高效促进丹参酮积累的基因SmWRKY61及其用途
阅读说明：本技术 高效促进丹参酮积累的基因SmWRKY61及其用途 (Gene SmWRKY61 for efficiently promoting accumulation of tanshinone and application thereof ) 是由 杨东风 梁宗锁 杜旭红 陈玥 张晓丹 王艳婷 王紫璇 于 2021-08-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种促进丹参酮积累的基因SmWRKY61,该基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所述。本发明还同时公开了基因SmWRKY61在促进丹参酮积累中的应用：促进隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA的积累。(The invention discloses a gene SmWRKY61 for promoting tanshinone accumulation, and the nucleotide sequence of the gene is shown in SEQ ID NO. 1. The invention also discloses an application of the gene SmWRKY61 in promoting accumulation of tanshinone: promoting the accumulation of cryptotanshinone, tanshinone I and tanshinone IIA.)
技术领域
本发明属于生物领域，特别涉及一种高效促进丹参酮积累的基因SmWRKY61及其用途。
背景技术
WRKY蛋白家族的名字来源于高度保守的60个氨基酸长的WRKY结构域，其在C末端含有新的锌指状基序。过表达AaWRKY1可以显著提高青蒿素的含量，SmWRKY1的过表达显着提高了SmDXS和SmDXR基因表达和丹参酮积累。但是促进效果仍然有待改善。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可以大幅促进丹参酮积累的SmWRKY基因及其用途。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种促进丹参酮积累的SmWRKY61基因，其核苷酸系列如SEQV ID NO:1所述。
本发明还同时提供了上述SmWRKY61的用途：促进(高效促进)丹参酮积累。
作为本发明的SmWRKY61的用途的改进：促进隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA的积累。
本发明通过转录组发现，绒毛鼠尾草和丹参中共有8个WRKY基因表达差异显著，其中SmWRKY61在转录组水平上表达量高达丹参的17.39倍，进一步的RT-PCR验证结果表明，WRKY61在绒毛鼠尾草中表达量是丹参的几千倍，为此，本发明采用基因过表达的方法研究了SmWRKY61对丹参酮积累的调控作用，结果发现SmWRKY61可以将丹参酮I的含量提高11.09倍，丹参酮IIA的含量提高。
本发明具有如下优势：
1、SmWRKY61促进隐丹参酮积累，从对照水平0提高到0.03mg/g；
2、SmWRKY61促进丹参酮I积累，提高约11倍；
3、SmWRKY61促进丹参酮IIA积累，提高约33倍。
综上所述，本发明利用基因过表达的方法发现了一个可以更加显著促进丹参酮I、丹参酮IIA和隐丹参酮积累的SmWRKY61。与现有已报到的WRKY42和WRKY1等基因的促进效果相比，本发明SmWRKY61的促进效果更强，对隐丹参酮、丹参酮IIA和丹参酮I含量的提高幅度更大。
附图说明
下面结合附图对本发明的
具体实施方式
作进一步详细说明。
图1是SmWRKY61基因的cDNA扩增电泳图；
图2是SmWRKY61的生物信息分析图；
图2中：
A为SmWRKY61蛋白序列；
B、C、D为SmWRKY氨基酸组成成分分析；
E为SmWRKY三级结构预测；
F为SmWRKY亚细胞定位。
图3SmWRKY61过表达丹参毛状根株系图；
图4SmWRKY61过表达毛状根鉴定电泳图；
图5转基因毛状根和野生丹参毛状根的次生代谢物含量图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实验材料：
1.1植物材料
以MS液体培养基中继代培养的丹参和绒毛鼠尾草毛状根为材料，精确称取0.2g毛状根接种到50mL MS液体培养基中，25℃、110rpm·min-1培养24天后待用。
1.2菌株、载体及引物
菌株：大肠杆菌DH5α和发根农杆菌ATCC15834。
载体：pMD19-T载体，中间载体为pDONR207、过表达载体为pK7WG2R。
实施例1、基因的克隆及分析
1、RNA的提取及cDNA的获得
RNA的提取参照多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(DP441)说明书进行。在Microtube中配置反应液，获得cDNA。
2、基因的克隆
(1)序列获得
以丹参毛状根cDNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系：PCR buffer 5μl，dNTPs 4μl，PrimerF 1μl，PrimerR 1μl，cDNA 2μl，Taq酶0.3μl，H2O 36.7μl。
PCR反应条件为：98℃10s，60℃5s，68℃1min，共33个循环。
(2)连接转化
①PCR产物电泳后，用手术刀对扩增获得的条带进行切割，利用Takara割胶回收试剂盒(6013)，按照说明书进行胶回收；
②加入感受态细胞ATCC15834发根农杆菌30μl，冰中放置30min；
③42℃加热45s后冰上放置2min；
④加适量LB培养基，37℃振荡培养4min；
⑤离心取上清，留200μl涂板。
(3)阳性克隆鉴定
菌斑清晰可见后进行挑斑，用无菌枪头挑取培养皿上单个菌斑，接种在LB培养基中，37℃，220rmp震荡摇菌240分钟，测序后确认attB-PCR产物。
SmWRKY61基因的克隆及生物信息分析结论：
以cDNA为模板扩增SmWRKY61的ORF区，扩增结果如图1所示。目的条带进行胶回收及连接pMD19-T载体，挑选单克隆摇菌，选取阳性克隆进行测序。测序后发现SmWRKY61全长507bp(SEQ ID NO:1)。预测编码它的蛋白质的分子量是19.15KD，等电点为8.774。它的二级结构和三级结构如图2所示。
SmWRKY61基因共编码168个氨基酸，其中S(丝氨酸)、K(赖氨酸)和E(谷氨酸)数量校多，亚细胞定位于细胞核。
实施例2、过表达载体的构建
1、BP反应
①、BP反应体系如下所示：
BP反应体系
②、25℃过夜连接。
③、加入Proteinase K终止反应。
④、加大肠杆菌DH5α转化后涂板，抗性为庆大霉素(100μg/ml)。
⑤、菌液PCR鉴定提质粒，得pDONR207-目的基因载体。
2、LR反应
①、LR反应体系如下所示。
LR反应体系
②、25℃过夜连接。
③、加入1μl Proteinase K，37℃10min。
④、加大肠杆菌DH5α转化后涂板，抗性为壮观霉素(100μg/ml)。
⑤、菌液PCR鉴定后提质粒。
3、目的基因过表达载体的转化
①.将丹参无菌苗叶片切成0.5cm2左右的小块，1/2MS培养基(即溶液中所有物质的含量为MS基本培养基的一半)培养2-4天；培养条件为25℃，光照强度3000LUX，每天光照12h；
②.将上述步骤2获得的菌液振荡至OD600＝0.4～0.6后去上清，加等体积1/2MS混匀；
③.步骤①培养所得的叶片浸入菌液中30min后取出，吸干叶片表面菌液，1/2MS固体培养基培养3～4天；培养条件同步骤①；
④.步骤③培养所得的叶片用无菌水冲洗，吸干水分，置于除菌培养基(即，加壮观霉素抗生素的1/2MS培养基)上培养；培养条件同步骤①；待毛状根长至拇指长度(即，约20mm长)，剪下在1/2MS固体培养基上单独培养至长满培养皿；培养条件同步骤①；所得为OSmWRKY61。
4、标准曲线和样品处理及HPLC条件，参考《杨东风.丹参酮生物合成调控机理及丹参与绒毛鼠尾草cDNA-AFLP分析研究[D].西北农林科技大学,2011》
设置了如下的实验组：
OSmWRKY61-1～OSmWRKY61-7，代表SmWRKY过表达菌株1-7。
CK:紫花丹参毛状根。
SmWRKY61转基因毛状根次生代谢物的含量分析如下：
为了分析SmWRKY61在次生代谢中作用，采用HPLC分析三种丹参酮(隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA)和3种丹酚酸(咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B)的含量。发现过表达SmWRKY61显著促进了迷迭香酸、丹参酮I和丹参酮IIA的积累。
具体检测数据如图5所述。
与对照相比，OSmWRKY61-6株系中迷迭香酸的含量提高了3.33倍(对照1.13mg.g-1，DW)，OSmWRKY61-4株系中丹参酮I的含量提高了11.09倍(对照0.01mg.g-1，DW)，OSmWRKY61-7株系中丹参酮IIA的含量提高了33.37倍(对照0.05mg.g-1，DW)。然而咖啡酸和丹酚酸B的含量变化不显著。上述结果表明，SmWRKY61对丹参酮和迷迭香酸积累调控作用较为明显，而对咖啡酸和丹酚酸B积累影响不显著。
本发明通过基因表达分析发现过表达SmWRKY61极显著提高了丹参酮I、隐丹参酮和丹参酮II含量。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江理工大学绍兴生物医药研究院有限公司
<120> 高效促进丹参酮积累的基因SmWRKY61及其用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 507
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggaaagcg agtatcttga gctgtacaaa tcagtggtta gtgagatcag caaagggatg 60
gagcaagtga aagagtgttg ttccaacaag gagcaagatg gattcttgga gagaatgttg 120
tcttcccatg aagaggctct attgattctt acggggcgtg ctccacaggg acaatgtcag 180
tcagggatat catcgttatc agatcctccc gactctccaa ctggatccaa agatgcaaga 240
agccgtttgt ggaaaaggga atactttaag agaagaaata aaattgtcaa gattgaggca 300
tcctctgatt ctgaactacc acacgaggat ggatatgctt ggaggaagta cggcaagaaa 360
gctatcctta atgccaaata tccaagaggc tattatagat gcattcagag taaaacttgt 420
ttggctaaaa aacgagtaca gaggtcagac gatgggactg tatttgaggt cacatacaaa 480
ggacagcata catgcccagg cctttag 507