 1440

tgctattcta agcgctgttc tgctaggttt ctgagtagac tatattttca tatgtcctaa 1500

gtcccaatcc atacttctgc tttcagctta aagagcttga gaagttgggt cccaaaaagg 1560

gtgtcatcag tcagtcagtg aaggatgttg tgcaaagcct ggtggatgat gatcttgtct 1620

tgaaagataa aatagggact tcagtaagtg tagctgctta tctaaattgt gccatggacc 1680

tagatttgtc aaactgcttt ctcagtaatg gagccttgtc atataatgtt tttcatcaaa 1740

gttgatgcat ctgtaactca agaaaggttt cttttgtgta ttcttcaaga gctagtgcac 1800

tgagtttcat gtagctacat tctgcatgtt ttgcaaaggg ccagttctta gttaattttt 1860

tgtttacata tcctcaccga tgtgcctttt gcgtttggtt tctcaaacta aatagtttcc 1920

ttacaggtgt acttttggag tcttcccagc tgtgctggaa atcaggtatt tttttatacc 1980

attactaccc cctttaacct tgcatgtgtc aattctcatg tctgatttta tttattcggt 2040

gataacatgg cacaaattcg gtaccaagag ttagatcccc tgaccatatt ttttttttcc 2100

taatgacaat tggtaacacg agtaaaagta agcaagctag acggcacact ctgtccttta 2160

aattcttctt acaggtttgc gaagaacaaa atacttttta tgttaatttt ctgagtatat 2220

agtgtggtgc tggctccatg tattagtatc acaactagct tttgaagctt tgcagaagag 2280

agtattaact gccatgaatc attcctatta gtgcagcata ccctagtggt ttgagaatca 2340

ggataatata caggtaagaa gagcttttgt ttactcatca agatagaggc aagcaaagag 2400

ggattttcgt cattttgttg atcacttgga taaatgcagc aactagtaat atatttctta 2460

ttgcaacttt tagtgcacat taataccttc atttgtcatt acttgtcata gtttaagcta 2520

atccatctat ggatctgttt gtagctgagg actacttaca gcaaactgga atctgatctt 2580

tcaagctcta aaaagcgctt catagagctt gttgagcaga gagagaattt gaaaagaggc 2640

agagaggact ctgtaagtaa ttgtgcattt tcctacaacc ttatgacaaa aatgtaaatc 2700

caattcatat acactgatct aggatgagag agaagctgct ttggaggagc tgaaggctgt 2760

agagcaacac cacaagaagt taaaggtgta ttcacagtct tgtcttttat ttaatttatc 2820

ttttccattt aggtatctac aactcaattg tttcgcattg tttttcagga ggaactggct 2880

gcttatgctg atagtgatcc agcagcacta gaggcaatga gtatggcata ccgcatccct 2940

tttttgtttc tatttacgcc tttgcatgtc tgttatctga tgatacaatc aatgtgaaat 3000

tgtcaattac tttccatgta gcatctcttt ttcatccaag tttagcagca acttaacatt 3060

gcttaggaca ttccctgcac aaaattgttc cacaatttaa ctactgtaaa atggtaatta 3120

cagatgatgc tattgaggtt gctcatgcgg cagctaacag atggacaggt atcggtggtc 3180

ttgctagtca cattccctat atatttatat gtctgcagct tgtttatcat cagaacaggc 3240

taacggaatt ctgaatgtaa ctacagacaa tatcttcact ctgcaacagt ggtgttcgac 3300

cactttccca caagcaaaag aacaactcga acacatgtac agggaggtag gttctgtcct 3360

cttacccatc cattttcttt cttataatat catccatcgc ttcaataata catatccaaa 3420

tgataaaatc ttagcatgtt ttttccaatg aatatctgac agactggtca tttgcaagag 3480

atgttttcct atattactga gtgatatatt cagttataac ctgcatattt aaagaagaac 3540

ctaggtggta ataacaaaaa aattatgttc tgtacataaa aattcagatt gatgaagtct 3600

gcaacagtct gtcctgttca aacctgacag taggccatcc atatcaggca tcaagccatg 3660

aatgacaaat caattctgga catttgttag tatctggtca ccaatcatgt actgatcggt 3720

caactatttt acgattatta tagtttatta gcattactga cccacaacct ggccatctga 3780

gtacttgttg cgtatcttta gactagatca tatataaaaa ataacttaaa ttctgtcata 3840

cttaactgag gatattgaaa ttagagagaa aacagtgata gcatttcgca acttaacttt 3900

tgggttccca ttgtagaact aaagatccag agatctaagc tttggtgaat cagttgttag 3960

taataattgc tgcatggatg tgatcattaa ttagtttgta ttggtcctca aatggcgtaa 4020

gaaaaaaaat attcaaaggg tctatgaacc ttcaaacagc ctcattaaat gcagcaagca 4080

ttttatcatg tatgcatgct gtactatatt cttttctgta gttctgttag gtcctgtttc 4140

agttagtcaa gcactatata tcttttcctt gtctaagatc ttacatattg gtattggatg 4200

cattttttgt aataatgttg ttttaagggt atgagcattt tgaggccatg ctgatgatgt 4260

tatttaaaaa gcttgcactt gtttgctgtt tggactctat actgataagc ctaaatcatg 4320

tccatctgtt ttgattagtt cttggtgcta tttgtcttct cttagctatc ataccaaact 4380

tgttattcta gttacttctg ggattgatta taatatccac atgagtacaa tatttcttca 4440

tgttgtaagt tatgctaagc gccctcaata aggatatccc tcaaacttcc ttggcttgaa 4500

tggtcactaa attgcaaggg agcaaagcca ttgcccagta gaacacttct acacttcatg 4560

tgtctggctt gagtgatcat accccaacgg cccaacccag tcactttcca tatcaggact 4620

caaaagcttg tcattctctc gggttgatag aagtgttcta gaaatattga tatctttgtg 4680

agtgatgatc caatagttta gcttttgctg tgattagttc ccttcaaact tccaactttt 4740

ccgatcacat caaatgtttg gacacatgca tggagcatta aatgtggacg taaaaaaaac 4800

caattgcaca gtttgcatgt aaattgcgag acgaatcttt tgagccttat tacgccatga 4860

gttgacaatg tggtgctaca gtaaacattt gctaatgacg gattaattag gcttaataga 4920

ttcgtctcgc agtttacagc cggaatctgt aatttgtttt gttattagtt tacgtttaat 4980

acttcaaatg tgtatccgta tacgtcaaat tttttttgcc aaaacaacta aacacggcct 5040

ttgtccactc cacatcacca caactaaagt ttcacatatg ttgtgctgct ggttttttga 5100

gcatccccaa tgcttttcct tcacgctagt accctctgtt tgtgtaacaa ggcgttttca 5160

cttctcatag tttcctctgt tctcatgttc tgatttactc ttgtgaaatt tcaggtgggg 5220

ataactgaag atttcgaata tctgcagtaa tgcataacat cctggttgcc ctgttacaaa 5280

accgtatgta acccaactca gcaaatctag agtagttcac ctggaatctg tagaagttta 5340

ttcataccca tgttagcaat cttacagtaa atgatcccaa tatgctccat attttctgct 5400

ttgtaagtaa ggtacctatg gaatgctgtc agaaaaacag ttctctatga tgacagaaca 5460

ctaacagatg agatatcgga tgaatttggt agatgcatgc cagatattga taacccattt 5520

taatctggta gatgcatgac tgaaaaaaaa attgcaacag aaatcaaatt tcctgaccat 5580

cggagcagat gcccgctttt catgtaccac ctatcaattt cattcttaaa tttgacttta 5640

ctttatgaga ataaa 5655

<210> 2

<211> 624

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtcgaaga agaggggtct ttctttggag gagaagaggg agcagatgct acaaatattt 60

tatgacagtc aagacttcta tctgcttaaa gagcttgaga agttgggtcc caaaaagggt 120

gtcatcagtc agtcagtgaa ggatgttgtg caaagcctgg tggatgatga tcttgtcttg 180

aaagataaaa tagggacttc agtgtacttt tggagtcttc ccagctgtgc tggaaatcag 240

ctgaggacta cttacagcaa actggaatct gatctttcaa gctctaaaaa gcgcttcata 300

gagcttgttg agcagagaga gaatttgaaa agaggcagag aggactctga tgagagagaa 360

gctgctttgg aggagctgaa ggctgtagag caacaccaca agaagttaaa ggaggaactg 420

gctgcttatg ctgatagtga tccagcagca ctagaggcaa tgaatgatgc tattgaggtt 480

gctcatgcgg cagctaacag atggacagac aatatcttca ctctgcaaca gtggtgttcg 540

accactttcc cacaagcaaa agaacaactc gaacacatgt acagggaggt ggggataact 600

gaagatttcg aatatctgca gtaa 624

<210> 3

<211> 207

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ser Lys Lys Arg Gly Leu Ser Leu Glu Glu Lys Arg Glu Gln Met

1 5 10 15

Leu Gln Ile Phe Tyr Asp Ser Gln Asp Phe Tyr Leu Leu Lys Glu Leu

20 25 30

Glu Lys Leu Gly Pro Lys Lys Gly Val Ile Ser Gln Ser Val Lys Asp

35 40 45

Val Val Gln Ser Leu Val Asp Asp Asp Leu Val Leu Lys Asp Lys Ile

50 55 60

Gly Thr Ser Val Tyr Phe Trp Ser Leu Pro Ser Cys Ala Gly Asn Gln

65 70 75 80

Leu Arg Thr Thr Tyr Ser Lys Leu Glu Ser Asp Leu Ser Ser Ser Lys

85 90 95

Lys Arg Phe Ile Glu Leu Val Glu Gln Arg Glu Asn Leu Lys Arg Gly

100 105 110

Arg Glu Asp Ser Asp Glu Arg Glu Ala Ala Leu Glu Glu Leu Lys Ala

115 120 125

Val Glu Gln His His Lys Lys Leu Lys Glu Glu Leu Ala Ala Tyr Ala

130 135 140

Asp Ser Asp Pro Ala Ala Leu Glu Ala Met Asn Asp Ala Ile Glu Val

145 150 155 160

Ala His Ala Ala Ala Asn Arg Trp Thr Asp Asn Ile Phe Thr Leu Gln

165 170 175

Gln Trp Cys Ser Thr Thr Phe Pro Gln Ala Lys Glu Gln Leu Glu His

180 185 190

Met Tyr Arg Glu Val Gly Ile Thr Glu Asp Phe Glu Tyr Leu Gln

195 200 205

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ataggatcca tggatatcag accatctgga agt 33

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ataggatccc tacagtgaca agtcgccacc c 31

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggaggaactg gctgcttatg ct 22

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gagttgttct tttgcttgtg gga 23