一种控制三百草叶片颜色转变的基因ScPEL及其应用

文档序号：1932657 发布日期：2021-12-07 浏览：6次 >En<

阅读说明：本技术 一种控制三百草叶片颜色转变的基因ScPEL及其应用 (Gene ScPEL for controlling color conversion of three-hundred-grass leaves and application thereof ) 是由王月张艳梅陈闽卢瑞森刘佳薛佳宇范海云孙小芹于 2021-08-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种控制三百草叶片颜色转变的基因ScPEL及其应用。该基因CDS序列如SEQ ID NO.1所示。含有所述的基因ScPEL的重组表达载体。本发明所述的基因ScPEL在调节植物叶片颜色转变中的应用。本发明通过对不同颜色的三百草叶片进行转录组测序,筛选出了在白色苞片中特异性表达的基因PEL(Pseudo-etiolation in Light),将该基因在NCBI中进行同源性比对,未发现同源基因,提示ScPEL可能存在功能的特异性。通过设计引物克隆到基因ScPEL,CDS序列如SEQ ID NO.1所示,经功能验证发现该基能够控制三百草叶片颜色转变,为三白草中首次报道。(The invention discloses a gene ScPEL for controlling color conversion of three-hundred-grass leaves and application thereof. The CDS sequence of the gene is shown in SEQ ID NO. 1. A recombinant expression vector containing the gene ScPEL. The gene ScPEL is applied to the regulation of the color conversion of plant leaves. According to the invention, transcriptome sequencing is carried out on three hundred grass leaves with different colors, a gene PEL (Pseudo-methylation in Light) specifically expressed in white bracts is screened out, homology comparison is carried out on the gene in NCBI, no homologous gene is found, and the functional specificity of ScPEL is suggested to exist. The gene ScPEL is cloned by designing a primer, the CDS sequence is shown as SEQ ID NO.1, and the gene is found to be capable of controlling the color conversion of the leaves of the saururus chinensis by functional verification and is reported for the first time in saururus chinensis.)

技术领域

本发明属于基因领域，涉及一种控制三百草叶片颜色转变的基因ScPEL及其应用。

背景技术

三白草科(Saururaceae)是古草本类中的一个稳定成分，对研究被子植物起源和早期演化具有重要的意义(孟少武，2001；基于5.8s rDNA序列论三百草科的系统发育)。三白草Saururus chinensis(Lour.)Baill是三白草科三白草属植物，全草可入药，具有清热解毒、利尿消肿之功效。三白草处于花期时，茎端花序下的2-3片叶片，呈现白色。后随着生长时间的变化，叶片由白色转变为绿色。

控制叶片颜色转变的基因：植物叶色突变是植物在生长过程中叶色发生变化的现象，由叶绿素合成受阻或降解加快所引起(刘新亮等，2017)。高等植物叶绿素合成的前体是谷氨酸，该过程由30多个基因编码的18种关键酶参与(Tanaka and Tanaka,2006；Harpaz-Saad et al.,2007；Tanaka et al.,2011)。叶色突变的发生可能受叶绿素合成、叶绿体发育等因素的影响。研究表明，在叶绿素合成过程中，编码谷氨酰-tRNA合成酶(GluRS)基因表达量的下调，可降低烟草中叶绿素的含量，使烟草出现黄化的表型(Kim et al.,2005)；拟南芥镁原卟啉IX甲基转移酶(CHLM)基因功能缺失突变体中，叶绿体蛋白复合体含量降低，植株呈现白化表型(Pontier et al.,2007)。光形态建成过程的突变会影响叶绿体的发育，如光敏色素相互作用因子(PIFs)，可以调控相关基因的转录水平。研究表明，PIF3可以抑制叶绿素合成途径关键酶基因的表达，包括HEMA1(编码谷氨酸-tRNA还原酶)、GUN5(编码ChlH)及光合系统PSI中LHCA1、PsaE1等基因(Shin et al.,2009)。此外，蛋白质的转运与加工、类囊体分化及叶绿体分裂等也都可能影响叶绿体的发育(Kubis et al.,2004；Hooberet al.,2007；Okazaki et al.,2009)。目前，三百草基因组还没有公布，三百草苞片颜色转变的分子机制尚未得到阐述。因此，在三白草中是什么基因控制其叶片颜色的转化根据现有的报道还无法预测。

植物叶色突变的应用：大多数叶色黄化突变在植物生长初期就可以被发现，容易鉴别；黄化突变可以稳定遗传，非致死性的黄化突变可以作为标记形状，用于品种选育和遗传改良，可以有效缩短良种选育的周期。

参考文献：

[1]Harpaz-Saad S,Azoulay T,Arazi T,et al.Chlorophyllase Is a Rate-Limiting Enzyme in Chlorophyll Catabolism and Is PosttranslationallyRegulated[J].The Plant Cell,2007,19(3):1007-1022.

[2]Hoober J K,Eggink L L,Min C.Chlorophylls,ligands and assembly oflight-harvesting complexes in chloroplasts[J].Photosynthesis Research,2007,94(2):387-400.

[3]Kim Y K,Lee J Y,Cho H S,et al.Inactivation of Organellar Glutamyl-and Seryl-tRNA Synthetases Leads to Developmental Arrest of Chloroplasts andMitochondria in Higher Plants[J].Journal of Biological Chemistry,2005,280.

[4]Kubis,S.The Arabidopsis ppi1 Mutant Is Specifically Defective inthe Expression,Chloroplast Import,and Accumulation of Photosynthetic Proteins[J].The Plant Cell,2003,15(8):1859-1871.

[5]Okazaki K,Kabeya Y,Suzuki K,Mori T,Ichikawa T,Matsui M,NakanishiH,Miyagishima S.The PLASTID DIVISION1 and 2Components of the ChloroplastDivision Machinery Determine the Rate of Chloroplast Division in Land PlantCell Differentiation[J].THE PLANT CELL,2009.，21(6):1769-1780.

[6]Pontier D,Albrieux C,Joyard J,et al.Knock-out of the Mgprotoporphyrin IX methyltransferase gene in Arabidopsis:Effects onchloroplast development and on chloroplast-to-nucleus signaling[J].Journal ofBiological Chemistry,2007,82(4):2297-2304.

[7]Shin J,Kim K,Kang H,et al.Phytochromes promote seedling lightresponses by inhibiting four negatively-acting phytochrome-interactingfactors[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America,2009,106(18):7660-7665.

[8]Tanaka A,Tanaka R.Chlorophyll metabolism[J].Current Opinion inPlant Biology,2006,9(3):248-255.

[9]Tanaka R,Kobayashi K,Masuda T.Tetrapyrrole Metabolism inArabidopsis thaliana.[J].The Arabidopsis Book,2011,9(9):e0145.

[10]刘新亮,李先民,何小三,等.植物叶色黄化突变分子机理的研究进展[J].南方农业学报,2017(8).

[11]孟少武,李德铢,梁汉兴.基于5.8S rDNA序列论三白草科的系统发育[J].云南植物研究,2001(03):43-46.

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种控制三百草叶片颜色转变的基因ScPEL。

本发明的另一目的是提供含有该基因的重组表达载体。

本发明的又一目的是提供该基因、该重组表达载体的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种控制三百草叶片颜色转变的基因ScPEL，CDS序列如SEQ ID NO.1所示。

作为本发明的一种优选，所述的基因ScPEL，基因序列如SEQ ID NO.2所示。

含有所述的基因ScPEL的重组表达载体。

作为本发明的一种优选，所述的重组表达载体，所述的出发载体为pMDC83。

本发明所述的基因ScPEL在调节植物叶片颜色转变中的应用。

作为本发明的一种优选，所述的植物选自拟南芥或三白草。

本发明所述的重组表达载体在调节植物叶片颜色转变中的应用。

作为本发明的一种优选，所述的植物选自拟南芥或三白草。

有益效果：

本发明通过对不同颜色的三百草叶片进行转录组测序，筛选出了在白色苞片中特异性表达的基因PEL(Pseudo-etiolation in Light)，将该基因在NCBI中进行同源性比对，未发现同源基因，提示ScPEL可能存在功能的特异性。通过设计引物克隆到基因ScPEL，CDS序列如SEQ ID NO.1所示，为三白草中首次报道。

本发明将在三白草白色苞片中特异表达的基因ScPEL在拟南芥中进行异源表达，发现过表达ScPEL的拟南芥植株出现黄化的表型，和野生型植株相比，转ScPEL基因的拟南芥生长正常。叶绿素含量测试结果显示，和野生型植株相比，转ScPEL基因的拟南芥叶片中叶绿素含量出现显著降低。说明ScPEL可能是通过调控叶绿素含量的改变影响拟南芥叶片颜色的转变。

附图说明

图1目的片段TA克隆转化及鉴定过程

图2ScPEL序列单克隆测序比对结果

图3ScPEL-pMDC83重组质粒示意图

图4过表达ScPEL基因拟南芥阳性鉴定结果

图5过表达ScPEL基因拟南芥T₁代黄化表型

图6过表达ScPEL基因拟南芥T₂代黄化表型

图7过表达ScPEL基因拟南芥叶片的叶绿素含量测定

具体实施方式

实施例1

(1)TROZOL法提取三百草胞片RNA

1)取适量的三百草胞片放于经液氮预冷的研钵中，不断加入液氮进行研磨至粉末状，50-100mg粉末中加入1mL trozol。冰上放置5min。

2)4℃13000rpm离心5min，吸取上清到2.0mL离心管中。

3)加入200μL氯仿，震荡混匀后，室温静置5min。

4)4℃13000rpm离心15min，吸取上清到2.0mL离心管中。

5)吸取上清到新的离心管中，加入等体积的等体积的预冷的异丙醇，在-20℃放置10min。

6)4℃13000rpm离心10min。

7)弃掉上清，用75％无水乙醇清洗沉淀。

8)短暂吹干后，加入30μL RNAase free的H₂O进行溶解。

9)经琼脂糖胶检测后，将RNA样本保存于-80℃备用。

(2)RNA反转录

取1pg-500ng Total RNA，加4×gDNA wiper Mix 2μL，加RNase free ddH2O补至8μL；

42℃，2min，冰上放置3min；

在上述反应体系中加入2μL 5×qRT SuperMix II；

25℃,10min；50℃,30min；85℃,5min；

获得cDNA。

(3)目的片段PCR

使用高保真酶对目的片段进行扩增，PCR反应体系如下：Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.5μL，2×Phanta Max Buffer 12.5μL，dNTP Mix(10mM each)0.5μL，引物ScPEL-F1/R1(SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4，10μM)各0.8μL，以cDNA模板1μL，加水补至终体积25μL。高保真酶PCR扩增程序：95℃，预变性3min；95℃变性15s，48～62℃(根据梯度PCR结果选择)退火15s，72℃延伸30～120s(根据片段大小设置时间，2kb/min)，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。将扩增产物进行电泳、胶回收，具体操作参照胶回收试剂盒说明书进行(Gel Extraction Kit，CWBIO)。

(4)目的片段TA克隆

使用pEASY-Blunt Simple Cloning Kit、Trans-T1 Phage ResistantChemically Competent进行TA克隆。连接反应如下：Blunt Simple载体0.5μL，目的片段4.5μL；

用移液器轻轻吹吸混匀，25℃孵育连接15～30min，随后进行转化，转化及鉴定过程如图1所示。

琼脂糖凝胶电泳检测后，选取阳性克隆送至南京擎科生物有限公司进程测序。

(5)测序结果比对以及质粒提取

使用DNAMAN软件对返回的测序结果与前期经转录组测序预测的ScPEL的CDS序列(SC004_1478.1)进行比对分析，比对结果如下：P-6为测序正确的单克隆。

选取测序结果正确的单克隆，扩摇菌液，用质粒抽提试剂盒提取质粒备用，具有方法参照试剂盒说明书。

实施例2ScPEL基因的功能验证

(1)同源重组引物设计

植物表达载体为带有GFP标签的pMDC83，同源重组引物序列为：

ScPEL-F(重组):AGGACCTCGACTCTAGAACTAGTATGGCCGGGTCCTCTGC(SEQ ID NO.5)

ScPEL-R(重组):CCCCCCCTCGAGGCGCGCCAACTCTCGGAATCTCTTG(SEQ ID NO.6)

(2)同源重组载体构建

1)重组引物扩增

以上述测序正确的含有目的基因的质粒为模板，ScPEL-F(重组)和ScPEL-R(重组)为引物，使用高保真酶进行PCR，体系参考实施例1的(3)；将PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳检测后回收，扩增产物序列如SEQ ID NO.7所示。

2)目的载体线性化

pMDC83载体线性化使用的酶切位点为Asc I和Spe I，酶切体系为：质粒10μL，AscI和Spe I各1μL，Cutsmart 2.5μL，加水补至25μL。37℃水浴条件下，反应2h。将线性化的载体经过琼脂糖凝胶电泳检测后回收。

3)同源重组

同源重组使用的试剂为擎科Trelief^TMSoSoo Cloning Kit，反应体系为：线性化载体1μL，目的片段4μL，2×SoSoo Mix 5μL；50℃下反应15min。

4)转化及鉴定

过程参照实施例1的(4)。重组后的载体示意图如图3。

(3)农杆菌转化

挑选阳性克隆进行农杆菌转化，农杆菌感受态为GV3101，农杆菌转化过程如下：

1)取-80℃保存的农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。

2)每100μL感受态加入0.01-1μg质粒DNA(转化效率较高，第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量)，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min。

3)加入700μL无抗生素的LB或YEB液体培养基，于28℃振荡培养2～3小时。

4)6000rpm离心一分钟收菌，留取100μL左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。

5)阳性单菌落PCR鉴定及菌液保存。

(4)拟南芥侵染

1)挑取上述单菌落或是用保存的甘油菌菌液，放于8mL左右的LB(+)培养基中，28℃过夜摇至菌液OD＝0.8(0.7-0.9都没问题)；

2)5000rpm 10min集菌，用悬浮液重悬，调OD至2.4-2.6；

3)用枪头吸取液体，侵染拟南芥。

悬浮液配方：20mL

MS	0.043g
		蔗糖	1g
Silwet 77	3μl

注：1.用NaOH调pH值至5.8；

2.每隔一周，侵染一次，侵染2-3次

(5)拟南芥阳性植株筛选及表型鉴定

1)将侵染后收获的拟南芥种子，在37℃恒温箱中烘干；

2)将拟南芥种子灭菌后(75％乙醇1min；次氯酸钠)，播种到含有25mg/L潮霉素的1/2MS培养基上，培养14d；

3)将在筛选培养基上能够生根的小苗，转移到营养土中继续生长。

4)一周后，提取移栽小苗叶片的DNA，进行阳性鉴定。鉴定结果如图4所示。

5)收取单株阳性植株的种子，即T₁代种子，T1代黄化表型如图5所示，较之野生型呈现深绿色，T1代阳性植株呈现淡绿偏黄色的表型。

(6)转基因后代表型观察

1)将上述T₁代种子灭菌后，播种到1/2MS培养基上，对T₂代幼苗期的转基因后代进行观察，T₁代种子萌发的T₂代小苗中，有部分阴性植株(颜色呈现深绿色，与野生型拟南芥表型一致)，而大部分小苗，颜色呈现淡绿色，经PCR阳性鉴定后确定为阳性植株(图6)。

(7)转基因后代叶绿素含量测定(参考Lolle et al.,1998)

1)称取0.1g(FW)拟南芥叶片，加入20mL 80％乙醇中，室温放置24h；

2)用分光光度计测定其在664nm和647nm波长下的吸光值；

3)计算叶绿素浸提量，公式为：

叶绿素浸提量(mmol.g^-1)＝7.93*A₆₆₄+19.53*A₆₄₇

4)叶绿素含量测定结果如图7所示，转基因后代不同Line中叶片含量均显著低于野生型材料。

序列表

<110> 江苏省中国科学院植物研究所

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<160> 7

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<212> DNA

<213> 三白草(Saururus chinensis (Lour.) Baill)

<400> 1

atggccgggt cctctgcttc ctatatacac atggtacaac atctgattga agagtgcctg 60

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aagatgagcc cgggatcttc aagagattcc gagagttag 279

<210> 2

<211> 898

<212> DNA

<213> 三白草(Saururus chinensis (Lour.) Baill)

<400> 2

gcaaggctct attgcttgac gtaggcccca aatctaagtg tataaatctc cacagactgg 60

gttttgggtt gcatgttcct gttcctcccc ccattcgacc caaatcaaag tagtattcct 120

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gactgctgcc tctagcttcc tcttttcatc ttgactatgt gtgaagtagt agcgctgagt 540

gttgttggtc accaccagtg tggcaagagc tggagaagga gaacagagag ttcttccaag 600

cttacaagct gcgcagagag gagcgaaggt ttgagaagga gacaagggac ggagcactga 660

agatgagccc gggatcttca agagattccg agagttagaa tctgaaagag acagaagatc 720

gcaagctgat gatggtgacg cacatataca cagatgggca gaattccaac ctccacggtc 780

agccaaatag tagtatatat tctgaaaaat atgtagtatc aatcctacaa acgagtttca 840

gttgtggcgt tgtgtgcaag tactggaacg aggaaggctg gctatgcttc catttcat 898

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<211> 19

<212> DNA