抗肿瘤治疗的方法

文档序号：310044 发布日期：2021-11-26 浏览：64次 >En<

阅读说明：本技术 抗肿瘤治疗的方法 (Method of antitumor therapy ) 是由塔马·拉赫米尔维茨·米内伊伊扎克·门德尔尼瓦·雅各布埃亚勒·布赖特巴特于 2020-04-13 设计创作，主要内容包括：本公开提供了治疗有需要的受试者的肿瘤的方法,包括向受试者施用有效剂量的载体和有效剂量的免疫检查点抑制剂的组合,所述载体包含与内皮细胞特异性启动子可操作地连接的Fas-嵌合体基因。在本公开的一些方面,免疫检查点抑制剂是PD-1拮抗剂或PD-L1拮抗剂。(The present disclosure provides a method of treating a tumor in a subject in need thereof comprising administering to the subject an effective dose of a combination of a vector comprising a Fas-chimera gene operably linked to an endothelial cell specific promoter and an effective dose of an immune checkpoint inhibitor. In some aspects of the disclosure, the immune checkpoint inhibitor is a PD-1 antagonist or a PD-L1 antagonist.)

抗肿瘤治疗的方法

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相关申请的引用

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背景技术

血管生成是几种病理的共同主要特征。这些疾病中有血管生成可改善疾病状况的疾病(诸如缺血性心脏病)和其中过度血管生成是病理的一部分因而应该被消除的疾病。这些后者疾病包括糖尿病(糖尿病性视网膜病变)、心血管疾病(动脉粥样硬化)、慢性炎症(类风湿性关节炎)和癌症。血管生成发生在肿瘤中，并允许其生长、侵袭和转移。在1971年，Folkman提出肿瘤生长和转移是血管生成依赖性的，因此抑制血管生成可以作为阻止肿瘤生长的策略。

有几种分子，从转录因子到生长因子，参与血管生成。缺氧是导致新血管形成的重要环境因素，并且其诱导作为促血管生成因子的几种细胞因子的释放。其中包括血管内皮生长因子(VEGF)及其受体、血管生成素家族成员、碱性成纤维细胞生长因子和内皮素-1(ET-1)。这些因子通过内皮细胞的活化、增殖和迁移参与血管生成的诱导。

内源性血管生成抑制剂的重组形式经测试用于癌症的治疗。这些重组抑制剂的长期递送的潜在药代动力学、生物技术和经济缺陷促使科学家们开发其他方法。

抗VEGF单克隆抗体贝伐单抗的开发已将抗血管生成的方法验证为化疗的补充治疗方式。几种小分子抑制剂，包括第二代多靶向酪氨酸激酶抑制剂，也显示出作为癌症的抗血管生成剂的前景。

免疫检查点也在肿瘤生长和发展中起作用。例如，通过受体/配体相互作用自然刺激免疫检查点，肿瘤细胞能够避开宿主免疫系统。因此，检测阻断免疫检查点的分子(例如免疫检查点抑制剂)用于癌症的治疗。然而，这些抑制剂仅在只有少数几种类型肿瘤的受试者中起作用。此外，受试者对免疫检查点治疗的反应通常伴随着复发和疾病进展。

重组抑制剂、抗体和小分子的长期递送的潜在药代动力学和经济缺陷，以及当作为单疗法应用时表现出的有限活性，促使科学家们评价基因治疗。然而，有许多障碍限制了成功的基因治疗，包括表达的持续时间、免疫反应的诱导、载体的细胞毒性和组织特异性。提出了用于癌症基因治疗的两种一般策略：肿瘤导向或系统性基因治疗。通过系统性治疗将基因治疗产品靶向癌细胞或其环境缺乏成功，导致大多数治疗被施用于肿瘤自身。

发明内容

本公开还提供了一种减少或抑制有需要的受试者的肿瘤尺寸或消除肿瘤的方法，所述方法包括：(a)向受试者施用有效剂量的载体，所述载体包含与内皮细胞特异性启动子可操作地连接的Fas-嵌合体基因；以及(b)向受试者施用有效剂量的免疫检查点抑制剂。本公开还提供了一种治疗有需要的受试者的肿瘤或其转移的方法，所述方法包括：(a)向受试者施用有效剂量的载体，所述载体包含与内皮细胞特异性启动子可操作地连接的Fas-嵌合体基因；以及(b)向受试者施用有效剂量的免疫检查点抑制剂。本公开还提供了一种在患有肿瘤的受试者中诱导或改善T细胞活化的方法，所述方法包括：(a)向受试者施用有效剂量的载体，所述载体包含与内皮细胞特异性启动子可操作地连接的Fas-嵌合体基因；以及(b)向受试者施用有效剂量的免疫检查点抑制剂。本公开还提供了一种在患有肿瘤的受试者中诱导或改善免疫检查点抑制剂的疗效的方法，所述方法包括：(a)向受试者施用有效剂量的载体，所述载体包含与内皮细胞特异性启动子可操作地连接的Fas-嵌合体基因；以及(b)向受试者施用有效剂量的免疫检查点抑制剂。本公开还提供了一种将有需要的受试者的冷肿瘤转化为热肿瘤的方法，所述方法包括：(a)向受试者施用有效剂量的载体，所述载体包含与内皮细胞特异性启动子可操作地连接的Fas-嵌合体基因；以及(b)向受试者施用有效剂量的免疫检查点抑制剂。

在一些方面，肿瘤来源于以下各项或与以下各项相关：白血病、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、原发性脑肿瘤(包括多形胶质母细胞瘤)、胃肠(GI)癌(包括但不限于食道、胆囊、胆道、肝脏、胰腺、胃、小肠、大肠、结肠、直肠和肛门的癌)、恶性胰腺岛瘤、恶性类癌、膀胱癌、癌前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、乳头状甲状腺癌、神经母细胞瘤、神经内分泌癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、前列腺癌、苗勒氏癌、卵巢癌、腹膜癌、输卵管癌或子宫乳头状浆液性癌。

在一些方面，Fas嵌合体基因编码以下多肽，所述多肽包含与Fas多肽的跨膜结构域和细胞内结构域融合的TNF受体1(TNFR1)多肽的细胞外结构域。在一些方面，TNFR1的细胞外结构域包含与SEQ ID NO:4具有至少约70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中TNFR1的细胞外结构域能够结合TNF-α。在一些方面，Fas多肽的跨膜结构域和细胞内结构域包含与SEQ ID NO:8具有至少约70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中Fas多肽的跨膜结构域和细胞内结构域能够诱导Fas介导的细胞凋亡。在一些方面，Fas-嵌合体基因包含第一核苷酸序列，其与SEQ ID NO:3具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；以及第二核苷酸序列，其与SEQ ID NO:7具有至少约70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。

在本公开的一些方面，内皮细胞特异性启动子包含PPE-1启动子。在一些方面，内皮细胞特异性启动子还包含顺式作用调控元件。在一些方面，顺式作用调控元件包含与SEQID NO:15或SEQ ID NO:16具有至少约70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，顺式作用调控元件包含SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:12。在一些方面，顺式作用调控元件还包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14。

在本公开的一些方面，内皮细胞特异性启动子是PPE-1-3X启动子。在一些方面，PPE-1-3X启动子包含与SEQ ID NO:18具有至少约70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列，其中PPE-1-3X启动子能够在内皮细胞中指导Fas嵌合体基因表达。

在一些方面，以约1×10¹⁰至约1×10¹⁶、约1×10¹¹至约1×10¹⁵、约1×10¹¹至约1×10¹⁶、约1×10¹²至约1×10¹⁵、约1×10¹²至约1×10¹⁶、约1×10¹²至约1×10¹⁴、约5×10¹²至约1×10¹⁶、约5×10¹²至约1×10¹⁵、约5×10¹²至约1×10¹⁴、约1×10¹²至约1×10¹³，或约1×10¹³至约1×10¹⁴个病毒颗粒的量施用载体的有效剂量。在一些方面，以约1×10¹⁶、1×10¹⁵、1×10¹⁴、5×10¹³、4×10¹³、3×10¹³、2×10¹³、1×10¹³、9×10¹²、8×10¹²、7×10¹²、6×10¹²、5×10¹²、4×10¹²、3×10¹²、2×10¹²、1×10¹²、9×10¹¹、8×10¹¹、7×10¹¹、6×10¹¹、5×10¹¹、4×10¹¹、3×10¹¹、2×10¹¹、1×10¹¹、9×10¹⁰、8×10¹⁰、7×10¹⁰、6×10¹⁰、5×10¹⁰、4×10¹⁰、3×10¹⁰、2×10¹⁰或1×10¹⁰个病毒颗粒的量施用载体的有效剂量。

在本公开的一些方面，按顺序施用载体和免疫检查点抑制剂。在一些方面，在施用免疫检查点抑制剂之前施用载体。在一个特定方面，在施用免疫检查点抑制剂之前施用载体，并且在肿瘤进展时施用免疫检查点抑制剂。在其他方面，在施用载体之前施用免疫检查点抑制剂。

在一些方面，重复施用载体。在一些方面，每天、约2天一次、约3天一次、约4天一次、约5天一次、约6天一次、约7天一次、约2周一次、约3周一次、约4周一次、约5周一次、约6周一次、约7周一次、约2个月一次或约6个月一次重复施用载体。

在本公开的一些方面，重复施用免疫检查点抑制剂。在一些方面，约7天一次、约2周一次、约3周一次、约4周一次、约2个月一次、约3个月一次、约4个月一次、约5个月一次或约6个月一次重复施用免疫检查点抑制剂。

在本公开的一些方面，免疫检查点抑制剂是PD-1拮抗剂。在一些方面，以小于约15mg/kg、小于约14mg/kg、小于约13mg/kg、小于约12mg/kg、小于约11mg/kg、小于约10mg/kg、小于约9mg/kg、小于约8mg/kg、小于约7mg/kg、小于约6mg/kg、小于约5mg/kg、小于约4mg/kg、小于约3mg/kg、小于约2mg/kg或小于约1mg/kg的有效量施用PD-1拮抗剂。在其他方面，以约100mg至约600mg、约120mg至约500mg、约140mg至约460mg、约180mg至约420mg、约200mg至约380mg、约220mg至约340mg、约230mg至约300mg，或约230mg至约260mg固定剂量的有效量施用PD-1拮抗剂。在一些方面、以约400mg至约600mg、约450mg至约520mg、约460mg至约510mg，或约470mg至约500mg固定剂量的有效量施用PD-1拮抗剂。在一些方面，以约60mg、约80mg、约100mg、约120mg、约140mg、约160mg、约180mg、约200mg、约220mg、约240mg、约260mg、约280mg、约300mg、约320mg、约340mg、约360mg、约380mg、约400mg、约420mg、约440mg、约460mg、约480mg、约500mg、约520mg、约540mg、约560mg、约580mg或约600mg固定剂量的有效量施用PD-1拮抗剂。

在特定方面，PD-1拮抗剂是结合PD-1的抗体。在一些方面，抗体是单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体或嵌合抗体。在更具体的方面，抗体选自纳武单抗、派姆单抗、卡瑞利珠单抗(camrelizumab)、西米普利单抗、信迪利单抗和PDR001。在一个具体方面，PD-1拮抗剂是纳武单抗。

在本公开的一些方面，以3×10¹²至3×10¹³个病毒颗粒的有效量施用载体，并且以2mg/kg至12mg/kg的有效量施用纳武单抗。在其他方面，以3×10¹²至3×10¹³个病毒颗粒的有效量施用载体，并且以460mg至500mg的固定剂量施用纳武单抗。

在一些方面，每2个月施用一次载体并且每2周施用一次纳武单抗。在其他方面，每2个月施用一次载体并且每2个月施用一次纳武单抗。在一些方面，在每次施用载体一个月后施用纳武单抗。

在本公开的一些方面，PD-1拮抗剂是结合PD-L1的抗体。在一些方面，抗体是单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体或嵌合抗体。在特定方面，抗体选自阿替利珠单抗、阿维单抗、德瓦鲁单抗和BMS-936559。

本公开的一些方面包括向受试者进一步施用有效剂量的一种或多种化疗剂。在一些方面，一种或多种化学治疗剂选自：阿西维辛、阿柔比星、盐酸阿考达唑、阿克罗宁、阿霉素、阿多来新、阿地白介素、爱宁达、六甲蜜胺、安波霉素、醋酸阿美蒽醌、氨鲁米特、安吖啶、阿那曲唑、氨茴霉素、天冬酰胺酶、曲林菌素、阿扎胞苷、阿扎替派、阿佐霉素、巴马司他、苯佐替派、比卡鲁胺、盐酸比生群、二甲磺酸双奈法德、贝伐单抗、比折来新、硫酸博来霉素、布喹那钠、溴匹立明、白消安、放线菌素、卡鲁睾酮、卡醋胺、卡贝替姆、卡铂、卡莫司汀(BiCNU)、盐酸卡柔比星、卡折来新、西地芬戈、苯丁酸氮芥、西罗霉素、顺铂、克拉屈滨、甲磺酸克立那托、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、盐酸柔红霉素、地西他滨、右奥马铂、地扎呱宁、甲磺酸地扎呱宁、地吖醌、多西他赛、多柔比星、盐酸多柔比星、屈洛昔芬、柠檬酸屈洛昔芬、丙酸屈他雄酮、达佐霉素、依达曲沙、盐酸依氟鸟氨酸、依沙芦星、恩洛铂、恩普氨酯、依匹哌啶、盐酸表柔比星、厄布洛唑、盐酸依索比星、雌莫司汀、雌莫司汀磷酸钠、依他硝唑、依托泊苷、磷酸依托泊苷、艾托卜宁、盐酸法倔唑、法扎拉滨、芬维A胺、氟尿苷、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟西他滨、磷喹酮、福司曲星钠、吉西他滨、盐酸吉西他滨、片、羟基脲、盐酸伊达比星、异环磷酰胺、伊莫福新、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-nl、干扰素α-n3、干扰素β-Ia、干扰素γ-Ib、异丙铂、盐酸伊立替康、醋酸兰瑞肽、来曲唑、醋酸亮丙瑞林、盐酸利阿唑、洛美曲索钠、洛莫司汀(CCNU)、盐酸洛索蒽醌、马索罗酚、美登素、盐酸氮芥、醋酸甲地孕酮、醋酸美仑孕酮、美法仑、美诺立尔、巯嘌呤、甲氨喋呤、甲氨喋呤钠、氯苯氨啶、美妥替哌、米丁度胺、米托凯星、丝裂红素、丝裂菌褶素、米托马星、丝裂霉素、米托司培、米托坦、盐酸米托蒽醌、麦考酚酸、诺考达唑、诺拉霉素、奥马铂、奥昔舒仑、帕唑帕尼(pazotinib)、紫杉醇、培门冬酶、培利霉素、戊氮芥、硫酸培洛霉素、过磷酰胺、哌泊溴烷、哌泊舒凡、盐酸吡罗蒽醌、普卡霉素、普洛美坦、卟吩姆钠、泊非霉素、泼尼莫司汀、盐酸丙卡巴肼、嘌罗霉素、盐酸嘌罗霉素、吡唑呋喃菌素、利波腺苷、罗谷亚胺、沙芬戈、盐酸沙芬戈、司莫司汀、辛曲秦、索拉非尼、司巴膦酸钠、司帕霉素、盐酸锗螺胺、螺莫斯汀、螺铂、绛色霉素、链佐星、磺氯苯脲、舒尼替尼、他利霉索、紫杉酚、替可加兰钠(tecogalan sodium)、替加氟、盐酸替洛蒽醌、替莫泊芬、替莫唑胺、替尼泊苷、替罗昔隆、睾内酯、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、噻替派、噻唑呋林(Tiazofuirin)、替拉扎明、盐酸拓扑替康、柠檬酸托瑞米芬、醋酸曲托龙、磷酸曲西立滨、三甲曲沙、三甲曲沙葡萄糖醛酯、曲普瑞林、盐酸妥布氯唑、尿嘧啶氮芥、乌瑞替派、伐普肽、维替泊芬、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、长春地辛、硫酸长春地辛、硫酸长春匹定、硫酸长春甘酯、硫酸环氧长春碱、酒石酸长春瑞滨、硫酸长春罗定、硫酸长春利定、伏氯唑、折尼铂(Zeniplatin)、净司他丁和盐酸佐柔比星。

在本公开的特定方面，载体包含SEQ ID NO:19、由SEQ ID NO:19组成，或基本上由SEQ ID NO:19组成。在一些方面，载体是具有欧洲动物细胞保藏中心(ECACC)登录号13021201的分离的病毒。

附图说明

图1显示了抗PD-L1抗体和AD5-PPE-1-3X-Fas-c载体VB-111联合治疗的研究设计。3天驯化：使小鼠在疾病诱导前在其笼中驯化3天；疾病诱导：将小鼠足垫接种D122细胞(转移性肺肿瘤模型)，并监测肿瘤生长直至肿瘤达到7mm³；切断术第0天：当肿瘤达到目标大小时，通过切断术切除肿瘤，开始“第0天”；VB-111I.V：肿瘤切断术5天后，用静脉注射VB-111载体处理小鼠；抗PD-L1抗体：对一些小鼠组，在第5、8和11天腹膜内施用抗PD-L1抗体，而在第5天静脉内施用VB-111。

图2显示了用生理盐水(对照)、单独的VB-111(1×10¹¹或1×10⁹个病毒颗粒)、单独的抗PD-L1抗体(200μg)，或VB-111(1×10¹¹个病毒颗粒)与抗PD-L1抗体(200μg)联合处理后的小鼠肺重量(克)；

图3显示了用生理盐水(对照)、单独的VB-111(1×10¹¹或1×10⁹个病毒颗粒)、单独的抗PD-L1抗体(200μg)，或VB-111(1×10¹¹个病毒颗粒)与抗PD-L1抗体(200μg)联合处理后的小鼠肺肿瘤负荷(克)。

图4显示了用生理盐水(正方形)、以1×10¹¹个病毒颗粒使用的单独的VB-111(圆形)、200μg单独的抗PD-L1抗体(三角形)，或以1×10¹¹个病毒颗粒使用的VB-111与200μg抗PD-L1抗体联合(星形)处理后的小鼠黑素瘤肿瘤尺寸(mm³)。箭头指示治疗第9、12和14天。I.V.静脉内；I.P.腹膜内。

图5显示了VB-111治疗与抗-PD-1抗体(例如纳武单抗)联合的I期/II期临床试验的第一部分的研究设计。在该设计中，将向受试者施用VB-111(3×10¹²个病毒颗粒或1×10¹³个病毒颗粒)，与纳武单抗(3mg/kg)联合。DLT：剂量限制性毒性。

图6显示了VB-111治疗与抗-PD-1抗体(例如纳武单抗)联合的I期/II期临床试验的第二部分的研究设计。在第二部分中，将向受试者施用：VB-111(1×10¹³个病毒颗粒)与纳武单抗(3mg/kg)联合(第1臂)；或纳武单抗(3mg/kg)(第2臂)。DLT：剂量限制性毒性。

图7显示了用于在晚期、顽固性转移性结直肠癌患者中联合VB-111与抗PD1抗体(纳武单抗)的开放标签、单臂II期研究的研究设计。患者将在周期2的第1天或周期4的第1天进行治疗前活组织检查以及一次治疗后活组织检查。

实施方式

1.一种在有需要的受试者中减小肿瘤尺寸或抑制肿瘤生长或消除肿瘤的方法，包括：(a)向受试者施用有效剂量的载体，所述载体包含与内皮细胞特异性启动子可操作地连接的Fas-嵌合体基因，以及(b)向受试者施用有效剂量的免疫检查点抑制剂。

2.一种治疗有需要的受试者的肿瘤或其转移的方法，包括：(a)向受试者施用有效剂量的载体，所述载体包含与内皮细胞特异性启动子可操作地连接的Fas-嵌合体基因，以及(b)向受试者施用有效剂量的免疫检查点抑制剂。

3.一种在患有肿瘤的受试者中诱导或改善T细胞活化的方法，包括：(a)向受试者施用有效剂量的载体，所述载体包含与内皮细胞特异性启动子可操作地连接的Fas-嵌合体基因，以及(b)向受试者施用有效剂量的免疫检查点抑制剂。

4.一种在患有肿瘤的受试者中诱导或提高免疫检查点抑制剂的疗效的方法，包括：(a)向受试者施用有效剂量的载体，所述载体包含与内皮细胞特异性启动子可操作地连接的Fas-嵌合体基因，以及(b)向受试者施用有效剂量的免疫检查点抑制剂。

5.一种将有需要的受试者的冷肿瘤转化为热肿瘤的方法，包含：(a)向受试者施用有效剂量的载体，所述载体包含与内皮细胞特异性启动子可操作地连接的Fas-嵌合体基因，以及(b)向受试者施用有效剂量的免疫检查点抑制剂。

6.根据实施方式1至5中任一项的方法，其中所述肿瘤来源于以下各项或与以下各项相关：白血病、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、原发性脑肿瘤(包括多形性胶质母细胞瘤)、胃肠(GI)癌(包括但不限于食道、胆囊、胆道、肝脏、胰腺、胃、小肠、大肠、结肠、直肠和肛门的癌)、恶性胰腺岛瘤、恶性类癌、膀胱癌、癌前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、乳头状甲状腺癌、神经母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、神经内分泌癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、前列腺癌、苗勒氏癌、卵巢癌、腹膜癌、输卵管癌或子宫乳头状浆液性癌。

7.根据实施方式1至6中任一项的方法，其中所述Fas嵌合体基因编码以下多肽，所述多肽包含与Fas多肽的跨膜结构域和细胞内结构域融合的TNF受体1(TNFR1)多肽的细胞外结构域。

8.根据实施方式7的方法，其中所述TNFR1的细胞外结构域包含与SEQ ID NO:4具有至少约70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中TNFR1的细胞外结构域能够结合TNF-α。

9.根据实施方式8的方法，其中所述Fas多肽的跨膜结构域和细胞内结构域包含与SEQ ID NO:8具有至少约70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中Fas多肽的跨膜结构域和细胞内结构域能够诱导Fas介导的细胞凋亡。

10.根据实施方式1至9中任一项的方法，其中所述Fas-嵌合体基因包含第一核苷酸序列，其与SEQ ID NO:3具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；以及第二核苷酸序列，其与SEQ ID NO:7具有至少约70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。

11.根据实施方式1至10中任一项的方法，其中所述内皮细胞特异性启动子包含PPE-1启动子。

12.根据实施方式1至11中任一项的方法，其中所述内皮细胞特异性启动子还包含顺式作用调控元件。

13.根据实施方式12的方法，其中所述顺式作用调控元件包含与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16具有至少约70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。

14.根据实施方式13的方法，其中所述顺式作用调控元件包含SEQ ID NO:11或SEQID NO:12。

15.根据实施方式14的方法，其中所述顺式作用调控元件还包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14。

16.根据实施方式1至15中任一项的方法，其中所述内皮细胞特异性启动子是PPE-1-3X启动子。

17.根据实施方式16的方法，其中所述PPE-1-3X启动子包含与SEQ ID NO:18具有至少约70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列，其中PPE-1-3X启动子能够指导内皮细胞中的Fas嵌合体基因表达。

18.根据实施方式1至17中任一项的方法，其中以约1×10¹⁰至约1×10¹⁶、约1×10¹¹至约1×10¹⁵、约1×10¹¹至约1×10¹⁶、约1×10¹²至约1×10¹⁵、约1×10¹²至约1×10¹⁶、约1×10¹²至约1×10¹⁴、约5×10¹²至约1×10¹⁶、约5×10¹²至约1×10¹⁵、约5×10¹²至约1×10¹⁴、约1×10¹²至约1×10¹³，或约1×10¹³至约1×10¹⁴个病毒颗粒的量施用载体的有效剂量。

19.根据实施方式1至18中任一项的方法，其中以约1×10¹⁶、1×10¹⁵、1×10¹⁴、5×10¹³、4×10¹³、3×10¹³、2×10¹³、1×10¹³、9×10¹²、8×10¹²、7×10¹²、6×10¹²、5×10¹²、4×10¹²、3×10¹²、2×10¹²、1×10¹²、9×10¹¹、8×10¹¹、7×10¹¹、6×10¹¹、5×10¹¹、4×10¹¹、3×10¹¹、2×10¹¹、1×10¹¹、9×10¹⁰、8×10¹⁰、7×10¹⁰、6×10¹⁰、5×10¹⁰、4×10¹⁰、3×10¹⁰、2×10¹⁰或1×10¹⁰个病毒颗粒的量施用载体的有效剂量。

20.根据实施方式1至19中任一项的方法，其中按顺序施用载体和免疫检查点抑制剂。

21.根据实施方式20的方法，其中在施用免疫检查点抑制剂之前施用载体。

22.根据实施方式21的方法，其中在肿瘤进展时施用免疫检查点抑制剂。

23.根据实施方式20的方法，其中在施用载体之前施用免疫检查点抑制剂。

24.根据实施方式1至23中任一项的方法，其中重复施用载体。

25.根据实施方式24的方法，其中每天、约2天一次、约3天一次、约4天一次、约5天一次、约6天一次、约7天一次、约2周一次、约3周一次、约4周一次、约5周一次、约6周一次、约7周一次、约2个月一次或约6个月一次重复施用载体。

26.根据实施方式1至25中任一项的方法，其中重复施用免疫检查点抑制剂。

27.根据实施方式26的方法，其中约7天一次、约2周一次、约3周一次、约4周一次、约2个月一次、约3个月一次、约4个月一次、约5个月一次，或约6个月一次重复施用免疫检查点抑制剂。

28.根据实施方式1至27中任一项的方法，其中免疫检查点抑制剂是PD-1拮抗剂。

29.根据实施方式28的方法，其中以小于约15mg/kg、小于约14mg/kg、小于约13mg/kg、小于约12mg/kg、小于约11mg/kg、小于约10mg/kg、小于约9mg/kg、小于约8mg/kg、小于约7mg/kg、小于约6mg/kg、小于约5mg/kg、小于约4mg/kg、小于约3mg/kg、小于约2mg/kg或小于约1mg/kg的有效量施用PD-1拮抗剂。

30.根据实施方式28的方法，其中以约100mg至约600mg、约120mg至约500mg、约140mg至约460mg、约180mg至约420mg、约200mg至约380mg、约220mg至约340mg、约230mg至约300mg，或约230mg至约260mg固定剂量的有效量施用PD-1拮抗剂。

31.根据实施方式28的方法，其中以约400mg至约600mg、约450mg至约520mg、约460mg至约510mg，或约470mg至约500mg固定剂量的有效量施用PD-1拮抗剂。

32.根据实施方式28的方法，其中以约60mg、约80mg、约100mg、约120mg、约140mg、约160mg、约180mg、约200mg、约220mg、约240mg、约260mg、约280mg、约300mg、约320mg、约340mg、约360mg、约380mg、约400mg、约420mg、约440mg、约460mg、约480mg、约500mg、约520mg、约540mg、约560mg、约580mg或约600mg固定剂量(flat dose)的有效量施用PD-1拮抗剂。

33.根据实施方式28至32中任一项的方法，其中PD-1拮抗剂是结合PD-1的抗体。

34.根据实施方式33的方法，其中抗体是单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体或嵌合抗体。

35.根据实施方式33或34的方法，其中抗体选自纳武单抗、派姆单抗、卡瑞利珠单抗、西米普利单抗、信迪利单抗(sintilimab)和PDR001。

36.根据实施方式28至35中任一项的方法，其中PD-1拮抗剂是纳武单抗。

37.根据实施方式28至32中任一项的方法，其中PD-1拮抗剂是结合PD-L1的抗体。

38.根据实施方式37的方法，其中抗体是单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体或嵌合抗体。

39.根据实施方式37或38的方法，其中抗体选自阿替利珠单抗、阿维单抗、德瓦鲁单抗和BMS-936559。

40.根据实施方式1至39中任一项的方法，还包括向受试者施用有效剂量的一种或多种化疗剂。

41.根据实施方式40的方法，其中一种或多种化疗剂选自：阿西维辛、阿柔比星、盐酸阿考达唑、阿克罗宁、阿霉素、阿多来新、阿地白介素、爱宁达、六甲蜜胺、安波霉素、醋酸阿美蒽向受试者施用醌、氨鲁米特、安吖啶、阿那曲唑、氨茴霉素、天冬酰胺酶、曲林菌素、阿扎胞苷、阿扎替派、阿佐霉素、巴马司他、苯佐替派、比卡鲁胺、盐酸比生群、二甲磺酸双奈法德、贝伐单抗、比折来新、硫酸博来霉素、布喹那钠、溴匹立明、白消安、放线菌素、卡鲁睾酮、卡醋胺、卡贝替姆、卡铂、卡莫司汀(BiCNU)、盐酸卡柔比星、卡折来新、西地芬戈、苯丁酸氮芥、西罗霉素、顺铂、克拉屈滨、甲磺酸克立那托、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、盐酸柔红霉素、地西他滨、右奥马铂、地扎呱宁、甲磺酸地扎呱宁、地吖醌、多西他赛、多柔比星、盐酸多柔比星、屈洛昔芬、柠檬酸屈洛昔芬、丙酸屈他雄酮、达佐霉素、依达曲沙、盐酸依氟鸟氨酸、依沙芦星、恩洛铂、恩普氨酯、依匹哌啶、盐酸表柔比星、厄布洛唑、盐酸依索比星、雌莫司汀、雌莫司汀磷酸钠、依他硝唑、依托泊苷、磷酸依托泊苷、艾托卜宁、盐酸法倔唑、法扎拉滨、芬维A胺、氟尿苷、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟西他滨、磷喹酮、福司曲星钠、吉西他滨、盐酸吉西他滨、片、羟基脲、盐酸伊达比星、异环磷酰胺、伊莫福新、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-n1、干扰素α-n3、干扰素β-1a、干扰素γ-1b、异丙铂、盐酸伊立替康、醋酸兰瑞肽、来曲唑、醋酸亮丙瑞林、盐酸利阿唑、洛美曲索钠、洛莫司汀(CCNU)、盐酸洛索蒽醌、马索罗酚、美登素、盐酸氮芥、醋酸甲地孕酮、醋酸美仑孕酮、美法仑、美诺立尔、巯嘌呤、甲氨喋呤、甲氨喋呤钠、氯苯氨啶、美妥替哌、米丁度胺、米托凯星、丝裂红素、丝裂菌褶素、米托马星、丝裂霉素、米托司培、米托坦、盐酸米托蒽醌、麦考酚酸、诺考达唑、诺拉霉素、奥马铂、奥昔舒仑、帕唑帕尼(pazotinib)、紫杉醇、培门冬酶、培利霉素、戊氮芥、硫酸培洛霉素、过磷酰胺、哌泊溴烷、哌泊舒凡、盐酸吡罗蒽醌、普卡霉素、普洛美坦、卟吩姆钠、泊非霉素、泼尼莫司汀、盐酸丙卡巴肼、嘌罗霉素、盐酸嘌罗霉素、吡唑呋喃菌素、利波腺苷、罗谷亚胺、沙芬戈、盐酸沙芬戈、司莫司汀、辛曲秦、索拉非尼、司巴膦酸钠、司帕霉素、盐酸锗螺胺、螺莫斯汀、螺铂、绛色霉素、链佐星、磺氯苯脲、舒尼替尼、他利霉索、紫杉酚、替可加兰钠(tecogalan sodium)、替加氟、盐酸替洛蒽醌、替莫泊芬、替莫唑胺、替尼泊苷、替罗昔隆、睾内酯、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、噻替派、噻唑呋林(Tiazofuirin)、替拉扎明、盐酸拓扑替康、柠檬酸托瑞米芬、醋酸曲托龙、磷酸曲西立滨、三甲曲沙、三甲曲沙葡萄糖醛酯、曲普瑞林、盐酸妥布氯唑、尿嘧啶氮芥、乌瑞替派、伐普肽、维替泊芬、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、长春地辛、硫酸长春地辛、硫酸长春匹定、硫酸长春甘酯、硫酸环氧长春碱、酒石酸长春瑞滨、硫酸长春罗定、硫酸长春利定、伏氯唑、折尼铂(Zeniplatin)、净司他丁和盐酸佐柔比星。

42.根据实施方式1至41中任一项的方法，其中载体包含SEQ ID NO:19、由SEQ IDNO:19组成，或基本上由SEQ ID NO:19组成。

43.根据实施方式1至42中任一项的方法，其中载体是具有欧洲动物细胞保藏中心(ECACC)登录号13021201的分离的病毒。

具体实施方式

I、定义

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有如本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在有冲突的情况下，以本公开(包括定义)为准。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。本文所提到的所有出版物、专利和其他文献通过引用整体并入本文用于所有目的，如同每篇出版物或专利申请被具体地且个别地指明通过引用并入本文一样。

虽然与本文所述的那些类似或等同的方法和材料能够被用于实践或测试本公开，合适的方法和材料被描述如下。所述材料、方法和实例仅仅是说明性的而非旨在限制。可以从详细的说明书和从权利要求书容易地看到本公开的其他特征和优点。

为了进一步定义本公开，提供以下术语和定义。

在本公开中，术语“一个(a)”或“一种(an)”实体指的是一个或多个该实体；例如，“一种多核苷酸”被理解为代表一个或多个多核苷酸。因此，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可以互换使用。

此外，在本文中使用的“和/或”将被视为具体公开了两个特定特征或组分中的每一个，其中包含或不包含另一个。因此，本文中诸如“A和/或B”等短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，用在诸如“A、B和/或C”之类的短语中的术语“和/或”旨在涵盖以下各个方面：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。

术语“约”在本文中用于指大约、大致、约或在……的范围内。当术语“约”与数值范围结合使用时，其通过将边界延伸到所给出的数值之上和之下来修改该范围。一般来说，术语“约”在本文中用于修饰高于和低于所述值上下(更高或更低)10％的变化的数值。

如本文中所用，“抗体”是指完整的免疫球蛋白、其抗原结合片段或抗原结合分子。本公开的抗体可以是任何同种型或类别(例如，M、D、G、E和A)或任何亚类(例如，G1-4、A1-2)，并且可具有卡帕(κ)或兰姆达(λ)轻链。

如本文中所用，术语“有效量”是指在必要的剂量和时期内有效地达到所需效果的量。所需结果可以是，例如，在体外或体内减少或抑制新血管形成或血管生成；减小或抑制肿瘤尺寸；或诱导或改善T细胞活化。有效量不需要“治好”或完全去除新血管形成或血管生成。在一些实施方式中，有效量可以减小肿瘤尺寸或体积。在一些实施方式中，有效量可以减少或改善癌症的一种或多种症状。

如本文中所用，短语“治疗肿瘤”是指抑制肿瘤生长、减小肿瘤尺寸、防止肿瘤复发及其组合。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”旨在包括单个核酸以及多个核酸，并指分离的核酸分子或构建体，例如，信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。在某些实施方式中，多核苷酸包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如，酰胺键，诸如在肽核酸(PNA)中发现的)。

如本文中所用，“多核苷酸”、“核苷酸”或“核酸”可以互换使用，并且包含全长cDNA序列的核苷酸序列，包括非翻译5’和3’序列、编码序列以及核酸序列的片段、表位、结构域和变体。多核苷酸可以由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸组成，其可以是未修饰的RNA或DNA或经修饰的RNA或DNA。例如，多核苷酸可以由单链和双链DNA、作为单链和双链区域的混合物的DNA、单链和双链的RNA以及作为单链和双链区域的混合物的RNA、包含可为单链区域或更常见地双链区域或者单链区域和双链区域的混合物的DNA和RNA的杂交分子组成。另外，多核苷酸可由包含RNA或DNA或者RNA和DNA两者的三链区组成。多核苷酸还可包含一个或多个经修饰的碱基或出于稳定性或其他原因而被修饰的DNA或RNA主链。“经修饰的”碱基包括，例如，三苯甲基化碱基和罕见碱基诸如肌苷。可以对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包括化学、酶促或代谢修饰的形式。

在本公开中，多肽可由通过肽键或经修饰的肽键(即，肽电子等排物)彼此连接的氨基酸组成，并且可包含除20个基因编码的氨基酸外的氨基酸(例如非天然存在的氨基酸)。本公开的多肽可通过天然过程诸如翻译后加工或通过本领域公知的化学修饰技术来进行修饰。此类修饰在基础文本和更详细的专著以及大量研究文献中进行详尽描述。修饰可发生在多肽的任何地方，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基末端或羧基末端。应当理解，相同类型的修饰可以以相同或不同的程度存在于给定多肽的几个位点中。此外，给定的多肽可包含许多类型的修饰。多肽可以例如由于遍在蛋白化而分支，并且它们可以是环状的、具有或不具有分支。环状、支化和支化的环状多肽可由翻译后的天然过程产生，或者也可通过合成方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸盐的形成、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解处理、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转运RNA介导的氨基酸向蛋白质的添加，诸如精氨化和遍在蛋白化。(参见，例如，Proteins-Structure And Molecular Properties,2nd Ed.,T.E.Creighton,W.H.Freeman andCompany,New York(1993)；Posttranslational Covalent Modification of Proteins,B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New York,pgs.1-12(1983)；Seifter et al.,MethEnzymol 182:626-646(1990)；Rattan et al.,Ann NY Acad Sci 663:48-62(1992))。

当提及本公开的任何多肽或多核苷酸时，术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括保留至少一些活性，即发挥多肽或多核苷酸的任何天然存在的功能的能力的任何多肽或多核苷酸。例如，肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)的“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”具有天然存在的全长TNFR1的一些活性，例如，与TNFR1配体，即，TNF-α或淋巴毒素结合的能力。在另一个实例中，Fas多肽的“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”具有天然存在的全长Fas多肽的一些活性，例如，诱导细胞凋亡的能力。在其他实例中，内皮细胞特异性启动子的“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”可诱导与启动子可操作地连接的基因的内皮细胞特异性表达。下文中描述了TNFR1、Fas多肽和内皮细胞特异性启动子的各种片段、变体、类似物或衍生物的其他非限制性实例。

术语两个多核苷酸或多肽序列之间的“序列同一性百分比”是指由所述序列在比较窗口中共有的相同匹配位置的数量，其考虑了为了两个序列的最佳比对而必须引入的添加或缺失(即，缺口)。匹配的位置是在其处在靶序列和参考序列中均存在相同的核苷酸或氨基酸的任何位置。由于缺口不是核苷酸或氨基酸，所以不计数靶序列中存在的缺口。同样地，不计数参考序列中出现的缺口，因为计数靶序列的核苷酸或氨基酸而不是来自参考序列的核苷酸或氨基酸。

通过以下方式来计算序列同一性的百分比：确定两个序列中均出现相同氨基酸残基或核酸碱基的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的总位置数，并将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。序列的比较和两个序列之间的序列同一性百分比的确定可使用在线使用和下载的现成软件来完成。合适的软件程序可从各种来源获得，并且用于蛋白质和核苷酸序列的比对。确定百分比序列同一性的一个合适的程序是b12seq，其为BLAST程序套件的一部分，可从美国政府的国家生物技术信息中心BLAST网站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)获得。B12seq使用BLASTN或BLASTP算法进行两个序列之间的比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。其他合适的程序是，例如Needle、Stretcher、Water或Matcher(生物信息学程序的EMBOSS套件的一部分)，也可在www.ebi.ac.uk/Tools/psa从欧洲生物信息学研究所(EBI)获得。

与多核苷酸或多肽参考序列比对的单个多核苷酸或多肽靶序列中的不同区域可以各自具有其自己的序列同一性百分比。注意，序列同一性百分比值四舍五入到最接近的十分之一。例如，80.11、80.12、80.13和80.14向下舍入到80.1，而80.15、80.16、80.17、80.18和80.19向上舍入到80.2。还应注意，长度值将始终是整数。

本领域技术人员将理解，用于计算序列同一性百分比的序列比对的生成不限于仅由初级序列数据驱动的二进制序列-序列比较。序列比对可源自多个序列比对。生成多序列比对的一个合适的程序是ClustalW2，可从www.clustal.org获得。另一个合适的程序是MUSCLE，可从www.drive5.com/muscle/获得。ClustalW2和MUSCLE可选地可以例如从EBI获得。

还应当理解，序列比对可通过将序列数据与来自异构源的数据(诸如结构数据(例如，晶体蛋白结构)、功能数据(例如，突变位置)或系统发育数据)整合来生成。整合异构数据以生成多序列比对的合适程序是T-Coffee，可在www.tcoffee.org获得，或者可从例如EBI获得。还应当理解，用于计算序列同一性百分比的最终比对可以自动或手动进行。

如本文中所用，术语“连接的”、“融合的”、“融合”、“嵌合的”和“嵌合体”可互换使用。这些术语是指通过包括化学缀合或重组手段在内的任何手段将两个以上的元件或组分连接在一起。“框内融合”是指将两个或多个开放阅读框(ORF)以保持原始ORF的正确阅读框的方式连接起来，形成连续的更长的ORF。因此，所得的重组融合蛋白或嵌合蛋白是包含两个或多个区段的单一蛋白，所述区段对应于由原始ORF编码的多肽(所述区段在自然界中通常不如此连接)。尽管阅读框在整个融合区段中是连续的，但可以通过例如框内接头序列将所述区段在物理上或空间上分开。

术语“异源核苷酸序列”意指多核苷酸源自与其进行比较的实体的多核苷酸的不同实体。例如，异源多核苷酸可以是合成的，或源自不同物种、个体的不同细胞类型，或者不同个体的相同或不同类型的细胞。在一个方面，异源核苷酸序列可以是与另一种多核苷酸可操作地连接以产生融合多核苷酸的多核苷酸。在一些方面，异源核苷酸序列可以编码多肽。例如，异源核苷酸序列可以是与编码多肽的基因可操作地连接的启动子元件。异源核苷酸序列还可以包括与编码多肽的基因可操作地连接的其他顺式调控元件。在其他方面，异源核苷酸序列可以不编码多肽。

如本文中所用，术语“表达”是指基因籍以产生生物化学物质，例如RNA或多肽的过程。所述过程包括细胞内基因的功能存在的任何表现，包括但不限于基因敲低以及瞬时表达和稳定表达。其包括但不限于将基因转录成信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或任何其他RNA产物，以及将此类mRNA翻译成一种或多种多肽。如果最终所需产物是生化物质，表达包括该生化物质和任何前体的产生。

如本文中所用，术语“互补决定区”(CDR)是指负责与抗原结合的抗体的氨基酸残基。抗体的CDR区存在于抗体的重链和轻链的高变区内。全长抗体包含重链可变结构域中的三个CDR区和轻链可变结构域中的三个CDR区。

如本文所用，术语“抗肿瘤反应”是指受试者针对肿瘤存在的身体反应。例如，在一些方面，本公开中的抗肿瘤反应可以是抗肿瘤免疫反应。在一些方面，抗肿瘤免疫反应表征为肿瘤床内存在肿瘤浸润性CD8+淋巴细胞。在一些方面，抗肿瘤免疫反应表征为受试者的特定细胞因子谱。在一些方面，抗肿瘤免疫反应表征为受试者中存在针对肿瘤标志物或肿瘤组织的循环抗肿瘤抗体。

如本文所用，术语“冷肿瘤”是指肿瘤内存在很少或没有免疫细胞的肿瘤。例如，冷肿瘤可能几乎没有，或没有肿瘤浸润淋巴细胞(例如，T细胞和B细胞)、自然杀伤(NK)细胞或巨噬细胞存在于肿瘤微环境中。肿瘤不需要完全没有免疫细胞才能成为冷肿瘤。

如本文所用，术语“热肿瘤”是指：与冷肿瘤相比，肿瘤内存在的免疫细胞增加的肿瘤。例如，与冷肿瘤相比，热肿瘤可能在肿瘤微环境中增加了肿瘤浸润淋巴细胞(例如，T细胞和B细胞)、自然杀伤(NK)细胞或巨噬细胞的存在。

如本文所用，术语“免疫检查点”是指充当免疫系统的正调节剂或负调节剂的生物分子。免疫检查点在维持自我耐受、预防自身免疫和保护组织免受免疫附带损害方面发挥作用。免疫检查点分子可包括但不限于CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR)、诱导性T细胞共刺激物(ICOS)、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、NOX2、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、VISTA和SIGLEC7。

如本文中所用，术语“重复施用的”是指以限定的固定间隔在重复的基础上施用治疗剂。每次施用之间的时间间隔可在重复施用过程中发生改变，并且可以长达1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、7周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年或更长。

如本文中所用，术语“联合治疗”是指施用两种或多种治疗方式来治疗疾病或疾患。在本公开的一个方面，联合治疗是指向有需要的受试者或受试者群体施用载体和免疫检查点抑制剂。在一些实施方式中，联合治疗包括在施用载体之前施用免疫检查点抑制剂。在另一个实施方式中，联合治疗包括在施用载体的同时施用免疫检查点抑制剂。在另一个实施方式中，联合治疗包括在施用载体之后施用免疫检查点抑制剂。

如本文所用，术语“腺病毒”是指腺病毒科的人腺病毒。本公开的腺病毒可包括例如来自七个种和57种血清型中的任一种的腺病毒，包括A种(血清型12、18和31)、B种(血清型3、7、11、14、16、21、34、35、50和55)、C种(血清型1、2、5、6和57)、D种(8、9、10、13、15、17、19、20、22-30、32、33、36-39、42-49、51、53、54和56)、E种(血清型4)、F种(血清型40和41)或G种(血清型52)。如本文所用，术语“腺病毒载体”是指经过基因修饰以与天然野生型病毒表现不同的腺病毒。例如，可以修饰腺病毒载体，使其无法在特定包装细胞系之外复制。在一些方面，腺病毒载体被遗传修饰以携带一种或多种编码非腺病毒蛋白的基因。

II、本公开的治疗方法

尽管有多种化疗药物可用于治疗不同类型的肿瘤，但癌症仍然是全球主要死亡原因之一。由于化疗药物不加区分地靶向快速分裂的细胞、杀死肿瘤细胞和快速分裂的健康细胞，它们通常具有不期望的毒性。其他药物仅限于治疗具有特定基因突变的特定肿瘤类型。当原发肿瘤转移到身体的其他部位时，这些问题就会变得更加复杂，从而使有效治疗变得更加困难。

免疫检查点在肿瘤生长和发展中发挥作用。通过受体/配体相互作用自然刺激免疫检查点，肿瘤细胞能够逃避宿主免疫系统。因此，测试了阻断免疫检查点的分子(例如免疫检查点抑制剂)用于治疗癌症。然而，这些抑制剂仅对只有少数几种类型肿瘤的一小部分受试者起作用。此外，受试者对免疫检查点疗法的反应通常伴随着复发和疾病进展。

本公开提供了一种减小或抑制有需要的受试者的肿瘤尺寸或消除肿瘤的方法，包括：(a)向受试者施用有效剂量的载体，所述载体包含与内皮细胞特异性启动子可操作地连接的Fas-嵌合体基因；以及(b)向受试者施用有效剂量的免疫检查点抑制剂。在特定方面，与未施用载体的受试者的肿瘤相比，该受试者的肿瘤尺寸减小或被抑制，或肿瘤被消除。

本公开还提供了一种治疗有需要的受试者的肿瘤或其转移的方法，包括：(a)向受试者施用有效剂量的载体，所述载体包含与内皮细胞特异性启动子可操作地连接的Fas-嵌合体基因；以及(b)向受试者施用有效剂量的免疫检查点抑制剂。在特定方面，与未施用载体的受试者中的肿瘤相比，该受试者中的肿瘤或其转移得到治疗。通过自然刺激免疫检查点，肿瘤细胞可以下调抗肿瘤T细胞活性并逃避宿主的抗肿瘤免疫反应。这导致肿瘤诱导的T细胞耐受，并使得肿瘤不受宿主免疫系统的控制而继续生长。因此，研究免疫检查点抑制剂作为癌症治疗剂。然而，免疫检查点抑制剂并不是针对“冷肿瘤”(肿瘤内几乎没有或没有免疫细胞的肿瘤)的有效治疗剂。冷肿瘤可能几乎没有或没有肿瘤浸润淋巴细胞(例如T细胞和B细胞)、自然杀伤(NK)细胞或巨噬细胞存在于肿瘤微环境中。相反，与冷肿瘤相比，热肿瘤是肿瘤内免疫细胞存在增加的肿瘤。例如，与冷肿瘤相比，热肿瘤可能在肿瘤微环境中增加了肿瘤浸润淋巴细胞(例如，T细胞和B细胞)、自然杀伤(NK)细胞或巨噬细胞的存在。

本公开还提供了一种在患有肿瘤的受试者中诱导或改善T细胞活化的方法，包括：(a)向受试者施用有效剂量的载体，所述载体包含与内皮细胞特异性启动子可操作地连接的Fas-嵌合体基因；以及(b)向受试者施用有效剂量的免疫检查点抑制剂。在特定方面，与未施用载体的受试者中的T细胞活化相比，该受试者中的T细胞活化被诱导或改善。

本公开还提供了一种诱导或提高免疫检查点抑制剂的疗效的方法，包括：(a)向受试者施用有效剂量的载体，所述载体包含与内皮细胞特异性启动子可操作地连接的Fas-嵌合体基因；以及(b)向受试者施用有效剂量的免疫检查点抑制剂。在特定方面，与未施用载体的受试者中免疫检查点抑制剂的疗效相比，免疫检查点抑制剂的疗效在该受试者中被诱导或改善。

本公开还提供了一种将有需要的受试者的冷肿瘤转化为热肿瘤的方法，包括：(a)向受试者施用有效剂量的载体，所述载体包含与内皮细胞特异性启动子可操作地连接的Fas-嵌合体基因；以及(b)向受试者施用有效剂量的免疫检查点抑制剂。在特定方面，与未施用载体的受试者中的冷肿瘤相比，该受试者中的冷肿瘤转化为热肿瘤。

可以通过本领域已知的技术测量肿瘤生长，包括但不限于磁共振成像(MRI)扫描、功能性MRI(fMRI)扫描、计算机断层扫描(CT)扫描或正电子发射断层扫描(PET)扫描。在特定方面，通过MRI测量肿瘤的生长。在一些方面，受试者的肿瘤是在用载体治疗期间出现的复发性肿瘤。而在其他实施方式中，受试者的肿瘤是在用载体治疗期间出现的转移性肿瘤。

在一些方面，本公开的方法提高了受试者的总体生存率。在一些方面，本公开的方法增加受试者的无进展生存率。

术语“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指任何受试者，特别是哺乳动物受试者，其对本公开的方法具有阳性反应或预期具有阳性反应。在一些方面，受试者是人。在一些方面，受试者是癌症患者。

A.免疫检查点抑制剂

本公开的方法包括向受试者施用有效剂量的载体，所述载体包含与内皮细胞特异性启动子可操作地连接的Fas-嵌合体基因，并且还向受试者施用有效剂量的免疫检查点抑制剂。

免疫检查点是参与刺激或抑制免疫反应的生物分子。免疫系统自然地尝试通过激活针对含有肿瘤抗原的细胞的抗肿瘤免疫反应来消除肿瘤细胞。抗肿瘤免疫反应可包括肿瘤特异性CD8+淋巴细胞(细胞毒性T细胞)、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞和其他免疫细胞，它们迁移到肿瘤部位、浸润肿瘤并杀死肿瘤细胞。在整个免疫反应过程中，存在各种信号检查点来刺激或抑制T细胞活化，从而调节抗肿瘤反应的程度和持续时间。

一些免疫检查点有助于刺激免疫反应(例如，刺激T细胞活化)。刺激性免疫检查点包括但不限于CD27、CD28、CD40、CD40L(CD154)、CD58、CD80、CD86、CD122、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、CD252(OX40L)和CD278(ICO)。其他免疫检查点对免疫反应产生抑制作用(例如，抑制T细胞活化)。抑制性免疫检查点包括但不限于腺苷A2A受体(A2AR)、CD152(CTLA-4)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、IDO、TDO、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、NOX2、VTCN1(B7-H4)、PD-1、PD-L1、PD-L2、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域-3(TIM3)、CD328(SIGLEC7)、CD329(SIGLEC9)、以及具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)。

肿瘤可以通过参与抑制性免疫检查点和下调抗肿瘤反应来逃避宿主的抗肿瘤反应。因此，研究阻断免疫检查点的分子(例如免疫检查点抑制剂)用于治疗癌症。然而，这些抑制剂仅对只有少数几种类型肿瘤的一小部分患者起作用。此外，患者对免疫检查点抑制剂治疗的反应通常伴随着复发和疾病进展。

在一些方面，可用于本公开的方法中的免疫检查点抑制剂是与免疫检查点受体或免疫检查点受体配体结合的分子。在一些方面，免疫检查点抑制剂是抗体。在一些方面，抗体是单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体或嵌合抗体。在另一方面，免疫检查点抑制剂包括Fab、F(ab)₂、Fv或scFv。

在一些方面，免疫检查点抑制剂与参与抑制T细胞活化的免疫检查点受体或免疫检查点受体配体结合。在特定方面，免疫检查点抑制剂是抑制A2A受体(A2AR)、CD152(CTLA-4)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、IDO、TDO、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、淋巴细胞激活基因3(LAG3)、NOX2、VTCN1(B7-H4)、PD-1、PD-L1、PD-L2、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域-3(TIM3)、CD328(SIGLEC7)、CD329(SIGLEC9)以及具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)的T细胞刺激活性的分子。

B.PD-1拮抗剂

在本公开的特定方面，免疫检查点抑制剂是PD-1拮抗剂。PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)是一种细胞表面受体，在体内抑制T细胞反应中发挥作用。被称为程序性死亡配体1(PD-L1)的B7同系物是PD-1的天然配体，其通过与PD-1受体结合来传递其T细胞抑制信号。大多数正常人体组织在细胞表面不表达PD-L1。然而，人类癌症在细胞表面表达大量PD-L1。肿瘤细胞表面表达的PD-L1与T细胞表面的PD-1结合可导致T细胞凋亡、T细胞耗竭、T细胞失能、T细胞IL-10产生和树突状细胞抑制。这些信号会抑制抗肿瘤T细胞的活性，并充当免疫屏障，帮助肿瘤细胞逃避抗肿瘤免疫反应。

PD-1拮抗剂可通过直接与PD-1结合并抑制PD-1与PD-L1的相互作用，来阻止PD-1信号传导。这减少了来自PD-1受体的信号并阻断了PD-1介导的T细胞抑制。在一个实施方式中，可用于本公开的PD-1拮抗剂是抗PD-1抗体。在另一个实施方式中，抗PD-1抗体是单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体或嵌合抗体。在另一个实施方式中，用于治疗的抗PD-1抗体包含Fab、F(ab)₂、Fv或scFv。

在一些方面，PD-1拮抗剂是选自以下的抗PD-1抗体：纳武单抗(参见，例如美国专利号8,008,449以及Wang等，2014，Cancer Immunol Res.2(9):846-56)、派姆单抗(参见，例如美国专利号8,354,509和8,900,587)、卡瑞利珠单抗(SHR-1210；参见，例如Huang等，Clin Cancer Res.2018，PMID：29358502)、西米普利单抗(参见，例如美国专利申请公开号2015/0203579A1)、信迪利单抗(参见，例如Liu等，J Hematol Oncol.，2017；10(1):136)和PDR001(参见，例如Naing等，JClin Oncol.2016)。

在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂是包含纳武单抗V_H的3个CDR的抗PD-1抗体。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂是包含纳武单抗V_L的3个CDR的抗PD-1抗体。在其他实施方式中，免疫检查点抑制剂是包含纳武单抗V_H的3个CDR和纳武单抗V_L的3个CDR(V_HCDR1、V_H CDR2、V_H CDR3、V_L CDR1、V_L CDR2和V_L CDR3)的抗PD-1抗体。在其他实施方式中，免疫检查点抑制剂是包含V_H和V_L的抗PD-1抗体，该V_H包含纳武单抗V_H的氨基酸序列，该V_L包含纳武单抗V_L的氨基酸序列。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂是纳武单抗。

另一种可以减少或抑制PD-1信号传导的PD-1拮抗剂是一种与PD-L1结合从而阻断PD-L1与PD-1相互作用的分子。这种受体/配体结合的干扰减少了来自PD-1受体的信号传导并阻断了PD-1介导的T细胞抑制。在一个实施方式中，可用于本公开的PD-1拮抗剂是抗PD-L1抗体。在另一个实施方式中，抗PD-L1抗体是单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体或嵌合抗体。在另一个实施方式中，抗PD-L1抗体包含Fab、F(ab)₂、Fv或scFv。

在一些方面，PD-1拮抗剂是选自以下的抗PD-L1抗体：阿替利珠单抗(参见，例如美国专利号8,217,149)、阿维单抗(参见，例如US 2014/0341917A1)、德瓦鲁单抗(参见，例如US 2013/0034559 A1)和BMS-936559(参见，例如美国专利号7,943,743；WO 2013/173223)。

C.包含Fas-嵌合体载体和PD-1拮抗剂的联合治疗

本公开提供了一种减小或抑制有需要的受试者的肿瘤尺寸或消除肿瘤的方法，包括：(a)向受试者施用有效剂量的载体，所述载体包含与内皮细胞特异性启动子可操作地连接的Fas-嵌合体基因；以及(b)向受试者施用有效剂量的PD-1拮抗剂。在一些方面，与未施用载体的受试者的肿瘤相比，该受试者的肿瘤尺寸减小或被抑制，或者受试者的肿瘤被消除。

本公开还提供了一种治疗有需要的受试者的肿瘤或其转移的方法，包括：(a)向受试者施用有效剂量的载体，所述载体包含与内皮细胞特异性启动子可操作地连接的Fas-嵌合体基因；以及(b)向受试者施用有效剂量的PD-1拮抗剂。在一些方面，与未施用载体的受试者中的肿瘤或其转移相比，该受试者中的肿瘤或其转移得到治疗。

本公开还提供了一种在患有肿瘤的受试者中诱导或改善T细胞活化的方法，包括：(a)向受试者施用有效剂量的载体，所述载体包含与内皮细胞特异性启动子可操作地连接的Fas-嵌合体基因；以及(b)向受试者施用有效剂量的PD-1拮抗剂。在一些方面，与未施用载体的受试者中的T细胞活化相比，该受试者中的T细胞活化被诱导或改善。

本公开还提供了一种在患有肿瘤的受试者中诱导或提高PD-1拮抗剂的疗效的方法，包括：(a)向受试者施用有效剂量的载体，所述载体包含与内皮细胞特异性启动子可操作地连接的Fas-嵌合体基因；以及(b)向受试者施用有效剂量的PD-1拮抗剂。在一些方面，与未施用载体的受试者中PD-1拮抗剂的疗效相比，PD-1拮抗剂的疗效在该受试者中被诱导或改善。

本公开还提供了一种将有需要的受试者的冷肿瘤转化为热肿瘤的方法，包括：(a)向受试者施用有效剂量的载体，所述载体包含与内皮细胞特异性启动子可操作地连接的Fas-嵌合体基因；以及(b)向受试者施用有效剂量的PD-1拮抗剂。在一些方面，与未施用载体的受试者中的冷肿瘤相比，该受试者中的冷肿瘤转化为热肿瘤。

对于本公开的方法，载体的有效剂量是每六周施用0.5×10¹³-2×10¹³个病毒颗粒，PD-1拮抗剂(例如抗PD-1抗体(例如纳武单抗))的有效剂量是每两周约240mg或每四周约480mg。在一些方面，以每三周约200mg的剂量施用抗PD-1抗体(例如派姆单抗)。

可以通过本领域已知的技术来测量肿瘤生长，包括但不限于磁共振成像(MRI)扫描、功能性MRI(fMRI)扫描、计算机断层扫描(CT)扫描或正电子发射断层扫描(PET)扫描。在特定方面，通过MRI测量肿瘤的生长。在一些方面，受试者的肿瘤是在用载体治疗期间出现的复发性肿瘤。在其他实施方式中，受试者的肿瘤是在用载体治疗期间出现的转移性肿瘤。

术语“受试者”或“个体”或“动物”或“受试者”或“哺乳动物”是指任何受试者，特别是哺乳动物受试者，其由于本公开而具有，或预期具有增加或改善的抗肿瘤反应。在一些方面，术语“受试者”或“个体”或“动物”或“受试者”或“哺乳动物”是指已被给予包含表达Fas嵌合体蛋白的载体的组合方案的任何受试者，特别是哺乳动物受试者和PD-1拮抗剂。在一个实施例中，受试者是人。在另一个实施方式中，受试者是癌症患者。

在某些方面，在施用载体之前、与施用载体的同时，或在施用载体之后，施用PD-1拮抗剂。在其他方面，在PD-1拮抗剂之前至少提前1天、至少提前2天、至少提前3天、至少提前4天、至少提前5天、至少提前6天、至少提前7天、至少提前9天、至少提前10天、至少提前2周、至少提前3周、至少提前4周、至少提前1个月、至少提前2个月或更多时间，施用载体。在其他方面，在载体之前至少提前1天、至少提前2天、至少提前3天、至少提前4天、至少提前5天、至少提前6天、至少提前7天、至少提前9天、至少提前10天、至少提前2周、至少提前3周、至少提前4周、至少提前1个月、至少提前2个月或更多时间，施用PD-1拮抗剂。

在一些方面，受试者的肿瘤是在用载体治疗期间出现的复发性肿瘤。在其他实施方式中，受试者的肿瘤是在用载体治疗期间出现的转移性肿瘤。在一些方面，在施用PD-1拮抗剂之前施用载体，并且在肿瘤进展时施用PD-1拮抗剂。在一些方面，在施用PD-1拮抗剂之前施用载体，并且在肿瘤复发时施用PD-1拮抗剂。

作为本公开的一部分施用的载体的有效剂量可以以病毒颗粒(VP)测量。在一些实施例中，载体的有效剂量包括但不限于等于或小于约1×10¹⁶、1×10¹⁵、1×10¹⁴、5×10¹³、4×10¹³、3×10¹³、2×10¹³、1×10¹³、9×10¹²、8×10¹²、7×10¹²、6×10¹²、5×10¹²、4×10¹²、3×10¹²、2×10¹²、1×10¹²、9×10¹¹、8×10¹¹、7×10¹¹、6×10¹¹、5×10¹¹、4×10¹¹、3×10¹¹、2×10¹¹、1×10¹¹、9×10¹⁰、8×10¹⁰、7×10¹⁰、6×10¹⁰、5×10¹⁰、4×10¹⁰、3×10¹⁰、2×10¹⁰或1×10¹⁰个病毒颗粒。在其他实施方式中，载体的有效剂量为约1×10¹⁰至约1×10¹⁶、约1×10¹¹至约1×10¹⁵、约1×10¹¹至约1×10¹⁶、约1×10¹²至约1×10¹⁵、约1×10¹²至约1×10¹⁶、约1×10¹²至约1×10¹⁴、约5×10¹²至约1×10¹⁶、约5×10¹²至约1×10¹⁵、约5×10¹²至约1×10¹⁴、约1×10¹²至约1×10¹³、约1×10¹³至约1×10¹⁴个病毒颗粒。

在一些方面，以至少约1×10¹¹个病毒颗粒的有效剂量施用载体。在一些方面，以至少约1×10¹²个病毒颗粒的有效剂量施用载体。在一些方面，以至少约1×10¹³个病毒颗粒的有效剂量施用载体。在一些方面，以至少约1×10¹⁴个病毒颗粒的有效剂量施用载体。在一些方面，以至少约1×10¹⁵个病毒颗粒的有效剂量施用载体。在一些方面，以至少约1×10¹⁶个病毒颗粒的有效剂量施用载体。在一些方面，以至少约1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰或5×10¹⁰个病毒颗粒的有效剂量施用载体。

在本公开的一些方面，有效剂量的PD-1拮抗剂以固定剂量施用。就本公开而言，术语“固定剂量(flat dose)”的使用意指不考虑患者的体重或体表面积(BSA)而向患者施用的剂量。因此，固定剂量不是作为mg/kg剂量提供，而是作为药物(例如抗PD-1抗体)的绝对量提供。例如，一个60kg的人和一个100kg的人将接受相同剂量的组合物(例如，240mg的抗PD-1抗体)。

在一些方面，PD-1拮抗剂是抗PD-1或抗PD-L1抗体。在一些方面，抗PD-1或抗PD-L1抗体的有效剂量是约100mg至约600mg之间的剂量(例如，固定剂量)。在一些方面，抗PD-1或PD-L1抗体的有效剂量是约100-300mg的固定剂量，诸如约200-300mg、约220-260mg、约230-250mg，或约240mg。在一些方面，抗PD-1或抗PD-L1抗体的有效剂量是约400-600mg的固定剂量，诸如约450-520mg、约460-510mg、约470-500mg，或约480mg。在一些方面，抗PD-1或PD-L1抗体的有效剂量是一个剂量(例如，固定剂量)，诸如约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约110mg、约120mg、约130mg、约140mg、约150mg、约160mg、约170mg、约180mg、约190mg、约200mg、约210mg、约220mg、约230mg、约240mg、约250mg、约260mg、约270mg、约280mg、约290mg、约300mg、约310mg、约320mg、约330mg、约340mg、约350mg、约360mg、约370mg、约380mg、约390mg、约400mg、约410mg、约420mg、约430mg、约440mg、约450mg、约460mg、约470mg、约480mg、约490mg、约500mg、约510mg、约520mg、约530mg、约540mg、约550mg、约560mg、约570mg、约580mg、约590mg或约600mg。

在一些方面，抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的有效剂量是约60-100mg、约60-200mg、约60-300mg、约60-400mg、约60-500mg或约60-600mg之间的剂量(例如，固定剂量)。在一些方面，抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的有效剂量是约100-200mg、约100-300mg、约100-400mg或约100-500mg之间的剂量(例如，固定剂量)。在一些方面，抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的有效剂量是约300-400mg或约300-500mg之间的剂量(例如，固定剂量)。在一些方面，抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的有效剂量是约400-500mg之间的剂量(例如，固定剂量)。在一个特定方面，抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的有效剂量是约480mg的剂量(例如，固定剂量)。

本文所指的术语“基于体重的剂量”是指基于患者的体重计算向患者施用的剂量。例如，当一个体重60kg的患者需要3mg/kg的抗PD-1抗体时，可以取适量的抗PD-1抗体(即180mg)。

在一些方面，PD-1拮抗剂的有效剂量是等于或小于约15mg/kg、14mg/kg、13mg/kg、12mg/kg、11mg/kg、10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg或1mg/kg。在一个具体实施方式中，PD-1拮抗剂的有效剂量为约3mg/kg。

在一些方面，PD-1拮抗剂是纳武单抗。在一些方面，以3×10¹²至3×10¹³个病毒颗粒的有效剂量施用载体，以2mg/kg至12mg/kg的有效剂量(基于重量的剂量)施用纳武单抗。在其他方面，以3×10¹²至3×10¹³个病毒颗粒的有效剂量施用载体，以460mg至500mg的有效剂量(固定剂量)施用纳武单抗。

在特定方面，以1×10¹³个病毒颗粒的量施用载体的有效剂量，以3mg/kg的量(基于重量的剂量)施用纳武单抗的有效剂量。在另一方面，以3×10¹²至1×10¹³个病毒颗粒的量施用载体的有效剂量，以200mg至260mg的量(固定剂量)施用纳武单抗的有效剂量。在特定方面，以1×10¹³个病毒颗粒的量施用载体的有效剂量，以240mg的有效量(固定剂量)施用纳武单抗。

在另一方面，以1×10¹³个病毒颗粒的量施用载体的有效剂量，以3mg/kg至12mg/kg的量(基于重量的剂量)施用纳武单抗的有效剂量。在另一方面，以3×10¹²至1×10¹³个病毒颗粒的量施用载体的有效剂量，以460mg至500mg的量(固定剂量)施用纳武单抗的有效剂量。在特定方面，以1×10¹³个病毒颗粒的量施用载体的有效剂量，以480mg的量(固定剂量)施用纳武单抗的有效剂量。

在一些方面，PD-1拮抗剂是派姆单抗。在一些方面，以3×10¹²至3×10¹³个病毒颗粒的有效剂量施用载体，以150mg至250mg的有效剂量(固定剂量)施用派姆单抗。

在另一方面，以3×10¹²至1×10¹³个病毒颗粒的量施用载体的有效剂量，以180mg至220mg的量(固定剂量)施用派姆单抗的有效剂量。在特定方面，以1×10¹³个病毒颗粒的量施用载体的有效剂量，以200mg的有效量(固定剂量)施用派姆单抗。

本公开的方法包括施用至少一种有效剂量的载体和PD-1拮抗剂。用于施用载体和PD-1拮抗剂的方案包括重复施用载体和PD-1拮抗剂。在一个实施方式中，每天、约2天一次、约3天一次、约4天一次、约5天一次、约6天一次、约7天一次、约2周一次、约3周一次、约4周一次、约5周一次、约6周一次、约7周一次、约2个月一次或约6个月一次重复施用载体。在另一个实施方式中，约7天一次、约2周一次、约3周一次、约4周一次、约2个月一次、约3个月一次、约4个月一次、约5个月一次，或约6个月一次重复施用PD-1拮抗剂。在一个特定实施方式中，每2个月施用一次载体，每2周施用一次PD-1拮抗剂。在一个具体实施方式中，PD-1拮抗剂是纳武单抗。

D.疾病和病症

本公开的方法可用于减小或抑制有需要的受试者的肿瘤尺寸或消除肿瘤。在本公开的一些方面，肿瘤源自或与以下疾病相关：转移性结直肠癌(mCRC)、晚期非鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、转移性肾细胞癌(mRCC)、多形性胶质母细胞瘤(GBM)、苗勒氏癌、卵巢癌、腹膜癌、输卵管癌或子宫乳头状浆液性癌。在一些方面，本公开的方法减少了恶性腹膜液(例如腹水)的体积，减轻了受试者的疼痛，延长了受试者的生存期，或其任何组合。载体和PD-1拮抗剂的联合可以减少、抑制或治疗肿瘤。肿瘤可以是实体瘤、原发性肿瘤、转移性肿瘤或其任何组合。术语“转移性”或“转移”是指能够在另一部位或器官中建立继发性肿瘤病变的肿瘤细胞。

在本公开的方法中，“实体瘤”包括但不限于肉瘤、黑色素瘤、癌或其他实体瘤癌症。“肉瘤”是指由像胚胎结缔组织的物质组成并且通常由包埋于纤维状或同源物质中的紧密堆积的细胞组成的肿瘤。肉瘤包括但不限于软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑色素肉瘤、黏液肉瘤、骨肉瘤、艾伯内西氏(Abemethy's)肉瘤、脂肉瘤、脂肪肉瘤、肺泡状软组织肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄状肉瘤、绿色瘤肉瘤、绒毛膜癌、胚胎性肉瘤、维尔姆斯瘤肉瘤、子宫内膜肉瘤、间质肉瘤、尤文肉瘤、筋膜肉瘤、成纤维细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、霍奇金氏肉瘤、特发性多发性色素沉着出血性肉瘤、B细胞的免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞的免疫母细胞肉瘤、晏森氏(Jensen's)肉瘤、卡波西氏肉瘤、库普弗细胞肉瘤、血管肉瘤、白色肉瘤、恶性间质瘤肉瘤、骨旁肉瘤、网状细胞肉瘤、劳斯肉瘤、浆液囊性肉瘤、滑膜肉瘤和毛细管扩张性肉瘤。

术语“黑色素瘤”是指由皮肤和其他器官的黑色素细胞系统产生的肿瘤。黑色素瘤包括例如肢端雀斑状黑色素瘤、无黑色素性黑色素瘤、良性青少年性黑色素瘤、克劳德曼氏(Cloudman's)黑色素瘤、S91黑色素瘤、哈-帕二氏(Harding-Passey)黑色素瘤、青少年性黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素瘤、转移性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、甲下黑色素瘤(subungal melanoma)和浅表扩散性黑色素瘤。

术语“癌(carcinoma)”是指由倾向于浸润周围组织并引起转移的上皮细胞组成的恶性新生物。示例性癌包括例如腺泡癌(acinar carcinoma)、腺泡状癌(acinouscarcinoma)、囊性腺样癌(adenocystic carcinoma)、腺样囊性癌(adenoid cysticcarcinoma)、腺癌(carcinoma adenomatosum)、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌、基底细胞癌(carcinoma basocellulare)、类基底细胞癌(basaloid carcinoma)、基底鳞状细胞癌(basosquamous cell carcinoma)、细支气管肺泡癌(bronchioalveolarcarcinoma)、细支气管癌、支气管癌、髓样癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶样癌、粉刺癌、子宫体癌、筛状癌、胸廓癌(carcinoma en cuirasse)、皮肤癌、柱状癌、柱状细胞癌、导管癌、硬癌(carcinoma durum)、胚胎性癌、髓样癌(encephaloid carcinoma)、表皮样癌(epiennoidcarcinoma)、腺样上皮癌(carcinoma epithelialeadenoides)、外植癌(exophyticcarcinoma)、溃疡性癌(carcinoma ex ulcere)、纤维癌(carcinoma fibrosum)、胶状癌(gelatiniform carcinoma)、胶样癌(gelatinous carcinoma)、巨大细胞癌、巨细胞癌、腺癌(glandular carcinoma)、颗粒细胞癌、毛母质癌(hair-matrix carcinoma)、多血癌、肝细胞癌、许特莱氏细胞腺癌(Hurthle cell carcinoma)、玻璃质癌(hyaline carcinoma)、肾细胞癌(hypemephroid carcinoma)、幼稚型胚胎性癌(infantile embryonalcarcinoma)、原位癌、表皮内癌(intraepidermal carcinoma)、上皮内癌(intraepithelialcarcinoma)、克龙派切尔氏癌(Krompecher′s carcinoma)、库尔契茨基细胞癌(Kulchitzky-cell carcinoma)、大细胞癌(large-cell carcinoma)、豆状癌(lenticularcarcinoma)、豆状癌(carcinoma lenticulare)、脂瘤癌(lipomatous carcinoma)、淋巴上皮癌(lymphoepithelial carcinoma)、髓样癌(carcinoma medullare)、髓样癌(medullarycarcinoma)、黑色素癌(melanotic carcinoma)、软癌(carcinoma molle)、粘液癌(mucinous carcinoma)、粘液癌(carcinoma muciparum)、粘液细胞癌(carcinomamucocellulare)、粘液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma)、粘液癌(carcinomamucosum)、粘液癌(mucous carcinoma)、粘液瘤样癌(carcinoma myxomatodes)、鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma)、燕麦细胞癌(oat cell carcinoma)、骨化性癌(carcinomaossificans)、类骨质癌(osteoid carcinoma)、乳头状癌(papillary carcinoma)、门脉周癌(periportal carcinoma)、浸润前癌(preinvasive carcinoma)、棘细胞癌(pricklecell carcinoma)、软糊状癌(pultaceous carcinoma)、肾的肾细胞癌、储备细胞癌(reserve cell carcinoma)、肉瘤样癌(carcinoma sarcomatodes)、施奈德癌(Schneiderian carcinoma)、乳腺硬癌(scirrhous carcinoma)、阴囊癌(carcinomascroti)、印戒细胞癌(signet-ring cell carcinoma)、单纯癌(carcinoma simplex)、小细胞癌、马铃薯状(solenoid carcinoma)、球状细胞癌(spheroidal cell carcinoma)、梭形细胞癌(spindle cell carcinoma)、髓样癌(carcinoma spongiosum)、鳞癌(squamouscarcinoma)、鳞状细胞癌、绳捆癌(string carcinoma)、血管扩张性癌(carcinomatelangiectaticum)、血管扩张性癌(carcinoma telangiectodes)、移行细胞癌(transitional cell carcinoma)、结节性癌(carcinoma tuberosum)、结节性皮癌(tuberous carcinoma)、疣状癌(verrucous carcinoma)和绒毛状癌(carcinomaviflosum)。

可以根据本方法抑制或治疗的另外的癌症(cancer)包括例如白血病、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC))、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺癌、原发性脑肿瘤、神经胶质瘤(包括多形性胶质母细胞瘤(GBM)和复发性GBM)、胃肠(GI)癌(包括但不限于食道、胆囊、胆道、肝脏、胰腺、胃、小肠、大肠、结肠、直肠和肛门的癌)、恶性胰腺岛瘤、恶性类癌、膀胱癌、癌前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、乳头状甲状腺癌、神经母细胞瘤、神经内分泌癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、前列腺癌、苗勒氏癌、卵巢癌、腹膜癌、输卵管癌或子宫乳头状浆液性癌。

在一些方面，肿瘤是复发性肿瘤。在一些方面，肿瘤是转移性肿瘤。

III、包含Fas-嵌合体基因和内皮细胞特异性启动子的核酸构建体

本公开提供了一种抗肿瘤治疗的方法，包括：(a)向受试者施用有效剂量的载体，所述载体包含与内皮细胞特异性启动子可操作地连接的Fas-嵌合体基因；以及(b)向受试者施用有效剂量的检查点抑制剂。

在本公开中，编码Fas-嵌合体蛋白(或基因产物)的基因可以与内皮细胞特异性启动子连接，所述启动子指导内皮细胞中Fas-嵌合体基因产物的表达。这种细胞毒性基因产物的表达在其中不希望过度新血管形成或血管生长的情况下(例如，在肿瘤中)是有用的。

A.Fas-嵌合体

由本公开的核酸构建体表达的Fas-嵌合体蛋白包含至少两种“死亡受体”多肽，每种所述多肽源自不同的蛋白质。Fas-嵌合体蛋白的第一多肽包含肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)的配体结合结构域。Fas-嵌合体蛋白的第二多肽包含Fas多肽的效应子结构域。

TNFR1的配体结合结构域可以是与TNFR1配体结合的任何结构域。在一个实施方式中，TNFR1配体是TNF-α。在另一个实施方式中，TNFR1配体是淋巴毒素-α。TNFR1的配体结合结构域可以是TNFR1的细胞外结构域或其任何片段、变体、衍生物或其类似物。下面描述TNFR1配体结合结构域的非限制性实例。

可用于本公开的Fas多肽的效应子结构域包括形成死亡诱导信号传导复合物(DISC)从而诱导细胞凋亡的任何Fas结构域。在一个实施方式中，Fas多肽的效应子结构域包含细胞内结构域、跨膜结构域或两者。下面描述Fas多肽效应子结构域的非限制性实例。

TNFR1和Fas多肽可以通过肽键或通过接头连接。连接TNFR1配体结合结构域与Fas效应子结构域的接头可以是多肽接头或非肽接头。例如，Fas-嵌合体蛋白的接头可包含一个或多个甘氨酸、丝氨酸、亮氨酸或其任意组合。在一个实施方式中，用于本公开的接头包含Ser-Leu。在另一个实施方式中，可用于本公开的接头包括(GGGS)n，(Denise etal.J.Biol.Chem.277:35035-35043(2002))，其中n可为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多(SEQ ID NO:25)。

1.肿瘤坏死因子受体1

全长人TNFR1多肽的长度为455个氨基酸，也称为TNF-R1、肿瘤坏死因子受体I型(TNFRI)、TNFR-I、TNFRSF1A、TNFAR、p55、P60或CD120a。已知天然存在的人TNFR1多肽与TNF-α或同三聚体淋巴毒素-α结合。TNF-α与细胞外结构域的结合导致TNFRI的同三聚体化，然后其与肿瘤坏死因子受体1型相关死亡结构域蛋白(TRADD)的死亡结构域特异性相互作用。各种TRADD相互作用蛋白，诸如TNF受体相关因子(TRAFS)、受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(RIPK1)和具有死亡结构域的Fas相关蛋白(FADD)，通过它们与TRADD的缔合而被募集至复合物中。所述复合物激活至少两种不同的信号传导级联，细胞凋亡和NF-κ-B信号传导。

455aa的多肽序列(报道为人TNFR1多肽序列)在UniProtKB数据库中具有标识号P19438-1。这种人TNFR1多肽序列在本文中被指定为同种型A和SEQ ID NO:2。SEQ ID NO:1是编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列。108aa的多肽序列被报道为人TNFR1多肽序列的同种型并且在UniProtKB数据库中具有标识号P19438-2。所述108aa的多肽对应于同种型A(SEQ IDNO:2)的氨基酸1至108，并且在本文中被指定为同种型B。具有232aa的人TNFR1多肽的另一个变体在UniProtKB数据库中被报道为标识号P19438-3。232aa的多肽对应于同种型A(SEQID NO:2)的氨基酸1至232，并且在本文中被称为同种型C。人TNFR1的另外的天然变体包括但不限于包含一个或多个突变的同种型A、B和C的TNFR1多肽，所述突变选自由以下组成的组：H51Q、C59R、C59S、C62G、C62Y、P75L、T79M、C81F、C99S、S115G、C117R、C117Y、R121P、R121Q、P305T及其任意组合。其他已知的TNFR1变体包括同种型A、B和C的TNFR1多肽，其包含L13LILPQ、K255E、S286G、R394L、412：缺失、GPAA443-446APP或其任意组合。

表1示出了人野生型TNFR1氨基酸序列和编码野生型TNFR1的核苷酸序列。

表1.TNFR1序列

还报道了小鼠TNFR1多肽序列及其变体。454aa的小鼠TNFR1多肽在UniProtKB数据库中具有标识号P25118。在其他动物中已知的TNFR1多肽包括但不限于大鼠(例如，UniProtKB数据库中的P22934)、牛(例如，UniProtKB数据库中的O19131)、猪(例如，UniProtKB数据库中的P50555)或马(例如，UniProtKB数据库中的D1MH71)。

全长TNFR1可被切割成两条链，(1)TNF受体超家族成员1A，膜形式(即，对应于全长TNFR1的氨基酸22至455)和(2)TNF结合蛋白1(TBPI)(即，对应于全长TNFR1的氨基酸41至291)。全长人TNFR1多肽由信号序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1至21)、细胞外结构域(SEQ IDNO:2的氨基酸22至211)、跨膜结构域(SEQ ID NO:2的氨基酸212至234)和细胞质结构域(SEQ ID NO:2的氨基酸235至455)组成。TNFR1细胞外结构域包含四个半胱氨酸重复区，TNFR-Cys1(对应于SEQ ID NO:2的氨基酸43至82)、TNFR-Cys2(对应于SEQ ID NO:2的氨基酸83至125)、TNFR-Cys3(对应于SEQ ID NO:2的氨基酸126至166)和TNFR-Cys4(对应于SEQID NO:2的氨基酸167至196)组成。

如本领域技术人员将理解的，上面列出的结构域的起始和终止残基可根据所使用的计算机建模程序或用于确定结构域的方法而变化。因此，TNFR1的各种功能结构域可以不同于上面定义的那些。

在一个实施方式中，可用于Fas-嵌合体蛋白的TNFR1的配体结合结构域包含TNFR1的细胞外结构域或其任何片段、变体、衍生物或类似物、基本上由其组成或由其组成，其中TNFR1的细胞外结构域或其任何片段、变体、衍生物或类似物与TNF-α结合。在另一个实施方式中，TNFR1的配体结合结构域包括TNFR-Cys1；TNFR-Cys2；TNFR-Cys3；TNFR-Cys4；TNFR-Cysl和TNFR-Cys2；TNFR-Cysl和TNFR-Cys3；TNFR-Cysl和TNFR-Cys4；TNFR-Cys2和TNFR-Cys3；TNFR-Cys2和TNFR-Cys4；TNFR-Cys3和TNFR-Cys4；TNFR-Cysl、TNFR-Cys2和TNFR-Cys3；TNFR-Cysl、TNFR-Cys2和TNFR-Cys4；TNFR-Cys2、TNFR-Cys3和TNFR-Cys4；或TNFR-Cys1、TNFR-Cys2、TNFR-Cys3和TNFR-Cys4。在其他实施方式中，Fas-嵌合体蛋白中的TNFR1的配体结合结构域包含TNF结合蛋白I。在其他实施方式中，Fas-嵌合体蛋白的TNFR1配体结合结构域包含与SEQ ID NO:2的氨基酸22至190、氨基酸22至191、氨基酸22至192、氨基酸22至193、氨基酸22至194、氨基酸22至195、氨基酸22至196、氨基酸22至197、氨基酸22至198、氨基酸22至199、氨基酸22至200、氨基酸22至201、氨基酸22至202、氨基酸22至203、氨基酸22至204、氨基酸22至205、氨基酸22至206、氨基酸22至207、氨基酸22至208、氨基酸22至209、氨基酸22至210或氨基酸22至211具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，基本由所述氨基酸序列组成，或由所述氨基酸序列组成，其中所述配体结合结构域与TNFR1配体(例如TNF-α)结合。

在其他实施方式中，TNFR1的配体结合结构域还包含信号肽。合适的信号肽的一个实例是TNFR1的信号肽，例如SEQ ID NO:2的氨基酸1至21。在又一其他实施方式中，Fas-嵌合体基因产物的配体结合结构域包含与SEQ ID NO:2的氨基酸1至190、氨基酸1至191、氨基酸1至192、氨基酸1至193、氨基酸1至194、氨基酸1至195、氨基酸1至196、氨基酸1至197、氨基酸1至198、氨基酸1至199、氨基酸1至200、氨基酸1至201、氨基酸1至202、氨基酸1至203、氨基酸1至204、氨基酸1至205、氨基酸1至206、氨基酸1至207、氨基酸1至208、氨基酸1至209、氨基酸1至210或氨基酸1至211具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，基本由所述氨基酸序列组成，或由所述氨基酸序列组成，其中所述配体结合结构域与TNFR1配体，例如TNF-α结合。在特定实施方式中，Fas-嵌合体蛋白的TNFR1配体结合结构域包含与SEQ ID NO:4具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成，其中所述配体结合结构域与TNFR1配体(例如，TNF-α)结合。

在其他实施方式中，TNFR1的配体结合结构域由与SEQ ID NO:3具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列编码。

在又一其他实施方式中，Fas-嵌合体蛋白的TNFR1配体结合结构域包含与SEQ IDNO:2的氨基酸22至108(TNFR1同种型B)、SEQ ID NO:2的氨基酸22至232(TNFR1同种型C)或SEQ ID NO:2的氨基酸44至291(TBP1)具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成，其中所述配体结合结构域与TNFR1配体(例如，TNF-α)结合。

2.Fas多肽

全长人Fas多肽的长度为335个氨基酸，并且也被称为肿瘤坏死因子受体超家族成员6、Apo-1抗原、细胞凋亡介导表面抗原Fas、FasLG受体或CD95。天然存在的Fas多肽是TNFSF6/FasLG的受体。当Fas多肽与Fas配体(FasL)结合时，Fas与FasL之间的相互作用导致死亡诱导信号传导复合物(DISC)的形成，所述复合物包含FADD、半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-10。在一些类型的细胞(I型)中，经处理的半胱天冬酶-8直接激活半胱天冬酶家族的其他成员，并触发细胞凋亡的执行。在其他类型的细胞(II型)中，Fas-DISC启动反馈环，所述反馈环螺旋进入促凋亡因子从线粒体的递增释放和半胱天冬酶-8的放大激活。Fas介导的细胞凋亡可在诱导外周耐受性、抗原刺激的成熟细胞自杀或两者方面都有作用。

报道为人Fas多肽序列的335aa的多肽序列在UniProtKB数据库中具有标识号P25445-1。该人Fas多肽序列在本文中被指定为SEQ ID NO:6。SEQ ID NO:5是编码SEQ IDNO:6的核苷酸序列。编码Fas多肽的核苷酸序列也被称为APT1、Fas1或TNFRSF6。全长Fas多肽包含信号肽(对应于SEQ ID NO:6的氨基酸1至25)、细胞外结构域(对应于SEQ ID NO:6的氨基酸26至173)、跨膜结构域(对应于SEQ ID NO:6的氨基酸174至190)和细胞内(或细胞质)结构域(对应于SEQ ID NO:6的氨基酸191至335)。细胞内结构域包含死亡结构域(例如，对应于SEQ ID NO:6的氨基酸230至314)。

如本领域技术人员将会理解的，上文所列的结构域的起始和终止残基可根据所使用的计算机建模程序或用于确定结构域的方法而变化。因此，Fas的各种功能结构域可以不同于上面定义的那些功能结构域。表2示出了野生型人Fas氨基酸序列和编码Fas蛋白的核苷酸序列。

表2.Fas序列

还报道了小鼠Fas多肽序列及其变体。327aa的小鼠Fas多肽在UniProtKB数据库中具有标识号P25446。在其他动物中已知的Fas多肽包括但不限于，旧世界猴(例如，UniProtKB数据库中的Q9BDN4)、恒河猴(例如，UniProtKB数据库中的Q9BDP2)、大鼠(例如，UniProtKB数据库中的Q63199)或奶牛(例如，UniProtKB数据库中的P51867)。

基于Fas多肽中的序列变异，本领域普通技术人员可鉴定出Fas多肽的效应子结构域中的序列变异。例如，Fas效应子结构域的天然变体可包括C178R、L180F、P183L、I184V、T198I、Y232C、T241K、T241P、V249L、R250P、R250Q、G253D、G253S、N255D、A257D、I259R、D260G、D260V、D260Y、I262S、N264K、T270I、T270K、E272G、E272K、L278F、K299N、T305I、I310S或其任意组合的一个或多个取代或突变。

在一个实施方式中，可用于本公开的Fas多肽的效应子结构域包含Fas多肽的死亡结构域。在另一个实施方式中，Fas多肽的效应子结构域包含与SEQ ID NO:6的氨基酸230至314具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。在其他实施方式中，Fas多肽的效应子结构域包含Fas多肽的细胞内结构域。在又一其他实施方式中，Fas多肽的效应子结构域包含与SEQ ID NO:6的氨基酸185至335、氨基酸186至335、氨基酸187至335、氨基酸188至335、氨基酸189至335、氨基酸190至335、氨基酸191至335、氨基酸192至335、氨基酸193至335、氨基酸194至335、氨基酸195至335、氨基酸196至335、氨基酸197至335、氨基酸198至335或氨基酸199至335具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在又一其他实施方式中，Fas多肽的效应子结构域还包含Fas多肽的跨膜结构域。在又一其他实施方式中，Fas多肽的效应子结构域包含与SEQ ID NO:6的氨基酸174至335具有至少约60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，Fas多肽的效应子结构域还包含来自Fas细胞外结构域的C末端部分的约10个、约9个、约8个、约7个、约6个、约5个、约4个、约3个、约2个或约1个氨基酸。在某些实施方式中，Fas多肽的效应子结构域包含与SEQ ID NO:6的氨基酸179至335、氨基酸178至335、氨基酸177至335、氨基酸176至335、氨基酸175至335、氨基酸174至335、氨基酸173至335、氨基酸172至335、氨基酸171至335、氨基酸170至335、氨基酸169至335、氨基酸168至335、氨基酸167至335、氨基酸166至335、氨基酸165至335、氨基酸164至335或氨基酸163至335具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中所述效应子结构域形成死亡诱导信号复合物(DISC)，激活半胱天冬酶8，或诱导细胞凋亡。

在一些实施方式中，Fas多肽的效应子结构域包含与SEQ ID NO:8具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成，其中所述效应子结构域形成死亡诱导信号复合物(DISC)，激活半胱天冬酶8，或诱导细胞凋亡。

在其他实施方式中，Fas多肽的效应子结构域由与SEQ ID NO:7具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列编码。

在一个实施方式中，本公开的Fas-嵌合体基因产物包含与SEQ ID NO:10具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成，其中所述Fas-嵌合体基因产物诱导细胞凋亡。在另一个实施方式中，Fas-嵌合体基因产物由与EQ ID NO：9具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列编码，其中所述Fas-嵌合体基因产物诱导细胞凋亡。

B.内皮细胞特异性启动子

包含Fas-嵌合体基因的核酸构建体还包含一个或多个表达控制元件，用于调控可操作地连接的Fas-嵌合体基因的表达。所述表达控制元件包括但不限于启动子、分泌信号和其他调控元件。

用于本公开的核酸构建体利用内皮细胞特异性启动子来在内皮细胞中指导Fas-嵌合体蛋白的表达，从而诱导内皮细胞凋亡。

出于本公开的目的，内皮细胞特异性启动子可包含一个或多个顺式调控元件，其与不含顺式调控元件的启动子相比，提高了启动子的内皮细胞特异性。在一个实例中，顺式调控元件包括增强子。在另一个方面，顺式调控元件包括缺氧反应元件。在其他实例中，顺式调控元件包括增强子和缺氧反应元件。

在一个实施方式中，可用于本公开的顺式调控元件包含与SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:12(SEQ ID NO:11的互补序列)具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列，其中与不含顺式调控元件的启动子相比，所述顺式调控元件提高了启动子的内皮细胞特异性。顺式调控元件还可包含与SEQ ID NO:13或SEQ IDNO:14(SEQ ID NO:13的互补序列)具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的其他核苷酸序列。

在另一个实施方式中，本公开的顺式调控元件包含与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14(SEQ ID NO:13的互补序列)具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列，其中与不含顺式调控元件的启动子相比，所述顺式调控元件提高了启动子的内皮细胞特异性。顺式调控元件还可包含与SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:12(SEQ ID NO:11的互补序列)具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的其他核苷酸序列。

在其他实施方式中，本公开的顺式调控元件包含与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16(SEQ ID NO:15的互补序列)具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列，其中与不含顺式调控元件的启动子相比，所述顺式调控元件提高了启动子的内皮细胞特异性。在其他实施方式中，核酸构建体的顺式调控元件包含SEQID NO:15或SEQ ID NO:16或其任何片段、变体、衍生物或类似物，其中与不含顺式调控元件的启动子相比，所述片段、变体、衍生物或类似物提高了启动子的内皮细胞特异性。

在一些实施方式中，本公开的顺式调控元件包含与SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列，其中与不含顺式调控元件的启动子相比，所述顺式调控元件提高了启动子的内皮细胞特异性。在其他实施方式中，核酸构建体的顺式调控元件包含SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21或其任何片段、变体、衍生物或类似物，其中与不含顺式调控元件的启动子相比，所述片段、变体、衍生物或类似物提高了启动子的内皮细胞特异性。

在一些实施方式中，本公开的顺式调控元件包含与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列，其中与不含顺式调控元件的启动子相比，所述顺式调控元件提高了启动子的内皮细胞特异性。在其他实施方式中，核酸构建体的顺式调控元件包含SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23或其任何片段、变体、衍生物或类似物，其中与不含顺式调控元件的启动子相比，所述片段、变体、衍生物或类似物提高了启动子的内皮细胞特异性。

表3显示了对本公开有用的各种顺式调控元件序列。

表3.内皮细胞特异性顺式调控元件和启动子

本公开的顺式调控元件可在启动子的上游或下游与启动子连接或插入启动子中的两个核苷酸之间。本公开的内皮细胞特异性启动子可以利用本领域已知的任何启动子。例如，可用于本公开的合适的启动子包括内皮特异性启动子：前内皮素原-1(PPE-1启动子)，US2010/0282634(2010年11月11日公布的；和2011年7月14日公布的WO 2011/083464)；PPE-1-3X启动子(美国专利第7,579,327、美国专利第8,071,740号、US 8,039,261、US2010/0282634、US2007/0286845、WO 2011/083464和WO2011/083466)；TIE-1(S79347、S79346)和TIE-2(U53603)启动子[Sato TN,Proc Natl Acad Sci U S A 1993Oct 15；90(20):9355-8]、内皮糖蛋白启动子[Y11653；Rius C,Blood 1998Dec 15；92(12):4677-90]、vonWillerbrand因子[AF152417；Collins CJ Proc Natl Acad Sci U S A 1987Jul；84(13):4393-7]、KDR/flk-1启动子[X89777，X89776；Ronicke V，Circ Res 1996Aug；79(2):277-85]、FLT-1启动子[D64016 AJ224863；Morishita K,:J Biol Chem 1995Nov 17；270(46):27948-53]、Egr-1启动子[AJ245926；Sukhatme VP,Oncogene Res 1987Sep-Oct；l(4):343-55]、E-选择蛋白启动子[Y12462；Collins T J Biol Chem 1991Feb 5；266(4):2466-73]、内皮粘附分子启动子：ICAM-1[X84737；Horley KJ EMBO J 1989年10月；8(10):2889-96]、VCAM-1[M92431；Iademarco MF，J Biol Chem1992年8月15日；267(23):16323-9]、PECAM-1[AJ313330X96849；CD31,Newman PJ,Science 1990Mar 9；247(4947):1219-22]、血管平滑肌特异性元件：CArG box X53154和主动脉羧肽酶样蛋白(ACLP)启动子[AF332596；LayneMD,Circ Res.2002；90:728-736]和主动脉优先表达基因-1[Yen-Hsu Chen J.Biol.Chem,Vol.276,Issue 50,47658-47663,December 14,2001]，其全部通过引用整体并入本文。

在一个实施方式中，与内皮细胞特异性元件连接的启动子包含与SEQ ID NO:17具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列，其中与所述元件连接的启动子诱导与所述启动子可操作地连接的基因的内皮细胞特异性。在另一个实施方式中，与内皮细胞特异性元件连接的启动子包括野生型PPE-1启动子的片段、变体、衍生物或类似物，其中所述片段、变体、衍生物或类似物诱导与所述启动子可操作地连接的基因的内皮细胞特异性。在一个实例中，内皮细胞特异性元件可以插入对应于SEQID NO:17的核苷酸残基442与449之间。

在另外的实施方式中，内皮细胞特异性启动子包含缺氧反应元件。缺氧反应元件(HRE)位于内皮素-1启动子的反义链上。该元件是缺氧诱导因子-1的结合位点，其是通过缺氧对内皮素-1启动子(人、大鼠和鼠基因的)进行正向调节所必需的。缺氧是强效信号，诱导包括促红细胞生成素(Epo)、VEGF和各种糖酵解酶在内的几个基因的表达。核心序列(8个碱基对)在所有对缺氧条件有反应的基因中都是保守的，并且侧翼区域与其他基因不同。ET-I缺氧反应元件位于GAT-A-2与AP-1结合位点之间。在一个实例中，缺氧反应元件包括SEQ IDNO:24、其片段、变体、衍生物或类似物。

在其他实施方式中，可用于本公开的内皮细胞特异性启动子包含与SEQ ID NO:18具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成，其中与顺式调控元件连接的启动子诱导与所述启动子可操作地连接的基因的内皮细胞特异性。在另一个实施方式中，内皮细胞特异性启动子包含SEQ ID NO:18的片段、变体、衍生物或类似物，其中所述其片段、变体、衍生物或类似物诱导与所述启动子可操作地连接的基因的内皮细胞特异性。

内皮细胞特异性启动子的其他变化可见于WO2011/083464、WO2011/083466和WO2012/052423中，所述文献通过引用整体并入本文。

本公开还提供了一种新型启动子序列，其包含核苷酸序列SEQ ID NO:17。在一个实例中，启动子还包含内皮细胞特异性顺式调控元件。在一个实例中，内皮细胞特异性顺式调控元件包括SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或其任何片段、衍生物、变体或类似物，其中与不含顺式调控元件的启动子相比，其片段、衍生物、变体或类似物提高了启动子的内皮细胞特异性。在另一个实例中，启动子包含SEQ IDNO:18的核苷酸序列。本公开包括包含新型启动子和异源核苷酸序列的核酸构建体。在一个实施方式中，异源核酸序列包含编码本文所述的Fas-嵌合体蛋白的核苷酸序列。在另一个实施方式中，异源核苷酸序列包含腺病毒序列。

C.载体

本公开还提供了一种包含核酸构建体的载体，所述核酸构建体包含与内皮细胞特异性启动子可操作地连接的Fas-嵌合体基因。出于本公开的目的，可采用许多载体系统。例如，可用于实施本公开的这一方面的各种病毒基因递送系统包括但不限于腺病毒载体、甲病毒载体、肠道病毒载体、瘟病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、疱疹病毒载体、EB病毒载体、乳多空病毒载体、痘病毒载体、痘苗病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒载体。

在另一个实施方式中，包含与内皮细胞特异性启动子可操作地连接的Fas-嵌合体基因的载体是腺病毒。例如，腺病毒可以是人腺病毒物种A(血清型12、18和31)、B(血清型3、7、11、14、16、21、34、35、50和55)、C(血清型1、2、5、6和57)、D(8、9、10、13、15、17、19、20、22-30、32、33、36-39、42-49、51、53、54和56)、E(血清型4)、F(血清型40和41)或G(血清型52)中的任一种或多种。在特定的实施方式中，本公开的腺病毒是人腺病毒血清型5。在一些实施方式中，用于基因治疗的腺病毒是重组非复制型腺病毒，其不含有E1区和E3区。

在一个特定的实施方式中，载体是Ad5-PPE-1-3X-Fas-c载体。在一个更特定的实施方式中，载体是包含SEQ ID NO:19、基本上由其组成，或由其组成的Ad5-PPE-1-3X-Fas-c载体。在另一个实施方式中，腺病毒载体是具有欧洲动物细胞保藏中心(ECACC)登录号13021201的分离的病毒。

IV、治疗进一步包含一种或多种化疗剂

在一些方面，本公开的方法进一步包括向受试者施用一种或多种化疗剂。

可以与本公开的所述腺病毒共同施用的一种或更多种化疗剂包括但不限于阿西维辛、阿柔比星、盐酸阿考达唑、阿克罗宁、阿霉素、阿多来新、阿地白介素、爱宁达、六甲蜜胺、安波霉素、醋酸阿美蒽醌、氨鲁米特、安吖啶、阿那曲唑、氨茴霉素、天冬酰胺酶、曲林菌素、阿扎胞苷、阿扎替派、阿佐霉素、巴马司他、苯佐替派、比卡鲁胺、盐酸比生群、二甲磺酸双奈法德、贝伐单抗、比折来新、硫酸博来霉素、布喹那钠、溴匹立明、白消安、放线菌素、卡鲁睾酮、卡醋胺、卡贝替姆、卡铂、卡莫司汀(BiCNU)、盐酸卡柔比星、卡折来新、西地芬戈、苯丁酸氮芥、西罗霉素、顺铂、克拉屈滨、甲磺酸克立那托、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、盐酸柔红霉素、地西他滨、右奥马铂、地扎呱宁、甲磺酸地扎呱宁、地吖醌、多西他赛、多柔比星、盐酸多柔比星、屈洛昔芬、柠檬酸屈洛昔芬、丙酸屈他雄酮、达佐霉素、依达曲沙、盐酸依氟鸟氨酸、依沙芦星、恩洛铂、恩普氨酯、依匹哌啶、盐酸表柔比星、厄布洛唑、盐酸依索比星、雌莫司汀、雌莫司汀磷酸钠、依他硝唑、依托泊苷、磷酸依托泊苷、艾托卜宁、盐酸法倔唑、法扎拉滨、芬维A胺、氟尿苷、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟西他滨、磷喹酮、福司曲星钠、吉西他滨、盐酸吉西他滨、片、羟基脲、盐酸伊达比星、异环磷酰胺、伊莫福新、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-nl、干扰素α-n3、干扰素β-Ia、干扰素γ-Ib、异丙铂、盐酸伊立替康、醋酸兰瑞肽、来曲唑、醋酸亮丙瑞林、盐酸利阿唑、洛美曲索钠、洛莫司汀(CCNU)、盐酸洛索蒽醌、马索罗酚、美登素、盐酸氮芥、醋酸甲地孕酮、醋酸美仑孕酮、美法仑、美诺立尔、巯嘌呤、甲氨喋呤、甲氨喋呤钠、氯苯氨啶、美妥替哌、米丁度胺、米托凯星、丝裂红素、丝裂菌褶素、米托马星、丝裂霉素、米托司培、米托坦、盐酸米托蒽醌、麦考酚酸、诺考达唑、诺拉霉素、奥马铂、奥昔舒仑、帕唑帕尼(pazotinib)、紫杉醇、培门冬酶、培利霉素、戊氮芥、硫酸培洛霉素、过磷酰胺、哌泊溴烷、哌泊舒凡、盐酸吡罗蒽醌、普卡霉素、普洛美坦、卟吩姆钠、泊非霉素、泼尼莫司汀、盐酸丙卡巴肼、嘌罗霉素、盐酸嘌罗霉素、吡唑呋喃菌素、利波腺苷、罗谷亚胺、沙芬戈、盐酸沙芬戈、司莫司汀、辛曲秦、索拉非尼、司巴膦酸钠、司帕霉素、盐酸锗螺胺、螺莫斯汀、螺铂、绛色霉素、链佐星、磺氯苯脲、舒尼替尼、他利霉索、紫杉酚、替可加兰钠(tecogalan sodium)、替加氟、盐酸替洛蒽醌、替莫泊芬、替莫唑胺、替尼泊苷、替罗昔隆、睾内酯、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、噻替派、噻唑呋林(Tiazofuirin)、替拉扎明、盐酸拓扑替康、柠檬酸托瑞米芬、醋酸曲托龙、磷酸曲西立滨、三甲曲沙、三甲曲沙葡萄糖醛酯、曲普瑞林、盐酸妥布氯唑、尿嘧啶氮芥、乌瑞替派、伐普肽、维替泊芬、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、长春地辛、硫酸长春地辛、硫酸长春匹定、硫酸长春甘酯、硫酸环氧长春碱、酒石酸长春瑞滨、硫酸长春罗定、硫酸长春利定、伏氯唑、折尼铂(Zeniplatin)、净司他丁或盐酸佐柔比星。另外的抗肿瘤剂包括在《抗肿瘤剂(Antineoplastic Agents)》(Paul Calabresi和Bruce A.Chabner)第52章及其引言、Goodman和Gilman的《治疗的药理学基础(ThePharmacological Basis of Therapeutics)》(第八版，1990，McGraw-Hill公司)的第1202-1263页中所公开的那些。

在本公开的一些方面，所述一种或多种化疗剂选自六甲蜜胺、雷曲塞、拓扑替康、紫杉醇、多西他赛、顺铂、卡铂、奥沙利铂、脂质体多柔比星、吉西他滨、环磷酰胺、长春瑞滨、异环磷酰胺、依托泊苷、六甲蜜胺、卡培他滨、伊立替康、美法仑、培美曲塞、贝伐单抗和白蛋白结合紫杉醇。

在一些方面，受试者先前已接受了多达三条、多达两条或多达一条化疗线。在其他方面，受试者先前未接受过超过3条针对复发性癌症的化疗线。

本领域可获得有效剂量的化疗剂。

在一些方面，重复施用一种或多种化疗剂。在特定方面，约7天一次、约2周一次、约3周一次、约4周一次、约2个月一次、约3个月一次、约4个月一次、约5个月一次，或约6个月一次重复施用一种或多种化疗剂。

V、药物组合物

本公开还提供了药物组合物，其包含用于本公开的方法的表达Fas-嵌合体蛋白的载体。所述药物组合物可被配制用于向哺乳动物(包括人)施用。用于本公开的方法的药物组合物包含药学上可接受的载体，包括例如离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(诸如人血清白蛋白)、缓冲物质(诸如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物)、水、盐或电解质(诸如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶态二氧化硅、三硅酸镁)、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。在一个实施方式中，通过添加生理盐水来配制组合物。

本公开的组合物可以通过任何合适的方法施用，例如，胃肠外(例如，包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术)、心室内、口服、通过吸入喷雾、局部、直肠、经鼻、口腔、阴道或通过植入的贮库。如前所述，所述组合物包含核酸构建体，所述核酸构建体在内皮细胞中包含Fas-嵌合体基因，从而诱导内皮细胞的凋亡。因此，所述组合物可通过抑制肿瘤内皮细胞的新血管形成和/或血管生成来抑制、减少或减小肿瘤或其转移瘤的尺寸。同样，结合核酸构建体使用的VEGF拮抗剂通过直接抑制VEGF活性来抑制新血管形成和/或血管生成。因此，在一个实施方式中，全身性或局部递送联合治疗。对于全身性或局部递送，含有核酸构建体、腺病毒或腺病毒同质群体的药物制剂可利用诸如针、套管或手术器械等机械装置。

用于本公开的方法的组合物的无菌注射形式可以是水性或油性悬浮液。这些悬浮液可以根据本领域已知的技术使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂来配制。无菌可注射制剂也可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如1,3-丁二醇中的悬浮液。可使用的可接受媒介物和溶剂有水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可使用任何温和的不挥发性油，包括合成的单甘油酯或双甘油酯。脂肪酸，诸如油酸及其甘油酯衍生物可用于制备注射剂，天然药学上可接受的油，诸如橄榄油或蓖麻油，尤其是其聚氧乙烯化形式也可用于制备注射剂。这些油溶液或悬浮液还可包含长链醇稀释剂或分散剂，诸如羧甲基纤维素或类似的分散剂，其通常用于药学上可接受的剂型(包括乳剂和悬浮液)的配制。还可将其他常用的表面活性剂，诸如通常用于制备药学上可接受的固体、液体或其他剂型的吐温(Tween)、司盘(Span)和其他乳化剂或生物利用度增强剂用于配制目的。

肠胃外制剂可以是单次推注剂量、输注或负荷推注剂量(loading bolus dose)，然后是维持剂量。这些组合物可以以特定的固定或可变间隔(例如，一天一次或基于“根据需要”)施用。

用于本公开方法的某些药物组合物可以以可接受的剂型(包括例如，胶囊、片剂、水悬浮液或溶液)口服施用。某些药物组合物也可以通过鼻气雾剂或吸入施用。可使用苯甲醇或其他合适的防腐剂、提高生物利用度的吸收促进剂和/或其他常规的增溶剂或分散剂将此类组合物制备为盐溶液。

实施例

实施例1

评估抗PD-L1抗体与VB-111联合治疗转移性Lewis肺癌小鼠的疗效和安全性

目的：本研究的目的是探讨Ad5-PPE-1-3X-Fas-c和抗PD-L1单克隆抗体联合治疗转移性Lewis肺癌小鼠模型的有效性和安全性。

材料：本研究中使用了以下材料：

纯化的抗小鼠CD274(B7-H1、PD-L1)

·货号：BLG-124328、BLG-124329仓鼠IgG

·浓度：2.03mg/ml

·提供者：BIOLEGEND(由ENCO提供)

·物理状态：液体

·批号：8210782

·大小：一瓶25mg，另一瓶5mg

·媒介：PBS

·制备：将抗PD-L1抗体溶解在PBS中至浓度为1mg/ml(每只小鼠200μl，剂量为200μg/小鼠)。

Ad5-PPE-1-3X-Fas-c(VB-111)每只小鼠10⁹个病毒颗粒

·浓度：1×10¹²个病毒颗粒(vp)/ml

·物理状态：液体

·保存条件:≤-65℃，低温瓶中。

·媒介：生理盐水

·制备：瓶在治疗当天解冻并颠倒混合。VB-111(1×10¹²/ml)稀释100倍。(通过采集10μl VB-111(1×10¹²/ml)并加入990μl生理盐水以获得VB-111 1×10¹⁰/ml的浓度)，小鼠已被注射100μl/小鼠以达到(1×10⁹个病毒颗粒/小鼠)。

Ad5-PPE-1-3X-Fas-c(VB-111)每只小鼠10¹¹个病毒颗粒

·浓度：1×10¹²个病毒颗粒(VP)/ml

·物理状态：液体

·保存条件：≤-65℃，低温瓶中。

·媒介：生理盐水

·制备：瓶在治疗当天解冻并颠倒混合。以100μl/小鼠施用VB-111(1×10¹²/ml)，以达到1×10¹¹个病毒颗粒/小鼠。

阴性对照/媒介

·名称：生理盐水

·提供者：LIFE

·物理状态：液体

·批号：G172446

·大小：每瓶含5ml

·保存条件：室温

动物

本研究中使用了12-14周龄的雄性C57BL/6小鼠。按照由国家科学院出版社(华盛顿特区)实验室动物研究所印刷的《实验室动物护理和使用指南》进行小鼠的护理和处理程序。

方法：

除F组(健康未治疗组)外，雄性C57BL/6小鼠(12-14周)在左足垫中注射了50μl的5×10⁵D122细胞。

每5天监测小鼠的肿瘤直径。当肿瘤直径达到5mm时，每天密切注意小鼠直到肿瘤直径达到7mm。将肿瘤直径达到7mm的那一天定为第0天，通过切断术切除原发肿瘤。切断术后，将小鼠随机分成不同的治疗组(图1和表4)。切断术后5天开始治疗。每只动物接受：

A.生理盐水100μl；

B.VB-111(l×10¹¹VP/小鼠，静脉注射100μl)，第5天治疗一次；

C.VB-111(1×10⁹VP/小鼠，静脉注射100μl)，第5天治疗一次；

D.VB-111(1×10⁹VP/小鼠，静脉注射100μl)，第5天治疗一次；以及抗PD-L1抗体(200μg/小鼠，腹腔注射)，第5、8、11天每3天治疗一次；

E.抗PD-L1抗体(200μg/小鼠，IP)，在第5、8、11天每3天治疗一次；或

F.无治疗组(健康组)。

前三个连续死亡从切断术到死亡的平均天数决定了其余动物切断术处死的天数。

以下表4中概述了治疗组。

表4：测试组和剂量水平

疗效评价：记录肺重量，拍照，采集于4％甲醛中。通过减去正常肺重量(0.1526g)，计算肿瘤负荷。通过T检验分析检测的每个参数。

结果：

体重：

所有治疗组之间的平均体重没有显著差异。在生理盐水组和健康组之间观察到显著差异(p<0.05)。

肺重量

与健康组相比，阴性对照、生理盐水处理组的平均肺重量增加了6倍。

用VB-111(1×10¹¹VP/小鼠)治疗表现出最强大的效果，使平均肺重量显著(p≤0.001)减少62％。VB-111在1×10⁹VP/小鼠的较低剂量下使肺重量显著减少36％(p<0.005)，类似于在抗PD-L1治疗后观察到的减少44％(p≤0.001)。然而，VB-111(1×10⁹VP/小鼠)与抗PD-L1联合治疗导致平均肺重量减少58％(p≤0.001)，这类似于与高剂量VB-111(1×10¹¹VP/小鼠)治疗后观察到的比例。VB-111(1×10⁹VP/小鼠)和抗PD-L1联合治疗比VB-111(1×10⁹VP/小鼠)单一疗法更有效(p<0.05)(图2)。

肿瘤负荷

用VB-111(1×10¹¹VP/小鼠)治疗表现出最强大的效果，使平均肿瘤负荷显著(p≤0.00l)减少72％。VB-111在1×10⁹VP/小鼠的较低剂量使平均肿瘤负荷显著减少42％(p<0.005)，并且在抗PD-L1治疗后观察到减少51％(p≤0.001)。然而，将VB-111(1×10⁹VP/小鼠)与抗PD-Ll联合治疗导致显著减少67％(p≤0.001)，类似于用1×10¹¹VP/小鼠的高剂量VB-111治疗后观察到的减少。VB-111(1×10⁹VP/小鼠)和抗PD-L1联合治疗明显比VB-111(1×10⁹VP/小鼠)单一疗法更有效(p<0.05S)(图3)。

结论

在这项研究中，高剂量VB-111(1×10¹¹VP/小鼠)治疗显著降低了LLC小鼠模型的平均肺重量和肿瘤负荷。与抗PD-L1或VB-111(1×10⁹VP/小鼠)单药治疗相比，较低剂量的VB-111(1×10⁹VP/小鼠)与抗PD-L1联合治疗在降低平均肿瘤肺负荷方面表现出优势，并且效果类似于1×10¹¹VP/小鼠的高剂量VB-111单药治疗。

实施例2

评估抗PD-L1抗体与VB-111联合治疗B16F10黑色素瘤小鼠的疗效和安全性

目的：本研究的目的是探讨Ad5-PPE-1-3X-Fas-c和抗PD-L1单克隆抗体联合治疗黑色素瘤小鼠模型的有效性和安全性。

材料：本研究中使用了以下材料：

纯化的抗小鼠CD274(B7-H1,PD-L1)

·货号：BLG-124329，仓鼠IgG

·浓度：2.0mg/ml

·提供者：BIOLEGEND(由ENCO提供)

·物理状态：液体

·批号：B214210

·大小：一瓶25mg

·媒介：PBS

·制备：将抗PD-L1抗体溶解在PBS中至浓度为1mg/ml(每只小鼠200μl，剂量为200μg/小鼠)。

每只小鼠Ad5-PPE-1-3X-Fas-c(VB-111)10¹¹个病毒颗粒

·浓度：1×10¹²个病毒颗粒(vp)/ml

·物理状态：液体

·保存条件：≤-65℃，在低温瓶中

·媒介：生理盐水

·制备：瓶在治疗当天解冻并颠倒混合。以100μl/小鼠施用VB-111(1×10¹²/ml)，以达到1×10¹¹个病毒颗粒/小鼠。

阴性对照/媒介

·名称：生理盐水

·提供者：LIFE

·物理状态：液体

·批号：G172446

·大小：每瓶含5ml

·保存条件：室温

动物

本研究中使用了12-14周龄的雄性C57BL/6小鼠。动物在研究开始时为12-14周龄。按照由国家科学院出版社(华盛顿特区)实验室动物研究所印刷的《实验室动物护理和使用指南》(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)进行小鼠的护理和处理程序。

方法：

将50μl PBS+50μl MATRIGEL中的2×10⁵B16F10细胞皮下注射到雄性C57BL/6小鼠(12-14周)左侧。

每周监测小鼠的肿瘤尺寸三至六次。治疗开始于第9天(“分配日”)，当动物出现肿瘤达到约100mm³时，根据肿瘤尺寸和体重将小鼠随机分配到不同的组(在那个时间点，将未显示任何可测量肿瘤的小鼠或带有液体肿瘤的小鼠排除在外)。每周记录3次小鼠体重数据，每周记录3-6次临床体征。

每只动物接受：

A.生理盐水，静脉注射；

B.VB-111(l×10¹¹VP/小鼠，静脉注射100μl)，第9天治疗一次；

C.抗PD-L1抗体(200μg/小鼠，腹腔注射)，第9、12和14天每2-3天治疗一次；或

D.VB-111(1×10¹¹VP/小鼠，静脉注射100μl)，第9天治疗一次，抗PD-L1抗体(200μg/小鼠，腹腔注射)，第9、12和14天每2-3天治疗一次。

以下表5中概述了治疗组。

表5：试验组和剂量水平

疗效评价：记录个体肿瘤尺寸、拍照并采集于4％甲醛中。

结果：

体重

所有治疗组之间的平均体重没有显著差异。

肿瘤尺寸(mm³)

单独使用VB-111(1×10¹¹VP/小鼠)或单独使用抗PD-L1治疗可适度减少肿瘤尺寸；然而，最强大的效果是在VB-111和抗PD-L1联合治疗之后。从第15天到处死，联合治疗显著降低了平均肿瘤体积。联合治疗的价值在第17天最为显著(图4)。

结论

VB-111(1×10¹¹VP/小鼠)与抗PD-L1联合治疗显示在降低平均肿瘤体积方面优于使用抗PD-L1或VB-111(1×10¹¹VP/小鼠)的单一疗法。

实施例3

对既往治疗过的晚期或转移性非鳞状细胞非小细胞肺癌(NSCLC)患者进行VB-111与纳武单抗联合治疗的I期/II期随机、开放标签、多中心研究

研究设计和治疗计划

这项开放标签研究旨在在患有晚期或转移性非鳞状细胞NSCLC患者中评价VB-111(每两个月静脉注射(IV))与纳武单抗(以每两周3mg/kg输注作为标准护理)联合相比于单独使用纳武单抗的安全性和有效性。该研究将从单臂、多中心、剂量递增的I期部分开始，其中该组合将使用3+3剂量递增模型给予至多12名患者，如果成功，将继续进行进一步纳入随机II期，详情如下。

I期部分：剂量水平1(同期组群1)：VB-111 3×10¹²个病毒颗粒(VPs)+纳武单抗3mg/kg。

图5中描述了I期部分。至少3名受试者将接受静脉输注纳武单抗(3mg/kg)，随后静脉输注VB-111(3×10¹²病毒颗粒(VPs))并观察剂量限制性毒性(DLTs)的发生，持续28天。起初，只招募一名受试者并开始治疗，而另外两名受试者将在第1名受试者开始治疗至少5天后招募。如果在28天期间第一组3名受试者中没有记录到DLT，则同期组群2将开放招募。但是，如果在第一组3名受试者中记录到两次DLT，则试验将终止。如果仅观察到一次DLT，则另外3名受试者将以相同的剂量水平1施用药物，并且将评估DLT长达28天。如果在第二组受试者中观察到一次DLT(即2/6受试者经历DLT)，则试验将终止。否则，第2组将开放招募。

I期部分：剂量水平2(同期组群2)：VB-111 1×10¹³VPs+纳武单抗3mg/kg。

只有在同期组群1的所有患者都完成了28天的观察期并且报告的DLT少于2次之后，才会批准启动同期组群2入组。参见图5。在该同期组群2中，至少3名患者将接受静脉输注纳武单抗(3mg/kg)，随后静脉输注VB-111(1×10¹³VPs)并观察DLT的发生，持续28天。同期组群2的入组安排将与同期组群1的类似：首先，仅招募1名患者并开始治疗，而另外两名患者将在患者1开始治疗日起至少5天后招募。如果在28天期间第一组3名患者中没有记录到DLT，则该剂量将被确定为联合治疗的安全剂量，并用作推荐的II期剂量(RP2D)。但是，如果在第一组3名患者中记录到两次DLT，则试验将终止。如果仅观察到1次DLT，则另外三名患者将以相同的剂量水平2施用药物，并且将评估DLT长达28天。如果在第二组患者中观察到一次DLT(即2/6患者经历DLT)，则试验将终止。否则，将授权本研究的II期部分的招募。

那时，允许患者内剂量递增：即，以剂量水平1治疗的患者可以递增以接受剂量水平2的后续治疗。所有进入I期的患者将在II期试验分析中评价疗效。

DLT的定义：在治疗的前28天内发生的任何与药物相关的(VB-111或纳武单抗)≥3级毒性，不包括以下情况：

·≥3级肝脏或血液学毒性。

·药物可控制的≥3级恶心或呕吐(如果恶心和/或呕吐无法通过药物控制并且发生在28天观察期内，则视为DLT)。

·≥3级低钾血症、低钠血症、低磷血症、低镁血症和低钙血症，如果易于纠正，则临床上无症状并且不伴有具有医学意义的并发症(例如心电图改变)。

·服用VB-111后24小时内发生的3-4级发热事件如果对对症治疗有反应，则不应视为DLT。

·纳武单抗治疗通常预期的3-4级事件(例如皮疹、甲状腺炎、腹泻、肝炎、肾炎、肺炎)并被研究人员认为与纳武单抗有关的事件将不被视为DLT，除非由研究人员确定，与纳武单抗单药治疗毒性相比，它们在等级、程度、持续时间或发作时间上更严重。

在没有DLT的情况下完成28天观察期的患者将在每第四个14天周期的第1天(每56±5天)继续接受VB-111治疗，并在每个14天周期的第1天接受纳武单抗治疗。在使用这两种药物的日子里，将首先使用纳武单抗。这些受访者将根据事件的时间表继续所有的评估和评价。不允许减少VB-111和/或纳武单抗的剂量(只能根据本方案中给出的治疗延迟或停药指南延迟或停药)。

如果本研究报告了DLT，报告DLT的患者将停止研究治疗。应该对DLT的患者和其他停止治疗的患者进行疗效FU(继续FU以进行进一步的抗癌治疗和CT扫描采集)。将根据研究人员的判断对这些患者进行进一步的抗癌治疗。

在28天观察期内因DLT以外的任何原因退出的患者将被接受相同剂量方案治疗的患者所取代。在28天观察期之后发生的AE将被记录为AE，即使它们符合DLT标准。如果在28天观察期后出现符合DLT标准的AE，研究人员将咨询医学监察员以获得具体的安全评估指南。

II期部分：

图6中描述了II期部分。如果同期组群2患者中报告的DLT少于2次，则将启动II期部分并开放招募新患者。在研究的这一部分中，将使用集中随机化程序以1:1的比例，将患者随机分到两个治疗组之一(研究组或对照组)，接受以下治疗：

第1臂(VB-111与纳武单抗联合)：

·VB-111剂量为1×10¹³VPs(RP2D)，在第1天和每第4个14天周期(每56天±5天)作为静脉输注施用。

·纳武单抗，在每个14天周期的第1天以3mg/kg静脉输注作为标准护理施用。

第2臂(仅纳武单抗)：

·纳武单抗，在每个14天周期的第1天以3mg/kg静脉输注作为标准护理施用。

在这项研究中，一个周期的长度将为14天。研究药物的首剂应在随机化后48小时内施用。在施用这两种药物的日子里，将首先施用纳武单抗。不允许减少VB-111和/或纳武单抗的剂量(只能根据本方案中给出的治疗延迟或停药指南延迟或停药)。此外，从对照组到联合组不会有交叉。参见图6。

随机化将按以下分层因素进行分层：

·PD-L1表达水平<1％对≥1％

·吸烟状况：既往轻度吸烟者或不吸烟者对吸烟者

ο不吸烟者，定义为一生吸烟≤100支的患者；

ο既往轻度吸烟者，定义为吸烟量>100支且≤10年包且在入组前戒烟≥1年的受试者；

·性别：男对女。

研究治疗持续时间

在研究的两个期(I期和II期)中，治疗将持续到患者出现不可接受的治疗相关毒性、直到确认疾病进展(PD)(如irRECIST所定义)或其他原因(例如，撤回同意、研究人员的判断、疾病进展不符合研究人员判断的停药标准)。如果患者因确诊的PD而停止治疗，则研究治疗将被视为完成。因任何其他原因停止治疗将被视为不完全治疗，并记录为“停止治疗”。

在完成或停止研究治疗后，患者将根据医生的判断进行治疗。将尽一切努力采集治疗后扫描(按照护理标准进行)、后续抗癌治疗的信息和患者报告的结果测量，直至死亡、撤回同意或失访，时间间隔由标准规定限定。对于因PD以外的原因停止研究治疗的患者，应每8周(±7天)进行一次随访扫描，直至PD、撤销同意、死亡、失访。

招募和退出

不允许偏离任何纳入或排除标准，因为偏离可能会危及研究的科学完整性、监管可接受性或受试者安全。因此，必须遵守协议中规定的标准。任何有关受试者资格的问题都应在注册前与申办者讨论。

受试者纳入标准。为了有资格参加本研究，受试者必须满足以下所有标准：

在开始任何特定于研究的程序和治疗之前获得签署的知情同意书，以确认患者对遵守研究要求的意识和意愿。

≥18岁的女性或男性患者。

患者具有IV期或III期组织学证明的非鳞状细胞非小细胞肺癌(NSCLC)，或患有复发性疾病且不是治愈性治疗的候选者，而是将二线纳武单抗作为治疗标准的晚期疾病的候选者。

用于晚期或转移性NSCLC的一种先前基于铂双药的化疗方案期间/之后的疾病复发或进展。如果疾病在最后一次铂类治疗后6个月内复发，则早期疾病的先前治疗(佐剂或新佐剂)可算作IV期的一线治疗。

根据实体瘤的反应评价标准(RECIST)1.1，通过计算机断层扫描(CT)可测量的疾病，在研究药物首次施用前28天内进行。目标病变可能位于先前照射过的区域，如果该部位有记录的疾病进展。

东部合作肿瘤组(ECOG)体能状态≤1。

根据以下标准具有足够的肾、肝和骨髓功能：

·中性粒细胞绝对计数≥1500个细胞/μl

·血红蛋白≥9.0g/dL

·血小板≥100,000个细胞/μl

·总胆红素≤正常上限(ULN)的1.5倍，吉尔伯特综合征患者除外，总胆红素必须<3.0mg/dL，

·天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)≤2.5×ULN。

·对于肌酐水平高于正常范围的患者，血清肌酐水平≤1.5ULN或肌酐清除率≥40ml/min(肌酐清除率通过Cockcroft-Gault公式计算)。

·凝血酶原时间(PT)、部分凝血活酶时间(PTT)(以秒为单位)不得延长超过ULN的20％以上，除非由于使用抗凝剂；

预期寿命≥12周。

必须在首次施用研究药物前至少4周完成包括显著肺容积在内的放疗(例如，V20为10％或更大)。必须在首次施用研究药物前至少2周完成不包括显著肺容积的放疗。

必须在首次施用研究药物前至少4周使用先前的化疗和/或研究药物。

性活跃的育龄女性(WOCBP)或与WOCBP性活跃的男性必须在研究过程中使用第10.6.3节中定义的有效节育方法，以失败风险最小化的方式。在纳入研究之前，必须告知有生育能力的女性在参与试验期间避免怀孕的重要性以及意外怀孕的潜在风险因素。所有有生育能力的妇女必须在第一次施用前7天内进行阴性妊娠试验。

受试者排除标准：符合以下任一标准的受试者将被排除在本研究之外：

在研究治疗首次施用前12个月内，有活动性或近期已知或疑似自身免疫性疾病病史且需要全身治疗的患者。允许纳入患有1型糖尿病、仅由自身免疫性甲状腺炎引起的残留甲状腺功能减退、需要激素替代或不需要全身治疗的皮肤病(白癜风、银屑病或脱发)的患者。

在首次施用研究治疗前14天内，患有需要使用皮质类固醇(每日>10mg泼尼松等效物)或其他免疫抑制药物进行全身治疗的疾病的患者。在没有活动性自身免疫性疾病的情况下，允许吸入或局部使用类固醇。

根据受试者的医疗记录，存在激活的EGFR突变或ALK基因重排。

NSCLC与小细胞肺癌病理上混合。

先前使用抗程序性死亡蛋白1(PD-1)、抗程序性细胞死亡配体1(PD-L1)、抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)抗体或任何其他抗体或药物进行治疗，靶向T细胞共刺激或检查点通路。

所有归因于先前抗癌治疗的毒性(脱发、疲劳和2级周围神经病变除外)必须在研究药物施用前解决至1级(NCT CTCAE第4版)或基线。

诊断为临床相关间质性肺病的患者。

已知的人类免疫缺陷病毒(HIV)检测呈阳性史或已知的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。

在筛选前6个月内乙型肝炎病毒表面抗原(HBV sAg)或丙型肝炎病毒核糖核酸(HCV RNA)检测呈阳性，表明存在急性或慢性活动性感染。注意：HBV血清学阳性表明既往接触过但没有证据表明为活动性感染(例如阴性PCR)的患者是合格的。

对其他单克隆抗体的严重超敏反应史。

入组前5年内有其他临床活动性恶性肿瘤病史，转移或死亡风险可忽略不计的肿瘤除外，诸如浅表切除的基底细胞癌或皮肤鳞状细胞癌或局部消融/切除的原位癌子宫颈或乳房。

在研究开始前4周内进行过大手术(包括开放活检)，或预计在研究治疗期间需要进行大手术。患者必须在首次施用研究治疗前至少14天从大手术或重大外伤的影响中恢复。

在首次研究治疗前24小时内进行小型外科手术。

母乳喂养的妇女。

纽约心脏协会(NYHA)二级或更严重的充血性心力衰竭。

研究治疗首次施用前6个月内有心肌梗塞或不稳定型心绞痛病史。

研究治疗首次施用前6个月内有中风或短暂性脑缺血发作史。

研究治疗首次施用前6个月内有咯血史(每次发作≥1/2茶匙鲜红色血液)。

患有已知增殖性和/或血管性视网膜病变的患者(例如糖尿病患者)。

已知的CNS疾病，治疗后的脑转移除外：治疗后的脑转移被定义为在治疗后至少4周没有进展的证据或出血≤1级(NCT CTCAE第4版)，在筛选期间通过临床检查和脑部MRI确定时期。CNS转移必须是无症状的，并且患者在研究治疗开始前至少2周神经学恢复到基线。此外，患者必须停用皮质类固醇，或使用稳定或递减剂量每日≤10mg的泼尼松(或等效物)。在入组前3个月内接受神经外科切除术或脑活检治疗的CNS转移患者将被排除在外。

研究治疗首次施用前6个月内发生重大血管疾病(例如，主动脉瘤、需要手术修复或近期外周动脉血栓形成)。注意：允许稳定的外周血管疾病。

出血素质或显著凝血功能障碍的临床证据(在没有治疗性抗凝治疗的情况下)。

研究药物首次施用前一年内有腹部瘘管或胃肠道穿孔病史。

严重的、不愈合的伤口、活动性溃疡或未经治疗的骨折。

在过去4周内接受酪氨酸激酶抑制剂(TKI)或6周内接受基于抗体的治疗，接受抗血管生成治疗的受试者。注意：在4周的洗脱期后，允许预先进行贝伐单抗治疗。

肿瘤侵犯大血管(主动脉、腔静脉、主肺血管等)或心包或心脏。

禁止治疗和/或限制治疗：

·正在进行或计划使用除本研究中指定的那些以外的抗癌疗法。

·强CYP3A4抑制剂。

用VB-111预先处理

任何其他严重或不受控制的躯体疾病、活动性感染、体格检查结果、实验室检查结果、精神状态改变或精神病症，在研究人员看来，会限制受试者遵守要求的能力，显著增加患者风险，或影响研究结果的可解释性。

无法遵守研究和/或后续程序。

治疗分配程序

研究人员必须筛选所有可能参与研究的受试者以确定受试者的资格。在进行任何筛选程序之前，必须获得书面知情同意书。受试者签署知情同意书(ICF)后，将分配一个唯一编号。所有受试者都将通过这个指定的编号和他们的姓名首字母来识别。唯一的受试者识别号由四位数字构成，第一和第二位数字表示研究地点，第三和第四位数字表示受试者在该地点的编号。第一个纳入的受试者将是受试者编号01，第二个为02，依此类推。

筛选期间任何阶段未能达到招募标准的受试者定义为筛选失败。所有筛选失败都将记录在筛选日志中，包括筛选失败的原因。根据ICH GCP指南，筛选日志将保存在研究人员的站点文件中。研究的II期部分筛网失败率估计为10％，退出率估计为2％。因此，预计将筛选多达112名受试者以达到100名招募受试者的目标数量，确保每组至少50名可评价受试者。

这项开放标签试验的II期部分将包括随机化(1:1)到治疗组、第1组或第2组。将使用集中随机化程序。

随机化将按以下分层因素进行分层：

·PD-L1表达水平：<1％对≥1％

·吸烟状况：既往轻度吸烟者或不吸烟者对吸烟者

ο不吸烟者，定义为一生吸烟≤100支的患者

ο既往轻度吸烟者，定义为吸烟量大于100支且≤10年包且在入组前戒烟≥1年的患者

·性别：男对女。

研究干预

VB-111产品说明

Ofranergene Obadenovec VB-111配方：VB-111被配制成无菌载体溶液。该溶液以冷冻(低于65℃)的形式提供，一次性使用，10ml玻璃小瓶。每个小瓶含有5mL病毒滴度为10¹²VP/ml的载体和媒介物(磷酸盐缓冲生理盐水中含10％甘油)。载体溶液应解冻并保持在2-8℃直至稀释，并保持在室温直至施用。

Ofranergene Obadenovec VB-111供应：研究药物包装在一个小的密封纸盒中：每盒6瓶。研究地点将提供足够数量的VB-111来治疗受试者。研究药物将在适当的储存条件下被运送到指定的收件人(药剂师或其他指定人员，根据研究中心的规定)。每次交付都必须得到收件人的确认。药剂师或其指定人员将以相关剂量向研究人员配发药物。

药剂师或指定人员将保存配药日志，他/她将在其中记录为每位患者配发的研究用产品的日期和数量。清单文件将提供给研究监督员，他们将在研究过程中核实责任认定和核实剂量。在研究期间，所有使用过和未使用的容器都将被清点，如果申办者同意，将返回申办者处销毁或现场销毁。将提供销毁的书面确认。

Ofranergene Obadenovec VB-111储存和稳定性：VB-111的稳定性研究正在进行中，迄今为止支持在65℃以下保存48个月。保质期将在随准备的每批药物装运的文件中描述。VB-111小瓶应储存在冷冻的密闭小瓶中(低于65℃)。

Ofranergene Obadenovec VB-111制备：VB-111制备如下表所示：

表6：Ofranergene Obadenovec VB-111制备

*药剂师既可以使用无菌空袋，也可以单独向袋中加入40ml生理盐水(NS)+10mlVB-111；或使用一袋50ml的NS并去除多余的体积，然后添加VB-111。

**对于<50kg的受试者，35/11.5ml表示VB-111减少30％。

药物制备的全过程应在室温下在生物安全柜(BSC)II型中进行。解冻后，应尽快将药物在室温生理盐水中稀释。注意，如果需要，药物可以在稀释前在冰上保存长达3小时。一旦药物在生理盐水中形成最终配方，保持在室温下。

VB-111剂量和施用：VB-111将以3ml/min的速率在每四个治疗周期的第1天(56±5天)静脉内施用。服用VB-111前无需禁食。可以使用输液泵。在同时使用纳武单抗和VB-111的日子和同期组群中，将首先使用纳武单抗。

在室温下，药物在生理盐水中的最长时间为60分钟(加上30分钟的窗口)。体重低于50kg的患者将接受减少剂量的VB-111，如表6所示。

在患者同时接受VB-111和纳武单抗治疗的施用日，应在VB-111之前制备并施用纳武单抗。这是基于作为安全预防措施应最后给予调查人员的范例。没有预料到这两种药物的药理学会出现依赖于顺序的改变。尽管预计这将在纳武单抗后立即(1小时内)进行，但如果有临床指征，也可以稍后(24小时内)施用，如果需要更长时间，请与申办者的医疗监察员讨论。

纳武单抗产品声明

纳武单抗制剂、剂量和施用：纳武单抗是一种全人源单克隆抗体，适用于治疗转移性非小细胞肺癌、在铂类化疗中或化疗后具有进展的患者。该抗体阻断程序性死亡受体-1(PD-1)活性，导致肿瘤生长减少。

纳武单抗是一种无菌、不含防腐剂、无热原、透明至乳白色、无色至淡黄色液体，可能含有少量(很少)颗粒。用于静脉输注的纳武单抗注射液以一次性小瓶形式提供(40mg/4mL或100mg/10mL溶液)。每ml纳武单抗溶液含有纳武单抗10mg、甘露醇(30mg)、喷替酸(0.008mg)、聚山梨醇酯80(0.2mg)、氯化钠(2.92mg)、柠檬酸钠二水合物(5.88mg)和注射用水，美国药典。可能含有盐酸和/或氢氧化钠以将pH值调节至6。

在每14天周期的第1天，将在60分钟内静脉内施用3mg/kg剂量。输液将通过含有无菌、无热原、低蛋白结合在线过滤器(孔径为0.2微米至1.2微米)的静脉管线进行。不要通过同一静脉管线共同施用其他药物。输液结束时冲洗静脉管线。

纳武单抗获取：纳武单抗将作为患者标准护理治疗的一部分开具处方。

纳武单抗储存和稳定性：该产品不含防腐剂。制备好后，储存纳武单抗输液：

·从制备时间开始不超过4小时，将纳武单抗输液室温储存。这包括输液在IV容器中的室温储存和输液施用的时间，或者

·在2℃至8℃(36℉-46℉)的冷藏条件下，从制备输液起不超过24小时。

不要冻结。

VB-111的术前用药

退热治疗：将在VB-111施用前1-2小时施用对乙酰氨基酚(900-1000mg)，然后根据需要在施用后至多36小时施用450-500mg对乙酰氨基酚。

皮质类固醇治疗：对于服用VB-111后出现3级发热的受试者，或由研究人员自行决定，可在施用前30分钟(治疗前最多3小时，但不早于20分钟)给予地塞米松10mg，随后施用VB-111剂量。将根据研究人员的判断进行进一步的皮质类固醇治疗。

纳武单抗无需术前用药。

人群：最多112名符合资格标准的先前治疗过的晚期或转移性非鳞状细胞NSCLC受试者(≥18岁)将被纳入研究。I期：将招募最少6名和最多12名患者。II期：将招募100名患者并随机分配(1:1)到两个治疗组之一(每组50名患者)。

站点数量：I期：以色列的两个站点；II期：视需要增设站点。

研究目标：安全性：与单独使用纳武单抗相比，在晚期或转移性非鳞状细胞NSCLC患者中检查静脉注射VB-111和纳武单抗联合的安全性和耐受性。疗效：评价静脉注射VB-111和纳武单抗联合相比于单独使用纳武单抗，在晚期或转移性非鳞状细胞NSCLC患者中的疗效。

研究终点：

安全性终点：将根据DLT、AE、严重不良事件(SAE)、受试者临床状态和治疗期间定期采集的标准实验室检测结果和停止治疗后长达60天，对治疗安全性和耐受性进行评价。安全性评价将包括：

·医疗面谈

·不良事件的监测和评估

·体检

·生命体征

·心电图

·实验室测量——临床化学、血液学、尿液分析。

将使用美国国家癌症研究所的不良事件通用术语标准对不良事件的严重性/强度进行分级。

疗效终点：

主要终点：

·RECIST 1.1的受试者反应率(ORR)

次要终点：

·总生存期(OS)

·OS率(随机化后12个月)

·irRECIST定义的ORR

·受试者反应持续时间(DOR)

·反应时间(TTR)

·无进展生存(PFS)

·PFS率(随机化后12个月)

探索性和子研究终点：

·OS(月)作为治疗前PD-L1表达的函数

·PFS(月)作为治疗前PD-L1表达的函数

·ORR作为治疗前PD-L1表达的函数

·患者报告的结果：肺癌症状量表(LCSS)

·发生至少一次治疗后发热的患者亚组与未发生发热的患者亚组的主要和次要疗效终点的比较。

将从所有患者中采集以下样本，用于探索性分析：

·用于组织病理学的存档肿瘤组织

·如果研究人员确定在临床上需要活检作为研究患者参与期间或研究药物停药后3个月内标准护理治疗的一部分，活检样本可用于进一步检测组织病理学，以获得抗肿瘤活性的证据、免疫治疗活性和病毒转基因。

研究程序/评价

病史和受试者状态：将通过面谈或根据筛选访视时和从第2周期开始的每个14天周期的第1天的医疗记录获得相关病史和用药史。数据采集将确认组织学诊断和PD-L1蛋白表达(研究注册前的最新检测)，并将重点关注以前的相关医疗状况和治疗、伴随药物和并发疾病。将审查医疗记录以记录禁忌症。此外，受试者将被要求提供当前或计划的药物(处方药和非处方药)和程序的清单。在筛选访视时，将从所有符合条件的患者中采集存档肿瘤组织。

体格检查：将在第一个治疗周期的第1天前7天内、每个14天治疗周期的第1天和研究药物最后一次施用后30±7天进行体格检查。每次体检都会测量体重，而身高只会在筛查体检时测量。

生命体征和氧饱和度：将在第一个治疗周期的第1天前7天内测量生命体征和氧饱和度，然后在第1周期的第1天和第8天测量。从第2周期开始，将在每个14天治疗周期的第1天和研究药物最后一次施用后30±7天测量这些参数。

每次施用前30分钟(+/-5分钟)、每次施用后30分钟(+/-5分钟)以及在仅施用第一剂VB-1114小时(+/-5分钟)和6小时(+/-60分钟)时，将记录血压、体温、呼吸和心率、脉搏血氧饱和度(并将监测补充氧气量，如果适用)。这些参数也将在受试者出现任何新的或恶化的呼吸道症状时被记录下来。

存档肿瘤组织：将尽一切努力从先前的手术中获取和提交组织用于相关研究。在随机化后30天内提交存档的组织或载玻片(请参阅研究实验室参考手册)。样品将进行免疫组织化学染色，使用抗CD4和CD8T细胞的抗体。VBL保留扩展分析以进行附加测试的选项，以支持进一步阐明作用机制并确定可能对VB-111有反应的患者亚群。

可选的新鲜活检样本：如果研究人员确定在临床上需要活检作为研究患者参与期间或研究药物停药后3个月内的标准护理治疗的一部分，则这些活检样本可用于VBL的进一步测试(对于抗肿瘤活性和免疫治疗活性和病毒转基因的证据)。如果采集了一个组织样本，剩余的组织将被制备成3个样本：

·一部分组织(～60mL)将被立即放入30mL的10％福尔马林中，并在采集后一周内将在环境条件下运送到VBL进行处理，最好在块制备后进行处理。样品将在环境条件下储存在VBL或VBL指定的中心实验室。

·将组织的两部分制备成新鲜的碎片，立即在两个2ml的冷冻管中在液氮中快速冷冻，然后冷冻运送到VBL。冷冻样品将每三个月与干冰一起在环境条件下运送到VBL，并将储存在中央实验室的-70℃或以下的无霜冰箱中。

在其他检测(抗肿瘤活性和免疫治疗活性)中，VBL还将探索和验证病毒转基因在肿瘤组织中的存在和表达。将使用DNA和/或RNA分离试剂盒从新鲜冷冻组织样本中提取DNA和/或RNA。将通过PCR检测DNA样品，了解组织中插入的病毒转基因序列的存在。将通过PCR检测RNA样品，了解组织中的病毒转基因表达。

ECOG表现状态：将在第一个治疗周期第1天的7天内、每个14天治疗周期的第1天和研究药物最后一次施用后30±7天进行评价。

心电图：将在第1周期第1天的7天内和最后一次施用后30±7天内进行12导联ECG。研究人员将报告心电图是正常还是异常及其临床意义。筛选时发现的所有临床显著异常应作为病史记录在CRF中。

临床实验室评价：将根据当地护理标准和临床适应症在当地实验室进行资格、安全性和治疗影响的实验室测试，结果将记录在研究数据库中。在接收研究药物运输之前，应向CRO提供所有测试参数的当地实验室参考范围和相关实验室证书。

血液学：将在第1个周期开始后7天内、第1个周期的第1天和第8天、每个后续14天周期的第1天和最后一次施用后30±7天(始终在施用前)进行血液学评估。全血细胞计数(CBC)将包括对血红蛋白、血细胞比容、白细胞(WBC)的评估，并通过完整的手动或自动分类(总中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞；绝对值或百分比均可)、红细胞(RBC)、血小板计数和红细胞沉降率(ESR)

生化：将在第1个周期开始后7天内、第1个周期的第1天和第8天、每个后续14天周期的第1天和最后一次施用后30±7天(始终在施用前)进行生化评估。评估将包括评价综合代谢组(丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、白蛋白、钙、镁、钠、钾、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、总胆红素、肌酐)、肌酐清除率、差异总蛋白、尿酸、尿素(BUN)、葡萄糖和国际标准化比值(INR)。必须在施用前72小时内获得肝功能检查结果(可在施用当天完成，但不得超过施用前3天)。

甲状腺功能：将在第1个周期的第1天、每个第二个治疗周期的第1天(即每4周)和最后一次施用后30±7天评估甲状腺功能。将评估TSH，如果记录任何异常，也将测量对T3和游离T4的反射。

尿液分析：将在第一次治疗后7天内、每个治疗周期的第1天、从治疗周期2开始和最后一次施用后30±7天进行评估一般尿液分析。检测将包括根据当地标准进行的蛋白尿检测。如果出现新的或增加的蛋白尿，可能需要采集24小时尿液。+2试纸结果需要24小时采集，而+3试纸结果需要保留研究药物和24小时采集。存在肌酐升高的脓尿需要评估可能的肾炎。

凝血功能：将在第一次治疗剂量的7天内、在每个治疗周期的第1天、从第2治疗周期开始、以及最后一次剂量后的30±7天进行评估凝血酶原时间(PT)和部分凝血活酶时间(PTT)(以秒为单位)。延长超过ULN的20％，将需要暂停VB-111施用，除非调查员认为增加是由于抗凝剂的使用。

妊娠试验：将在开始第一次治疗前7天内对具有生育潜力的女性进行血清或尿液hCG妊娠试验。将在施用前每第二个治疗周期(每28天)的第1天进行随后检测。在给予VB-111治疗之前，必须获得阴性结果。由于以下原因之一而无法怀孕的妇女不需要进行妊娠试验：

·医疗保健提供者确认更年期

·该女性的子宫或双侧卵巢或双侧输卵管均已切除

计算机断层扫描(CT)：将在首次研究剂量的28天内和每四个治疗周期的第1天(每8周±5天)采集胸部、腹部和骨盆以及筛查和治疗期间正在监测的任何区域以及已知或疑似疾病(包括CNS)的其他部位的CT扫描。停止研究药物治疗后，将尽一切努力采集治疗后扫描，直至死亡、撤回同意或失访。对于因PD以外的原因停止研究治疗的患者，将根据护理标准每8周(±7天)进行一次随访扫描，直至PD、撤回同意、死亡、失访。将通过机构标准CT进行筛选时的肿瘤评估。肿瘤评估方法应在所有访视过程中保持一致，并执行直至疾病进展。在整个研究过程中，研究人员将根据RECIST1.1和irRECIST评估患者的疾病反应或进展。CT扫描将被采集用于中央实验室审查，但仅适用于研究的II期部分的患者，并且仅在“采集和存储”的基础上进行。每个CT都需要采集CD并将其存储在患者的档案中，以供申办者以后分析。同时和正在进行的研究过程中，研究人员将阅读和分析CT。在研究期间根据实时扫描确定反应的责任将不在于核心阅读者。

患者报告的结果：患者将在第1个周期的第1天、每第四个周期的第1天(每8周±5天)和最后一次施用后第30±7天完成肺癌症状量表(LCSS)。此后，将尽一切努力每8周±7天完成一次治疗后LCSS，直至死亡、撤回同意或失访。一般而言，患者将被要求在任何研究程序和研究治疗之前完成LCSS。

研究时间表

筛选(第-1至-28天)

一旦受试者签署知情同意书(ICF)，特定受试者的筛选期就开始了。在进行任何特定于协议的测试或程序之前，必须获得书面知情同意。获得知情同意后，将在计划开始治疗后28天内进行筛选评估，但如下所示在开始治疗后7天内进行的测试除外。在ICF之前进行的护理测试标准，包括身体检查和血液检查，可用于筛查。

筛选时将分配一个唯一的受试者编号，用于在整个临床研究中识别受试者，并且必须在与该受试者相关的所有研究文件中使用该编号。

在筛选访视时将进行以下评估：

·在ICF上获得并记录潜在受试者的同意

·通过面谈和/或病历审查获取病史，以确定资格

·通过面谈和/或病历审查用药史以确定资格

·从符合资格标准的患者中获取存档肿瘤组织。

·根据RECIST 1.1指南评估肿瘤状态

必须在第一次施用前不超过7天进行以下测试：

·进行全身体检，包括体重、身高、生命体征和氧饱和度

·进行12导联心电图

·评估ECOG表现状态

·进行血液学、生化、凝血、甲状腺功能和尿液分析测试。

·在适用的情况下，对有生育能力的女性进行尿妊娠试验。

研究访视

第1周期，第1天–基线

·审查并记录伴随用药以确认资格

·测量生命体征和氧饱和度

·进行血液学、生化和甲状腺功能测试

·让患者完成LCSS问卷

·如果需要，进行肿瘤活检。

·根据纳入/排除标准确认资格

·施用第一剂研究治疗药物。接受纳武单抗和VB-111二者的患者，首先输注纳武单抗。

·记录不良事件

第1周期，第8天(±1天)

·审查并记录伴随用药

·记录不良事件

·测量生命体征和氧饱和度

·进行血液学和生化、凝血、甲状腺功能和尿液分析测试·如果需要，进行肿瘤活检。

第2周期及以上，第1天(±5天)

·评估受试者报告的或研究人员观察到的不良事件

·审查并记录伴随用药

·进行全身体检，包括体重、生命体征和氧饱和度

·评估ECOG表现状态

·进行血液学、生化、甲状腺功能、凝血、尿液分析测试。

·对有生育能力的女性进行血清或尿液妊娠试验(每个第二周期)。

·如果需要，进行肿瘤活检。

·施用研究治疗。

仅每个第四周期执行(第4、8、12周期等)：

·在进行任何其他测试或程序之前，让患者完成LCSS问卷

·根据RECIST 1.1和irRECIST指南采集CT扫描并评估肿瘤反应

·记录受试者报告的或研究人员观察到的不良事件

·记录伴随用药

研究完成访视–最后一次施用后30天(±7天)

·记录受试者报告的或研究人员观察到的不良事件。AE记录将持续到最后一次施用后60天。

·记录伴随用药

·在进行任何其他测试或程序之前，让患者完成LCSS问卷

·进行体格检查，包括体重、生命体征和氧饱和度

·评估ECOG表现状态

·进行心电图

·采集血液样本进行血液学、生化、甲状腺功能、凝血测试。

·采集尿液进行尿液分析

研究后监测–停药后每8周(±7天)

将尽一切努力继续对所有接受治疗的患者进行随访，直至死亡、撤回同意或失访。

·记录受试者报告的或研究人员观察到的不良事件(仅在最后一次施用后最多60天)

·记录任何进一步的抗癌疗法

·让患者完成LCSS问卷

·根据RECIST 1.1和irRECIST指南采集CT扫描并评估肿瘤反应

·可通过电话采集生命体征。

效力评价标准

反应参数–RECIST1.1:

可测量的疾病定义为至少一个可以在至少一个维度(要记录的最长直径)上准确测量的病变。每个病变的最长直径必须为10mm，通过CT扫描使用造影剂测量。CT扫描层厚应不大于5mm。应在每个时间点进行胸部、腹部和盆腔CT。在整个研究过程中，应使用相同的方法进行肿瘤评估。

如果恶性淋巴结的短轴>15mm，则应将其视为可测量的疾病。

每个器官最多2个病变和总共代表所有受累器官的5个病变的所有可测量病变应确定为目标病变，并将在基线记录和测量。

目标病变的选择应基于其大小(具有最长直径的病变)，代表所有涉及的器官，以及它们是否适合通过一种一致的评估方法(通过成像技术或临床)进行准确可重复的重复测量。将计算所有目标病变的最长直径(LD)的总和并将其报告为基线总和LD。

所有其他病变(或疾病部位)都应确定为非目标病变，也应在基线时记录。不需要测量，这些病变应按照“存在”、“不存在”或“明确进展”进行跟踪。

所有疾病状态的基线评价都应在尽可能接近治疗开始时进行，并且不得超过治疗开始前4周。

反应标准：随访需要测量每个目标病变的最长直径。对于淋巴结，需要测量最小直径以进行随访。这些直径总和的变化提供了对肿瘤尺寸变化因而治疗疗效变化的一些估计。必须使用与基线相同的技术来评估所有病变。

完全反应(CR)：是所有目标和非目标病变消失并且没有新病变的证据。任何病理性淋巴结的短轴都必须减少到<10mm。CR必须通过两次疾病评估记录，至少相隔4周。

部分反应(PR)：以LD的基线总和为参考，所有目标可测量病变的最长直径(LD)总和至少减少30％。不可能有非目标病变的明确进展，也没有新的病变。需要至少相隔4周的两次疾病评估文件。如果唯一的目标病变是通过体格检查测量的孤立性盆腔肿块，而辐照射线无法测量，则需要将LD降低50％。

进展性疾病(PD)：以最小总LD为参考，目标病变的LD总和至少增加20％。总和必须证明绝对增加至少5mm。一个或多个新病变的出现也被认为是增加的疾病。治疗医师认为，在研究开始12周内，现有非目标病变的明确进展，除了胸腔积液，没有肿瘤起源的细胞学证据，也被认为是增加疾病(在这种情况下，必须提供解释)。如果唯一的目标病变是通过体格检查测量的孤立性盆腔肿块，而辐照射线无法测量，则需要将LD增加50％。

病情稳定：是指任何不符合上述标准的情况。

反应无法评价：定义为在开始研究治疗后没有因与疾病症状或体征无关的原因重复进行肿瘤评估。

反应参数—irRECIST标准：

除了使用RECIST 1.1标准进行评价之外，RECIST的免疫反应改编将应用于该试验。在本研究中，每个CT都应评价RECIST 1.1和irRECIST。irRECIST将用于有关治疗继续/中断的决定。irRECIST和RECIST标准的本质区别如下：

·新的可测量病变不一定构成进展性疾病，它们应该被添加到总肿瘤负荷中。新的不可测量的病变不构成疾病进展，但会阻止irCR的确定。

·在没有与临床恶化一致的症状的情况下，应在4周后确认明显的疾病进展。

在基线处，测量所有目标病变(每个器官最多2个病变，总共最多5个病变)的最长直径总和(SumD)。在随后的每次肿瘤评估(TA)中，目标病变和新的可测量病变的SumD(最长直径≥10mm[淋巴结最短直径≥15mm]；每个器官最多2个新病变，总共5个新病变)相加得到总可测量肿瘤负荷(TMTB)：TMTB＝SumD目标病变+SumD新的可测量病变。

每个评估时间点TMTB的百分比变化描述了新旧可测量病变出现时的大小和生长动力学。在每次肿瘤评估中，目标和新的可测量病变的反应根据TMTB的变化(排除irPD后)定义如下：

完全反应(irCR)：所有目标和新的、可测量的病变完全消失，但淋巴结必须减少到短轴<10mm

部分反应(irPR)：相对于基线，TMTB降低≥30％(见下文)

病情稳定(irSD)：不符合irCR或irPR的标准，没有irPD

进展性疾病(irPD)：相对于最低点，TMTB增加≥20％。除非出现快速的临床恶化，否则应通过从初始irPD记录起≥4周获得的第二次连续扫描来确认irPD。一旦确认，irPD日期将被视为初始irPD记录的日期。

根据irRECIST的总体反应来自可测量病变(基于TMTB)中的反应和任何不可测量病变的存在。

反应的附加参数

总生存期是观察到的从第一次使用VB-111到死亡或最后一次接触的生命长度。

无进展生存期(可测量的疾病研究)是从第一次使用VB-111到疾病进展、死亡或最后一次接触的日期。

总体反应率(ORR)是完全反应[CR]和部分反应[PR]的比例

反应持续时间(DOR)是从PR或更好的第一个证据到确认PD或因任何原因死亡的时间。将计算达到CR或PR的受试者的DOR。

反应时间(TTR)是从开始治疗到记录的PR或更好的时间。

统计方法

采集到的所有数据都将被汇总和呈现。连续变量将被描述为平均值、中值、标准偏差和n个观测值的范围。将使用列联表对分类数据进行描述，包括频率和百分比。将生成并呈现所有数据的个体受试者列表。将在两侧5％的水平上进行比较治疗组的统计检验。将使用R版本3.4.3(R开发核心团队。奥地利维也纳)进行统计描述和分析。

研究人群：安全人群将包括接受至少一剂研究药物的所有受试者。所有安全性分析都将在安全性人群中进行。改良治疗意向(mITT)人群将包括来自安全性人群的所有受试者，这些受试者至少进行了一次基线后疗效测量(RECIST 1.1)。将对mITT人群进行疗效分析。此外，单独的分析将包括mITT受试者和来自研究第I部分的受试者。

人口统计学和基线参数：将总体上并按治疗组对人口统计学和基线参数进行总结。将通过描述性统计对所有连续变量进行总结。所有离散变量都将按频率和百分比进行汇总。

研究持续时间和依从性：将汇总所有研究药物施用和依从性数据。

先前和伴随用药：所有相关的先前用药和所有伴随用药将按频率和百分比进行总结。所有药物都将使用世界卫生组织(WHO)药物词典进行编码。

特定实施方式的前述描述将如此充分地揭示本发明的一般性质，以至于其他人可以通过应用本领域技术内的知识，容易地修改和/或适应这些特定实施方式的各种应用，而无需过度实验，而不会背离从本公开的一般概念。因此，基于本文中呈现的教导和指导，此类修改和修改旨在处于所公开实施方式的等效物的含义和范围内。应当理解，本文中的措辞或术语是为了描述而非限制的目的，使得本说明书的术语或措辞将由本领域技术人员根据教导和指导来解释。

实施例4

VB-111联合纳武单抗治疗转移性结直肠癌(mCRC)的II期试验。

背景：

遗憾的是，胃肠道癌症中基于免疫的方法——除了微卫星不稳定(MSI-H)疾病和胃癌中的免疫检查点抑制显著例外——基本上没有成功。其原因尚不清楚，但无疑与以下事实有关：在晚期疾病中，胃肠道癌症似乎免疫原性较低，这可以通过缺乏T期发展的浸润淋巴细胞以及免疫抑制性肿瘤微环境来证明。

·VB-111是一种抗血管生成剂，包含非复制性E1缺失的5型腺病毒，其中含有修饰的鼠内皮素原(PPE)启动子和Fas嵌合体转基因

·VB-111已经过测试，并在胶质母细胞瘤、卵巢和甲状腺肿瘤中显示出前景

·纳武单抗是一种针对PD-1的人单克隆抗体。

·本研究的目的是研究VB-111在结直肠癌(CRC)中的作用，并评价是否可以通过PD-1抑制来增强VB-111治疗诱导的抗肿瘤免疫。

目的：

·确定VB-111联合纳武单抗在难治性转移性CRC患者中的安全性和耐受性。

·根据VB-111和纳武单抗的联合治疗难治性转移性CRC患者的反应评价标准(RECIST v1.1)确定最佳总体反应(BOR)(部分反应(PR)+完全反应(CR))。

合格条件：

·结直肠癌转移至肝脏的组织病理学确认。

·患者必须在2线以上的结直肠癌标准化疗方案中出现进展，或者对化疗不耐受或拒绝先前的化疗。

·患者的肿瘤必须被证明是微卫星稳定的(MSS)。

·患者必须至少有1个转移灶，可以进行治疗前和治疗中活检，并愿意接受这一点。

·根据RECIST v1.1标准，所有入组患者都必须具有可测量的疾病。

设计：

·拟议的研究是VB-111联合免疫检查点抑制(纳武单抗)治疗转移性CRC患者的II期研究

·治疗将按周期进行，包括2周，每6周施用一次VB-111，每2周施用纳武单抗，直至出现进展或不可接受的毒性。

·将在研究治疗开始后每8(+/-1)周进行一次疾病状态评价。

纳入标准

·患者必须获得NCI病理学实验室对结直肠癌的组织病理学确认。·患者必须有放射学证实的肝转移。

·患者必须：

已在>2个结直肠癌标准护理化疗管线方面取得进展

或者

对结直肠癌的标准护理化疗不耐受

或者

拒绝先前的结直肠癌护理标准化疗。

·患有已知KRAS野生型肿瘤的患者必须已经进展、不耐受或拒绝基于抗EGFR的治疗。

·患者的肿瘤必须被证明是微卫星稳定的(MSS)。

·患者必须至少有1个转移灶，可以进行治疗前和治疗中活检，并愿意接受这一点。理想情况下，活检病变不应是目标可测量病变之一，尽管这取决于研究人员的判断

·根据RECIST v 1.1标准，患者必须具有可测量的疾病。

·年龄≥18岁。由于目前没有关于纳武单抗与VB-111联合用于18岁以下受试者的剂量或不良事件数据，因此儿童被排除在本研究之外，但将有资格参加未来的儿科试验。

·ECOG表现状态。

·足够的血液学功能定义为：

ο白细胞(WBC)计数≥3×10⁹/L

ο中性粒细胞绝对计数(ANC)≥1.5×10⁹/L

ο淋巴细胞计数≥0.5×10⁹/L

ο血小板计数≥100×10⁹/L

οHgb≥9g/dL(输血完成后48小时以上))

·PT和PTT(秒)<1.2×ULN。接受抗凝治疗的患者不需要满足PT和PTT的标准

·INR，纤维蛋白原<1.2×ULN。接受抗凝治疗的患者不需要满足INR标准。

·足够的肝功能定义为：

ο总胆红素水平≤1.5×ULN，

ο在没有肝转移的情况下，AST水平≤2.5×ULN；或者在存在肝转移的情况下≤5×ULN，

ο在没有肝转移的情况下，ALT水平≤2.5×ULN；或者在存在肝转移的情况下≤5×ULN

·足够的肾功能定义为：

·尚不清楚纳武单抗和VB-111对发育中的人类胎儿的影响。出于这个原因，有生育能力的女性和男性必须同意在进入研究之前和研究参与期间以及最后一剂纳武单抗后最多5个月(女性)和7个月(男性)或最后一剂VB-111后2个月采取适当的避孕措施，以较长的时间段为准。如果女性在她或她的伴侣参与本研究时怀孕或怀疑她怀孕，她应立即通知她的主治医生。

·入组时肌钙蛋白水平在正常范围内。

·患者必须能够理解并愿意签署书面知情同意文件。

·体重>35kg

·患者必须参加组织采集协议。

排除标准

·入组前4周内接受过标准抗癌治疗或研究药物治疗(例如化疗、免疫治疗、内分泌治疗、靶向治疗、生物治疗、肿瘤栓塞、单克隆抗体或其他研究药物)、大面积放疗或主要手术的患者。

·入组前4周内接受过抗VEGF治疗的受试者。

·目前皮质类固醇剂量大于生理替代剂量的受试者，定义为每天10mg可的松或其等效物。

·已知有脑转移的患者，因为他们的预后较差，并且经常出现进行性神经功能障碍，这会混淆神经系统和其他不良事件的评价。

·有肝功能衰竭迹象的患者，例如入组前6个月内出现有临床意义的腹水、脑病或静脉曲张出血。

·既往主要肝切除术：残余肝脏<初始肝脏体积的50％。可包括胆道支架患者。

·患有活动性自身免疫性疾病或可能复发的自身免疫性疾病病史的患者，这可能会影响重要器官功能或需要免疫抑制治疗，包括全身性皮质类固醇。这些包括但不限于患有以下疾病的患者：免疫相关神经系统疾病、多发性硬化、自身免疫(脱髓鞘)神经病、格林-巴利综合征或CIDP、重症肌无力病史；诸如SLE的系统性自身免疫病、结缔组织病、硬皮病、炎症性肠病(IBD)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肝炎；以及患有中毒性表皮坏死松解症(TEN)、史-约综合征或磷脂综合征病史的患者。由于存在疾病复发或恶化的风险，应排除此类疾病。

值得注意的是，白癜风、内分泌缺陷(包括甲状腺炎)患者使用替代激素(包括生理性皮质类固醇)进行治疗是符合条件的。对于通过局部药物控制类风湿性关节炎和其他关节病、干燥综合征和银屑病的患者以及血清学阳性(诸如抗核抗体(ANA)、抗甲状腺抗体)的患者，应评价是否存在靶器官受累和是否需要全身治疗但应该有资格。

·特发性肺纤维化病史(包括闭塞性细支气管炎伴机化性肺炎)或胸部CT筛查显示活动性肺炎的证据。

·不受控制的并发疾病，包括但不限于持续或活动性感染、有症状的充血性心力衰竭、不稳定型心绞痛、心律失常或精神疾病/社交情况(在以下项目符号中确定的时间范围内)，其会限制对研究要求的遵守。

·严重或不稳定脑血管病史。

·室内空气脉搏血氧饱和度<92％。

·入组前6个月内发生过心肌梗塞。

·心肌炎病史。

·持续低血压(<90/50mmHg)或未控制的高血压(>160/100mmHg)

·入组前6个月内中风。

·增殖性和/或血管性视网膜病变患者。

·入组前6个月内出现严重血管疾病(例如主动脉瘤、需要手术修复或近期外周动脉血栓形成)。

·入组前6个月内有咯血史(每次发作>1/2茶匙鲜红色血液)或活动性胃肠道出血。

·出血素质(bleeding diathesis)或明显凝血功能障碍的证据(在没有治疗性抗凝治疗的情况下)

·有腹瘘或胃肠穿孔史

·HIV阳性患者被排除在外，因为HIV会导致复杂的免疫缺陷，而研究治疗可能会给这患者带来更多风险。

·既往自体或异体造血干细胞移植。

·有腹水的受试者。

·手术伤口未愈合超过30天的受试者。

·归因于与纳武单抗或VB-111具有相似化学或生物成分的化合物的过敏反应史。

·对任何单克隆抗体有严重超敏反应史。

·既往侵袭性恶性肿瘤(非黑色素瘤皮肤癌除外)，除非在入组前至少3年无病。

·孕妇被排除在本研究之外，因为纳武单抗和VB-111潜在的致畸或流产效应尚不清楚。由于母亲接受纳武单抗和VB-111治疗后哺乳婴儿发生不良事件的风险未知但潜在，如果母亲接受纳武单抗和/或VB-111治疗，应停止母乳喂养。

研究设计和治疗计划

这项研究将是VB-111联合抗PD1抗体纳武单抗在晚期难治性CRC患者中的开放标签、单臂II期研究。

治疗将按由2周(+/-3天)组成的周期进行。

从第1周期第1天开始，每6周施用一次VB-111，从第2周期第1天开始，每2周施用一次纳武单抗(图7和表7)。

治疗将持续到满足非治疗标准为止。

每8(+/-1)周对患者进行一次成像监测。

表7：治疗方案

VB-111施用

将在第1个周期的第1天施用VB-111，并以1×10¹³或0.7×10¹³VP的固定剂量每3个周期(第4、7、10周期等)继续施用。将通过静脉输注在约60-90分钟内施用VB-11。

在室温下，VB-111从在0.9％氯化钠溶液中稀释到开始输注的最长时间应少于60分钟。

将在VB-111输注前1-2小时口服施用对乙酰氨基酚500-1000mg，然后在治疗后每4-6小时根据需要口服325-500mg，直至36小时。对于在服用VB-111后出现>3级发热的患者，或根据研究人员的判断，可在以随后VB-111剂量治疗前20分钟至3小时(但不早于20分钟)施用地塞米松IV 10mg。

纳武单抗施用

将在从第2周期开始的每个周期的第1天以240mg的固定剂量施用纳武单抗。将在约30-60分钟内通过静脉输注施用纳武单抗。

将通过0.2微米至1.2微米孔径的低蛋白结合在线过滤器施用纳武单抗。

在给予两种药物的日子里，将首先给予VB-111。将在VB-111输注结束后约1小时开始纳武单抗输注。

将在VB-111和纳武单抗输注前1小时内、每次输注期间至少一次以及输注完成后30分钟内采集生命体征。

对于纳武单抗，如果发生≤2级输注相关反应，研究药物的输注速度可减少50％或中断直至事件解决，并以初始速度的50％重新开始直至完成输液。对乙酰氨基酚和/或抗组胺药(例如苯海拉明)或符合机构标准的等效药物可由研究人员自行决定使用。如果输液相关反应的严重程度≥3级或更高，则将停用研究药物。

表8.研究日历

¹如果在筛选时或在指定时间范围内进行基线评估，则无需重复基线和C1D1评估。所有评估将在每个周期的第1天开始治疗前72小时内完成。如果在入组后28天内未开始治疗，将重复筛选评估。周期为14(+/-3)天。

²从第2周期开始在每个周期的第1天通过静脉输注240mg纳武单抗。

³在第1个周期的第1天且每+3个周期(4、7、10等)静脉注射1×10¹³VP的VB-111。对于体重>35kg和<50kg的受试者，减少0.7×10¹³VP的剂量。

⁴经基因分析或免疫组化确认。

⁵如果有临床指征。

⁶将在VB-111和纳武单抗输注前1小时内、每次输注期间至少一次以及输注完成后30分钟内采集生命体征。

⁷生化概况：电解质、BUN、肌酐、AST、ALT、总胆红素和直接胆红素、钙、磷、白蛋白、镁。

⁸筛查时、基线和研究治疗开始后每8(+/-1)周对胸部、腹部和骨盆进行CT扫描或MRI。如果在初始估计PD后继续治疗，则将在4周(+/-1周)后进行构象扫描。如果患者因疾病进展以外的原因停止治疗，则在随访期间将继续成像，直至疾病进展。

⁹将在基线和第2周期或第4周期的第1天进行强制性肿瘤活检。如果患者的疾病在计划活检前进展，则可在进展时根据PI酌情决定进行治疗后活检。

¹⁰+/-1周

¹¹计划在停止治疗后60(+/-14天)和90(+/-14天)进行随访，以评价患者的安全性。这次访视后，将每6个月(±1个月)通过电话或电子邮件跟踪患者的生存情况。注意：如果患者因疾病进展以外的原因停止治疗，我们将继续每8(+/-1)周邀请患者进行一次影像学检查。可以接受外部扫描。

¹²如果受试者不愿意来NIH进行FU访视，将通过电话或电子邮件联系他们以了解生存情况和不良事件。

反应标准

出于本研究的目的，应每8周(+/-1周)重新评价患者的反应。本研究将使用修订后的实体瘤的反应评价标准(RECIST)指南(1.1版)和修改后的免疫相关反应提出的新国际标准评估反应和进展。

虽然免疫相关的RECIST标准将在生长情况下考虑继续治疗，但标准RECIST标准将是用于评价主要终点的主要方法。

根据RECIST 1.1，如果疾病进展，可以根据研究人员的决定继续研究治疗。对于这种情况，将在所有受试者中使用基于RECIST 1.1的修改后的免疫相关反应标准(irRC)，而不会恶化现有症状或在进展时出现新的肿瘤相关症状。

反应标准—目标病变的评价

完全反应(CR)：所有目标病变消失。任何病理淋巴结(无论是目标还是非目标)的短轴都必须减少到<10mm。

部分反应(PR)：以基线直径总和为参考，目标病变直径总和至少减少30％。

进展性疾病(PD)：目标病变的直径总和至少增加20％，以研究中的最小总和为参考(如果研究中存在最小总和，则包括基线总和)。除了20％的相对增加外，总和还必须证明绝对增加至少5mm。(注意：一个或多个新病变的出现也被视为进展)。

病情稳定(SD)：以研究时的最小直径总和作为参考，既没有足够的收缩来满足PR的要求，也没有足够的增加来满足PD的要求。

非目标病变的评价

完全反应(CR)：所有非目标病变消失且肿瘤标志物水平正常化。所有淋巴结的大小必须是非病理性的(<10mm短轴)。注意：如果肿瘤标志物最初高于正常上限，则它们必须正常化，患者才能被视为完全临床反应。

非CR/非PD：一个或多个非目标病变持续存在和/或肿瘤标志物水平维持在正常范围之上。

进展性疾病(PD)：出现一处或多处新病变和/或现有非目标病变的明确进展。明确进展通常不应超过目标病变状态。它必须代表整体疾病状态的变化，而不是单个病变的增加。尽管“非目标”病变的明确进展只是例外，但在这种情况下，主治医师的意见应为主导，稍后应由审查小组(或首席研究员)确认进展状态。

最佳总体反应评价

最佳总体反应是从治疗开始到疾病进展/复发所记录到的最佳反应(将自治疗开始以来记录的最小测量值作为进展性疾病的参考)。患者的最佳反应分配将取决于测量和确认标准二者的实现。

对于具有可测量疾病(即目标疾病)的患者，请参见表9：

表9.

对于不可测量疾病(即非目标疾病)的受试者，见表10。

表10.

反应持续时间

总体反应持续时间：总体反应持续时间是从满足CR或PR的时间测量标准(以首先记录的为准)直到客观记录复发或进展性疾病的第一个日期(自治疗开始以来记录的最小测量值作为进展性疾病的参考)。

总体CR的持续时间是从第一次满足CR的测量标准的时间到客观记录疾病进展的第一个日期。

病情稳定的持续时间：从治疗开始到达到进展标准为止，以治疗开始以来记录的最小测量值作为参考，包括基线测量值。

毒性标准

以下不良事件管理指南旨在确保每位患者在研究期间的安全。修订后的NCI不良事件通用术语标准(CTCAE)5.0版中的描述和分级量表将用于不良事件报告。

·相关—研究产品导致不良事件有合理的可能性。合理的可能性是指有证据表明研究产品与不良事件之间存在因果关系。

·不相关—研究产品的施用导致该事件没有合理的可能性。

统计分析

通常方法

在根据报告的毒性来确定安全性和耐受性之后，将报告所有经历反应的可评价受试者的比例及置信区间。

主要终点分析

每个患者的毒性等级和类型将被制成表格并报告。

将报告经历反应(PR+CR)的可评价受试者的比例及95％的两侧置信区间。

次要终点分析

将使用Kaplan-Meier方法(生存分析)确定PFS和OS，将报告中位PFS和OS及95％的置信区间。

安全性分析

将按毒性等级和类型列出经历毒性的患者比例。

基线描述性统计

将报告基线人口统计特征。

中期分析

如两阶段设计所示，将记录9名可评价患者接受治疗后的反应数量，并将其用于确定是否可以进行II期的招募。

进一步分析：将通过RT-PCR测量接受VB-111治疗的患者的血液和肿瘤样本中的VB-111腺载体水平。将在适当时使用包括置信区间在内的描述性统计分析结果。将不在进行多重比较的正式调整的情况下，而是在进行测试的数量的情况下，进行为评价探索性目的而完成的任何统计测试。

序列表

<110> 脉管生物生长有限公司

<120> 抗肿瘤治疗的方法

<130> 3182.091PC01/GLL/C-K/SGM

<150> US 62/833,402

<151> 2019-04-12

<160> 25

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 1365

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码TNFR1的核苷酸序列

<400> 1

atgggcctct ccaccgtgcc tgacctgctg ctgccgctgg tgctcctgga gctgttggtg 60

ggaatatacc cctcaggggt tattggactg gtccctcacc taggggacag ggagaagaga 120

gatagtgtgt gtccccaagg aaaatatatc caccctcaaa ataattcgat ttgctgtacc 180

aagtgccaca aaggaaccta cttgtacaat gactgtccag gcccggggca ggatacggac 240

tgcagggagt gtgagagcgg ctccttcacc gcttcagaaa accacctcag acactgcctc 300

agctgctcca aatgccgaaa ggaaatgggt caggtggaga tctcttcttg cacagtggac 360

cgggacaccg tgtgtggctg caggaagaac cagtaccggc attattggag tgaaaacctt 420

ttccagtgct tcaattgcag cctctgcctc aatgggaccg tgcacctctc ctgccaggag 480

aaacagaaca ccgtgtgcac ctgccatgca ggtttctttc taagagaaaa cgagtgtgtc 540

tcctgtagta actgtaagaa aagcctggag tgcacgaagt tgtgcctacc ccagattgag 600

aatgttaagg gcactgagga ctcaggcacc acagtgctgt tgcccctggt cattttcttt 660

ggtctttgcc ttttatccct cctcttcatt ggtttaatgt atcgctacca acggtggaag 720

tccaagctct actccattgt ttgtgggaaa tcgacacctg aaaaagaggg ggagcttgaa 780

ggaactacta ctaagcccct ggccccaaac ccaagcttca gtcccactcc aggcttcacc 840

cccaccctgg gcttcagtcc cgtgcccagt tccaccttca cctccagctc cacctatacc 900

cccggtgact gtcccaactt tgcggctccc cgcagagagg tggcaccacc ctatcagggg 960

gctgacccca tccttgcgac agccctcgcc tccgacccca tccccaaccc ccttcagaag 1020

tgggaggaca gcgcccacaa gccacagagc ctagacactg atgaccccgc gacgctgtac 1080

gccgtggtgg agaacgtgcc cccgttgcgc tggaaggaat tcgtgcggcg cctagggctg 1140

agcgaccacg agatcgatcg gctggagctg cagaacgggc gctgcctgcg cgaggcgcaa 1200

tacagcatgc tggcgacctg gaggcggcgc acgccgcggc gcgaggccac gctggagctg 1260

ctgggacgcg tgctccgcga catggacctg ctgggctgcc tggaggacat cgaggaggcg 1320

ctttgcggcc ccgccgccct cccgcccgcg cccagtcttc tcaga 1365

<210> 2

<211> 455

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TNFR1的氨基酸序列

<400> 2

Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu

1 5 10 15

Glu Leu Leu Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro

20 25 30

His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys

35 40 45

Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys

50 55 60

Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp

65 70 75 80

Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu

85 90 95

Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val

100 105 110

Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg

115 120 125

Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe

130 135 140

Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu

145 150 155 160

Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu

165 170 175

Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr

180 185 190

Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser

195 200 205

Gly Thr Thr Val Leu Leu Pro Leu Val Ile Phe Phe Gly Leu Cys Leu

210 215 220

Leu Ser Leu Leu Phe Ile Gly Leu Met Tyr Arg Tyr Gln Arg Trp Lys

225 230 235 240

Ser Lys Leu Tyr Ser Ile Val Cys Gly Lys Ser Thr Pro Glu Lys Glu

245 250 255

Gly Glu Leu Glu Gly Thr Thr Thr Lys Pro Leu Ala Pro Asn Pro Ser

260 265 270

Phe Ser Pro Thr Pro Gly Phe Thr Pro Thr Leu Gly Phe Ser Pro Val

275 280 285

Pro Ser Ser Thr Phe Thr Ser Ser Ser Thr Tyr Thr Pro Gly Asp Cys

290 295 300

Pro Asn Phe Ala Ala Pro Arg Arg Glu Val Ala Pro Pro Tyr Gln Gly

305 310 315 320

Ala Asp Pro Ile Leu Ala Thr Ala Leu Ala Ser Asp Pro Ile Pro Asn

325 330 335

Pro Leu Gln Lys Trp Glu Asp Ser Ala His Lys Pro Gln Ser Leu Asp

340 345 350

Thr Asp Asp Pro Ala Thr Leu Tyr Ala Val Val Glu Asn Val Pro Pro

355 360 365

Leu Arg Trp Lys Glu Phe Val Arg Arg Leu Gly Leu Ser Asp His Glu

370 375 380

Ile Asp Arg Leu Glu Leu Gln Asn Gly Arg Cys Leu Arg Glu Ala Gln

385 390 395 400

Tyr Ser Met Leu Ala Thr Trp Arg Arg Arg Thr Pro Arg Arg Glu Ala

405 410 415

Thr Leu Glu Leu Leu Gly Arg Val Leu Arg Asp Met Asp Leu Leu Gly

420 425 430

Cys Leu Glu Asp Ile Glu Glu Ala Leu Cys Gly Pro Ala Ala Leu Pro

435 440 445

Pro Ala Pro Ser Leu Leu Arg

450 455

<210> 3

<211> 591

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码TNFR1的配体结合域的核苷酸序列

<400> 3