具体实施方式

以下将通过具体实施方式对本发明进行详细说明，但本发明的内容不限于此。

以下实施例中，如无特别说明，使用的试剂和仪器都是本领域常规试剂和仪器，可以通过商购的方式获得；使用的实验方法也为本领域常规方法，本领域技术人员根据实施例的内容可以毫无疑问地实施所述方案并获得相应的结果。

实施例1：锰型高稳定性超氧化物歧化酶(MS-SOD)的制备

以嗜热菌HB27(购自美国ATCC细胞库，保藏编号为ATCC BAA-163)的基因组为模板，以如下引物序列进行扩增得到目的基因：正向引物：5’-aagaattcatgccgtacccgttcaagct-3’(SEQ ID NO.1)反向引物：5’-ctgtcgactcaggctttgttgaagaac-3’(SEQ ID NO.2)；用回收试剂盒(购自生工生物工程上海(股份)有限公司)回收扩增产物，用酶EcoRI和SalI双酶切，并连接到用同样酶双酶切的质粒载体pET28a(+)(购自生工生物工程上海(股份)有限公司)中，将重组质粒转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)(购自生工生物工程上海(股份)有限公司)，通过测序筛选MS-SOD核苷酸序列正确的菌株，培养该菌株，得到MS-SOD蛋白。其中，MS-SOD编码基因的核苷酸序列为：

atgccgtacccgttcaagcttcctgacctaggctacccctacgaggccctcgagccccacattgacgccaagaccatggagatccaccaccagaagcaccacggggcctacgtgacgaacctcaacgccgccctggagaagtacccctacctccacggggtggaggtggaggtcctcctgaggcacctcgccgcccttccccaggacatccagaccgccgtgcgcaacaacgggggcgggcacctgaaccacagcctcttctggaggctcctcacccccgggggggccaaggagcccgtgggggagctgaagaaggccattgacgagcagttcgggggcttccaggccctcaaggagaagctcacccaggcggccatgggccggttcggctcgggctgggcctggctcgtgaaggaccccttcggcaagctccacgtcctctccacccccaaccaagacaaccccgtgatggagggcttcacccccatcgtgggcattgacgtctgggagcacgcctactacctcaagtaccagaaccgccgggccgattacctccaggccatctggaacgtcctcaactgggacgtggccgaggagttcttcaataaagcctga(SEQ ID NO.3)。

MS-SOD的氨基酸序列为：

MPYPFKLPDLGYPYEALEPHIDAKTMEIHHQKHHGAYVTNLNAALEKYPYLHGVEVEVLLRHLAALPQDIQTAVRNNGGGHLNHSLFWRLLTPGGAKEPVGELKKAIDEQFGGFQALKEKLTQAAMGRFGSGWAWLVKDPFGKLHVLSTPNQDNPVMEGFTPIVGIDVWEHAYYLKYQNRRADYLQAIWNVLNWDVAEEFFKKA(SEQ ID NO.4)。

实施例2：小鼠实验

1、动物模型：

1)TBC1D1^S231A突变型小鼠：来自南京大学模式动物研究中心。

该动物模型是以基因敲入方式将小鼠TBC1D1蛋白第231位的丝氨酸突变为丙氨酸，小鼠随年龄的增长发生肥胖，老龄时出现严重的高胆固醇、高血糖、高胰岛素、胰岛素抵抗和非酒精性脂肪肝等代谢综合症。

2)野生型小鼠：来自南京大学模式动物研究中心。

本实施例研究MS-SOD对TBC1D1^S231A突变小鼠糖代谢的影响。

2、分组方法：

按照不同的MS-SOD干预方式对小鼠进行分组：

(1)野生对照组(WT)：野生型小鼠8只；

(2)野生+MS-SOD组(WT-MS-SOD)：为野生型小鼠添加喂养MS-SOD，其中8只每天灌胃MS-SOD 150U/10g体重，8只灌胃MS-SOD 300U/10g体重；

(3)突变对照组(KI)：为TBC1D1^S231A基因敲入小鼠，8只；

(4)突变+MS-SOD组(KI-MS-SOD)：为突变型小鼠添加喂养MS-SOD，其中8只每天灌胃MS-SOD150U/10g体重，8只每天灌胃MS-SOD 300U/10g体重。

3、处理方法：

1)体重测定：

将野生型小鼠和突变型小鼠正常饮食饲养至9个月后，8只灌胃MS-SOD(每天150U/10g体重)，8只灌胃MS-SOD(每天300U/10g体重)，8只不添加MS-SOD，作为对照，至17个月。记录每个月小鼠体重的变化。至第18个月，杀死小鼠。

2)葡萄糖耐受实验(OGTT)：

至第九个月，小鼠过夜饥饿16小时后，对其进行葡萄糖(1.5mg/g体重)灌胃，分别在灌胃葡萄糖后0分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟和120分钟取小鼠的尾静脉血检测基础血糖。采用血糖仪(Bayer Breeze 2glucomete)进行血糖测定。

3)胰岛素抵抗实验(ITT)：

至第九个月，小鼠禁食4小时，腹腔注射胰岛素(0.75mU/g体重)，分别在注射胰岛素后0分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟和120分钟时取小鼠尾静脉血检测基础血糖，采用血糖仪(Bayer Breeze 2glucomete)进行血糖测定。

4)脂肪和瘦肉含量测定：

至第九个月，利用PIXImus II densitometer(GE Healthcare)仪器，按照Dual-Energy X-ray Absorptiometry(DEXA)的测定方法。具体地，根据小鼠体重，使用甲苯噻嗪/氯胺酮(10μl/g)使小鼠麻醉(甲苯噻嗪使用浓度为1mg/ml，氯胺酮使用浓度为10mg/ml)。度量体长，用PIXImus II densitometer软件对骨密度图片进行分析全身的脂肪重量、全身的瘦肉重量。

4、实验结果：

1)突变型小鼠与野生型小鼠表型差异

随着小鼠月龄的增长，突变型小鼠(KI和KI-MS-SOD)体重较野生型小鼠(WT和WT-MS-SOD)体重显著升高(图1)。通过测量小鼠全身脂肪和瘦肉含量可以发现，突变型小鼠体重的增加主要来自于脂肪含量的增加(图2)。同时，在9月龄鼠中，突变型小鼠出现严重的葡萄糖不耐受(图3)和胰岛素抵抗(图4)。从表型上看，突变型小鼠具有明显的糖尿病代谢综合征。

从第九个月开始，对KI-MS-SOD组和WT-MS-SOD组小鼠添加喂养MS-SOD(每天300U/10g体重)。从第十一个月开始，两组喂食MS-SOD的小鼠体重较对照组和模型组均有显著下降。说明MS-SOD可降低小鼠的体重。至第17个月，KI-SOD组小鼠体重接近正常对照组(图1)。

2)口服MS-SOD对小鼠血糖和胰岛素的影响

取小鼠静脉血测定血糖(第18个月)，与野生型小鼠相比，突变型小鼠具有明显的糖尿病症状，血糖达到7.5mmol/L(图5A，KI)，胰岛素达到6.5ng/mL(图5B，KI)，HOMA-IR达到45(图5C，KI)。而无论是野生型小鼠还是突变型小鼠，口服MS-SOD后，血糖和胰岛素含量(胰岛素含量采用小鼠胰岛素酶联免疫检测试剂盒(密理博)测定)均显著下降。突变型小鼠喂养后血糖和胰岛素水平甚至达到对照组水平。可见口服MS-SOD对于降低血糖和胰岛素的水平具有显著的作用。

胰岛素抵抗实验也表明(图6)，在口服MS-SOD后，显著提高了小鼠胰岛素的敏感性，这也说明小鼠血糖的控制更加有效。

序列表

<110> 凯睿恒济生物医药（杭州）有限公司

<120> 锰型高稳定性超氧化物歧化酶在糖尿病预防或治疗中的应用

<130> DSP1F200879JW

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagaattcat gccgtacccg ttcaagct 28

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgtcgactc aggctttgtt gaagaac 27

<210> 3

<211> 615

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgccgtacc cgttcaagct tcctgaccta ggctacccct acgaggccct cgagccccac 60

attgacgcca agaccatgga gatccaccac cagaagcacc acggggccta cgtgacgaac 120

ctcaacgccg ccctggagaa gtacccctac ctccacgggg tggaggtgga ggtcctcctg 180

aggcacctcg ccgcccttcc ccaggacatc cagaccgccg tgcgcaacaa cgggggcggg 240

cacctgaacc acagcctctt ctggaggctc ctcacccccg ggggggccaa ggagcccgtg 300

ggggagctga agaaggccat tgacgagcag ttcgggggct tccaggccct caaggagaag 360

ctcacccagg cggccatggg ccggttcggc tcgggctggg cctggctcgt gaaggacccc 420

ttcggcaagc tccacgtcct ctccaccccc aaccaagaca accccgtgat ggagggcttc 480

acccccatcg tgggcattga cgtctgggag cacgcctact acctcaagta ccagaaccgc 540

cgggccgatt acctccaggc catctggaac gtcctcaact gggacgtggc cgaggagttc 600

ttcaataaag cctga 615

<210> 4

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Pro Tyr Pro Phe Lys Leu Pro Asp Leu Gly Tyr Pro Tyr Glu Ala

1 5 10 15

Leu Glu Pro His Ile Asp Ala Lys Thr Met Glu Ile His His Gln Lys

20 25 30

His His Gly Ala Tyr Val Thr Asn Leu Asn Ala Ala Leu Glu Lys Tyr

35 40 45

Pro Tyr Leu His Gly Val Glu Val Glu Val Leu Leu Arg His Leu Ala

50 55 60

Ala Leu Pro Gln Asp Ile Gln Thr Ala Val Arg Asn Asn Gly Gly Gly

65 70 75 80

His Leu Asn His Ser Leu Phe Trp Arg Leu Leu Thr Pro Gly Gly Ala

85 90 95

Lys Glu Pro Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Asp Glu Gln Phe Gly

100 105 110

Gly Phe Gln Ala Leu Lys Glu Lys Leu Thr Gln Ala Ala Met Gly Arg

115 120 125

Phe Gly Ser Gly Trp Ala Trp Leu Val Lys Asp Pro Phe Gly Lys Leu

130 135 140

His Val Leu Ser Thr Pro Asn Gln Asp Asn Pro Val Met Glu Gly Phe

145 150 155 160

Thr Pro Ile Val Gly Ile Asp Val Trp Glu His Ala Tyr Tyr Leu Lys

165 170 175

Tyr Gln Asn Arg Arg Ala Asp Tyr Leu Gln Ala Ile Trp Asn Val Leu

180 185 190

Asn Trp Asp Val Ala Glu Glu Phe Phe Lys Lys Ala

195 200