一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、核酸分子及应用
阅读说明：本技术 一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、核酸分子及应用 (Glutamine synthetase mutant with glufosinate-ammonium resistance, nucleic acid molecule and application ) 是由 邓龙群 张震 陈容 侯青江 胥南飞 于 2021-09-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、核酸分子及应用,涉及基因工程技术领域。发明人发现,在野生型谷氨酰胺合成酶第n位进行突变可以获得谷氨酰胺合成酶突变体,突变后为C、E、F、I、M、N、P、S、Y或删除,该突变能赋予谷氨酰胺合成酶适于商业化应用的草铵膦抗性。该谷氨酰胺合成酶突变体具有用于构建转化植物的表达载体、及培育抗草铵膦作物的应用潜力。(The invention discloses a glutamine synthetase mutant with glufosinate-ammonium resistance, a nucleic acid molecule and application, and relates to the technical field of genetic engineering. The inventors have found that mutation at the n-th position of a wild-type glutamine synthetase to C, E, F, I, M, N, P, S, Y or deletion can result in a glutamine synthetase mutant that can confer glufosinate-ammonium resistance to glutamine synthetase suitable for commercial use. The glutamine synthetase mutant has application potential for constructing an expression vector for transforming plants and cultivating glufosinate-resistant crops.)
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、核酸分子及应用。
背景技术
草铵膦，又称草丁膦，商品名为保试达(basta)、百速顿，化学名为4-[羟基(甲基)膦酰基]-DL-高丙氨酸或2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸铵。由拜耳公司开发的广谱触杀型灭生性除草剂。其通过抑制谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)的活性，使得植物体内谷氨酰胺的合成受阻，继而植物体内氮代谢发生紊乱，蛋白质和核苷酸等物质的合成减少，光合作用受阻，叶绿素合成减少。同时细胞内的铵离子的含量增加，使得细胞膜遭到破坏，叶绿体解体，最终导致植物死亡。
由于草铵膦具有杀草谱广、在土壤中迅速失活降解、对非靶标生物低毒的特性，可以通过转基因技术使作物对草铵膦产生抗性，从而对草铵膦能够选择地杀死杂草而不危害作物。目前农业上应用最广的抗草铵膦基因是来源于菌株Streptomyces hygroscopicus的bar基因和菌株S.viridochromogenes的pat基因。bar基因和pat基因具有80％的同源性，都可以编码草铵膦乙酰化酶，而该酶可以使草铵膦乙酰化而失活。草铵膦的抗性基因已经被导入了包括水稻、小麦、玉米、甜菜、烟草、大豆、棉花、马铃薯、番茄、油菜、甘蔗等20多种作物中，其中抗性油菜、玉米等已大面积商业化种植。
研究表明，bar基因和pat基因编码的草铵膦乙酰化酶可以使草铵膦乙酰化而失活，但是在草铵膦接触GS之前，草铵膦乙酰化酶很难使草铵膦完全失活，由于很多GS分布在细胞膜上，部分未失活的草铵膦可以抑制细胞膜上GS的活性，从而干扰植物的氮代谢。因此草铵膦在转bar基因和pat基因农作物上应用时，会不同程度的干扰植物的氮代谢，同时影响植物正常的生长和发育。通过在植物中过量表达野生型GS虽然可以一定程度上降低转基因植物对草铵膦的敏感程度，但其对草铵膦的耐性程度远不足以商业化应用。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、核酸分子及应用。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体，其如下(1)或(2)所示：
(1)：其由来源于植物的野生型谷氨酰胺合成酶的第n位发生突变得到；第n位的位置通过如下方式确定：野生型谷氨酰胺合成酶与参考序列比对，野生型谷氨酰胺合成酶的第n位对应于参考序列的第57位，其中，参考序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
谷氨酰胺合成酶突变体的第n位的氨基酸为X，X包括C、E、F、I、M、N、P、S、Y或删除；
(2)：其与(1)所示的谷氨酰胺合成酶突变体至少具有85％以上的同一性、且与(1)所示的谷氨酰胺合成酶突变体在第n位的氨基酸相同、以及具有草铵膦抗性。
发明人发现，将植物来源的野生型谷氨酰胺合成酶与参考序列进行比对，将其序列上对应于参考序列第57位的氨基酸位点即第n位进行突变，突变为C、E、F、I、M、N、P、S、Y或删除，所得到的谷氨酰胺合成酶突变体均具有草铵膦抗性，同时还能保持自身的谷氨酰胺合成酶具有正常的催化活性。而且转化本发明提供的植物谷氨酰胺合成酶突变体的植株或重组菌均能够在草铵膦存在的条件下正常生长和发育，该植物谷氨酰胺合成酶突变体不仅用于转基因作物培育，也可应用于培育抗草铵膦非转基因植物或转基因植物例如水稻、烟草、大豆、玉米、小麦、油菜、棉花和高粱等，具有广阔的应用前景。
上述SEQ ID NO.1所示参考序列为水稻来源的野生型谷氨酰胺合成酶。
序列比对方法可使用Blast网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行Protein Blast比对；采用本领域熟知的其他序列比对方法或工具也均可得到相同的结果。
需要说明的是，野生型谷氨酰胺合成酶的第n位在其自身序列上可能也是第57位(例如玉米、小麦、大豆、油菜等)，但也可能不是第57位(例如花生对应为第58位)，第n位的具体位置根据前述序列比对后确定，只要其通过与参考序列比对后，对应于参考序列第57位的位点即为本发明所述的第n位，也就是突变位点。
所有植物的野生型谷氨酰胺合成酶都具有同源性，在植物体内具有基本相同的功能和结构域。因此，任意植物来源的野生型谷氨酰胺合成酶在第57位作上述突变后所得到的谷氨酰胺合成酶突变体都具有草铵膦抗性。也即，由任意植物来源的野生型谷氨酰胺合成酶作上述突变后得到的谷氨酰胺合成酶突变体也均属于本发明的保护范围。
此外，本领域技术人员知晓并容易实现，在(1)所示的谷氨酰胺合成酶突变体的非保守区域进行简单的氨基酸替换或删除或增加等操作并维持第n位为上述突变后的氨基酸，并使进一步突变得到的谷氨酰胺合成酶突变体与(1)所示的谷氨酰胺合成酶突变体具有至少具有85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％等)以上的同一性，且其功能包括酶催化活性和草铵膦抗性与(1)所示的谷氨酰胺合成酶突变体相当或略有下降或略有提高或大幅提高等。因此，此类谷氨酰胺合成酶也应属于本发明的保护范围。
在本发明应用较佳的实施方式中，在一种可选的实施方式中，目的植物选自小麦、水稻、大麦、燕麦、玉米、高粱、谷子、荞麦、黍稷、甘薯、马铃薯、棉花、油菜、芝麻、花生、向日葵、萝卜、胡萝卜、花椰菜、番茄、茄子、辣椒、韭菜、大葱、洋葱、韭葱、菠菜、芹菜、苋菜、莴苣、茼蒿、黄花菜、葡萄、草莓、甘蔗、烟草、芸薹属蔬菜、葫芦科植物、豆科植物、牧草、茶或木薯。
在一种可选的实施方式中，所述牧草选自禾本科牧草或豆科牧草。禾本科牧草选自梯牧草、鸭茅、六月禾、细麦、羊茅、棕叶、狗尾草等；豆科牧草选自苜蓿、三叶草、三叶豆、巢菜、鸡眼草等。此外，在其他实施方式中，上述牧草也可选自草坪草。
在一种可选的实施方式中，芸薹属蔬菜包括不限于芜菁、白菜、芥菜、甘蓝、芥蓝、菜苔、苦芥、擎蓝、芸苔、青菜或甜菜。
在一种可选的实施方式中，葫芦科植物包括不限于黄瓜、西葫芦、南瓜、冬瓜、苦瓜、丝瓜、菜瓜、西瓜或甜瓜。
在一种可选的实施方式中，豆科植物包括不限于绿豆、蚕豆、豌豆、扁豆、大豆、菜豆、豇豆或毛豆。
在本发明应用较佳的实施方式中，发明人还发现，针对不同的植物来源的谷氨酰胺合成酶，除了将其第n位突变为C、E、F、I、M、N、P、S、Y或删除之外，将其第n位突变为其他的氨基酸也会使得谷氨酰胺合成酶具有草铵膦抗性。
当目的植物为水稻时，X＝A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W、Y或删除；
当植物为大豆、玉米、油菜时，X＝C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y或删除；
当植物为小麦时，X＝C、E、F、I、M、N、P、S、T、Y或删除。
可选的，在本发明的一些实施方案中，当植物为水稻时，水稻野生型谷氨酰胺合成酶为SEQ ID NO.1：
MASLTDLVNLNLSDTTEKIIAEYIWIGGSGMDLRSKARTLSGPVTDPSKLPKWNYDGSSTGQAPGEDSEVILYPQAIFKDPFRKGNNILVMCDCYTPAGEPIPTNKRHNAAKIFSSPEVASEEPWYGIEQEYTLLQKDINWPLGWPVGGFPGPQGPYYCGIGADKSFGRDIVDSHYKACLYAGINISGINGEVMPGQWEFQVGPSVGISAGDQVWVARYILERITEIAGVVVSFDPKPIPGDWNGAGAHTNYSTKSMRNDGGYEIIKSAIEKLKLRHKEHISAYGEGNERRLTGRHETADINTFSWGVANRGASVRVGRETEQNGKGYFEDRRPASNMDPYIVTSMIAETTIIWKP。
可选的，在本发明的一些实施方案中，当植物为玉米时，玉米野生型谷氨酰胺合成酶为SEQ ID NO.2：
MACLTDLVNLNLSDNTEKIIAEYIWIGGSGMDLRSKARTLSGPVTDPSKLPKWNYDGSSTGQAPGEDSEVILYPQAIFKDPFRRGNNILVMCDCYTPAGEPIPTNKRYNAAKIFSSPEVAAEEPWYGIEQEYTLLQKDTNWPLGWPIGGFPGPQGPYYCGIGAEKSFGRDIVDAHYKACLYAGINISGINGEVMPGQWEFQVGPSVGISSGDQVWVARYILERITEIAGVVVTFDPKPIPGDWNGAGAHTNYSTESMRKEGGYEVIKAAIEKLKLRHREHIAAYGEGNERRLTGRHETADINTFSWGVANRGASVRVGRETEQNGKGYFEDRRPASNMDPYVVTSMIAETTIIWKP。
可选的，在本发明的一些实施方案中，当植物为大豆时，大豆野生型谷氨酰胺合成酶为SEQ ID NO.3：
MSLLSDLINLNLSDTTEKVIAEYIWIGGSGMDLRSKARTLPGPVSDPSKLPKWNYDGSSTGQAPGEDSEVIIYPQAIFRDPFRRGNNILVICDTYTPAGEPIPTNKRHDAAKVFSHPDVVAEETWYGIEQEYTLLQKDIQWPLGWPVGGFPGPQGPYYCGVGADKAFGRDIVDAHYKACLYAGINISGINGEVMPGQWEFQVGPSVGISAGDEVWAARYILERITEIAGVVVSFDPKPIQGDWNGAGAHTNYSTKSMRNDGGYEVIKTAIEKLGKRHKEHIAAYGEGNERRLTGRHETADINTFLWGVANRGASVRVGRDTEKAGKGYFEDRRPASNMDPYVVTSMIADTTILWKP。
可选的，在本发明的一些实施方案中，当植物为小麦时，小麦野生型谷氨酰胺合成酶为SEQ ID NO.4：
MALLTDLLNLDLTDSTEKIIAEYIWIGGSGMDLRSKARTLPGPVTDPSKLPKWNYDGSSTGQAPGEDSEVILYPQAIFKDPFRKGNNILVMCDCYTPAGVPIPTNKRYNAAKIFSNPDVAKEEPWYGIEQEYTLLQKDINWPLGWPVGGFPGPQGPYYCSIGADKSFGRDIVDSHYKACLFAGVNISGINGEVMPGQWEFQVGPTVGISAGDQVWVARYLLERITEIAGVVVTFDPKPIPGDWNGAGAHTNYSTESMRKDGGFKVIVDAVEKLKLKHKEHIAAYGEGNERRLTGKHETADINTFSWGVANRGASVRVGRETEQNGKGYFEDRRPASNMDPYVVTSMIAETTILWKP。
可选的，在本发明的一些实施方案中，当植物为油菜时，油菜野生型谷氨酰胺合成酶为SEQ ID NO.5：
MSLLTDLVNLNLSETTDKIIAEYIWVGGSGMDMRSKARTLPGPVSDPSELPKWNYDGSSTGQAPGEDSEVILYPQAIFKDPFRRGNNILVMCDAYTPAGEPIPTNKRHAAAKVFSHPDVVAEVPWYGIEQEYTLLQKDVNWPLGWPIGGFPGPQGPYYCSVGADKSFGRDIVDAHYKACLYAGINISGINGEVMPGQWEFQVGPAVGISAGDEIWVARFILERITEIAGVVVSFDPKPIPGDWNGAGAHCNYSTKSMREDGGYEIIKKAIDKLGLRHKEHIAAYGEGNERRLTGHHETADINTFLWGVANRGASIRVGRDTEKEGKGYFEDRRPASNMDPYIVTSMIAETTILWKP。
部分植物来源的野生型谷氨酰胺合成酶相互间的相似性(Similarity)和同一性(Identity)如下表所示，其序列比对的部分结果见图13，箭头所示为第57位氨基酸。
上述相似性(Similarity)和同一性(Identity)的比对方法为：将一个物种的氨基酸序列输入到Blast网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行ProteinBlast比对，从比对结果中查找此物种和其他需要比对的物种的相似性(Similarity)和同一性(Identity)。
本发明还提供了一种分离的核酸分子，其编码上述的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体。
在本发明提供了上述氨基酸序列的情况下，本领域技术人员根据密码子的简并性容易获得编码上述谷氨酰胺合成酶突变体的核酸序列。例如，可以在编码野生型谷氨酰胺合成酶的核酸序列上作对应的核苷酸突变得到编码上述谷氨酰胺合成酶突变体的核酸序列。这对本领域技术人员来说是容易实现的。
例如，水稻野生型谷氨酰胺合成酶的编码核酸序列为SEQ ID NO.6：
atggcttctctcaccgatctcgtcaacctcaacctctccgacaccacggagaagatcatcgccgagtacatatggatcggtggatctggcatggatctcaggagcaaggctaggactctctccggccctgtgactgatcccagcaagctgcccaagtggaactacgatggctccagcaccggccaggcccccggcgaggacagtgaggtcatcctgtacccacaggctatcttcaaggacccattcaggaagggaaacaacatccttgtcatgtgcgattgctacacgccagccggagaaccgatccccaccaacaagaggcacaatgctgccaagatcttcagctcccctgaggttgcttctgaggagccctggtacggtattgagcaagagtacaccctcctccagaaggacatcaactggccccttggctggcctgttggtggcttccctggtcctcagggtccttactactgtggtatcggtgctgacaagtcttttgggcgtgatattgttgactcccactacaaggcttgcctctatgccggcatcaacatcagtggaatcaacggcgaggtcatgccaggacagtgggagttccaagttggcccgtctgtcggcatttctgccggtgatcaggtgtgggttgctcgctacattcttgagaggatcaccgagatcgccggagtcgtcgtctcatttgaccccaagcccatcccgggagactggaacggtgctggtgctcacaccaactacagcaccaagtcgatgaggaacgatggtggctacgagatcatcaagtccgccattgagaagctcaagctcaggcacaaggagcacatctccgcctacggcgagggcaacgagcgccggctcaccggcaggcacgagaccgccgacatcaacaccttcagctggggagttgccaaccgcggcgcctcggtccgcgtcggccgggagacggagcagaacggcaagggctacttcgaggatcgccggccggcgtccaacatggacccttacatcgtcacctccatgatcgccgagaccaccatcatctggaagccctga。
据此，在序列基础上，在对应于其编码氨基酸序列第57位的密码子进行对应的核苷酸突变，即可得到编码如上所述的水稻谷氨酰胺合成酶突变体。
玉米野生型谷氨酰胺合成酶的编码核酸序列为SEQ ID NO.7：
atggcctgcctcaccgacctcgtcaacctcaacctctcggacaacaccgagaagatcatcgcggaatacatatggatcggtggatctggcatggatctcaggagcaaagcaaggaccctctccggcccggtgaccgatcccagcaagctgcccaagtggaactacgacggctccagcacgggccaggcccccggcgaggacagcgaggtcatcctgtacccgcaggccatcttcaaggacccattcaggaggggcaacaacatccttgtgatgtgcgattgctacaccccagccggcgagccaatccccaccaacaagaggtacaacgccgccaagatcttcagcagccctgaggtcgccgccgaggagccgtggtatggtattgagcaggagtacaccctcctccagaaggacaccaactggccccttgggtggcccatcggtggcttccccggccctcagggtccttactactgtggaatcggcgccgaaaagtcgttcggccgcgacatcgtggacgcccactacaaggcctgcttgtatgcgggcatcaacatcagtggcatcaacggggaggtgatgccagggcagtgggagttccaagtcgggccttccgtgggtatatcttcaggcgaccaggtctgggtcgctcgctacattcttgagaggatcacggagatcgccggtgtggtggtgacgttcgacccgaagccgatcccgggcgactggaacggcgccggcgcgcacaccaactacagcacggagtcgatgaggaaggagggcgggtacgaggtgatcaaggcggccatcgagaagctgaagctgcggcacagggagcacatcgcggcatacggcgagggcaacgagcgccggctcaccggcaggcacgagaccgccgacatcaacacgttcagctggggcgtggccaaccgcggcgcgtcggtgcgcgtgggccgggagacggagcagaacggcaagggctacttcgaggaccgccgcccggcgtccaacatggacccctacgtggtcacctccatgatcgccgagaccaccatcatctggaagccctga。
大豆野生型谷氨酰胺合成酶的编码核酸序列为SEQ ID NO.8：
atgtcgctgctctcagatctcatcaaccttaacctctcagacactactgagaaggtgatcgcagagtacatatggatcggtggatcaggaatggacctgaggagcaaagcaaggactctcccaggaccagttagcgacccttcaaagcttcccaagtggaactatgatggttccagcacaggccaagctcctggagaagacagtgaagtgattatatacccacaagccattttcagggatccattcagaaggggcaacaatatcttggttatctgtgatacttacactccagctggagaacccattcccactaacaagaggcacgatgctgccaaggttttcagccatcctgatgttgttgctgaagagacatggtatggtattgagcaggaatacaccttgttgcagaaagatatccaatggcctcttgggtggcctgttggtggtttccctggaccacagggtccatactactgtggtgttggcgctgacaaggcttttggccgtgacattgttgacgcacattacaaagcctgtctttatgctggcatcaacatcagtggaattaatggagaagtgatgcccggtcagtgggaattccaagttggaccttcagttggaatctcagctggtgacgaggtgtgggcagctcgttacatcttggagaggatcactgagattgctggtgtggtggtttcctttgatcccaagccaattcagggtgattggaatggtgctggtgctcacacaaactacagcactaagtccatgagaaatgatggtggctatgaagtgatcaaaaccgccattgagaagttggggaagagacacaaggagcacattgctgcttatggagaaggcaacgagcgtcgtttaacagggcgccacgaaaccgctgacatcaacaccttcttatggggagttgcaaaccgtggagcttcagttagggttgggagggacacagagaaagcagggaagggatattttgaggacagaaggccagcttctaacatggacccatatgtggttacttccatgattgcagacacaaccattctgtggaagccatga。
小麦野生型谷氨酰胺合成酶的编码核酸序列为SEQ ID NO.9：
atggcgctcctcaccgatctcctcaacctcgacctcaccgactccacggagaagatcatcgccgagtacatatggatcggcggatctggcatggatctcaggagcaaagccaggaccctccccggcccggtcaccgaccccagcaagctgcccaagtggaactacgacggctccagcaccggccaggcccccggcgaggacagcgaggtcatcctgtacccacaggccatcttcaaggacccgttcaggaagggcaacaacatccttgtcatgtgcgattgctacaccccagctggagtgccaatccccaccaacaagagatacaacgctgccaagatctttagcaaccctgatgttgccaaggaggagccatggtacggtatcgagcaggagtacaccctcctacagaaggacatcaactggcctctcggctggcctgttggtggattccctggtcctcagggtccttactactgtagtattggtgctgacaagtcgtttgggcgtgacatagttgactcccactacaaggcctgcctctttgccggcgtcaacatcagtggcatcaacggcgaggtcatgcccggacagtgggagttccaagttggcccgactgtcggcatctctgctggtgaccaagtgtgggttgctcgctaccttcttgagaggatcactgagatcgccggagttgtcgtcacatttgaccccaagcccatcccaggcgactggaacggtgctggtgctcacacaaactacagtaccgagtcgatgaggaaggacggcgggttcaaggtcatcgtggacgctgtcgagaagctcaagctgaagcacaaggagcacatcgccgcctacggcgagggcaacgagcgccgtctcaccggcaagcacgaaaccgccgacatcaacaccttcagctggggtgtcgcgaaccgtggcgcgtcggtgcgcgtgggacgggagacggagcagaacggcaagggctacttcgaggaccgccggccggcgtccaacatggacccctacgtggtcacctccatgatcgccgagaccaccatcctgtggaagccctga。
油菜野生型谷氨酰胺合成酶的编码核酸序列为SEQ ID NO.10：
atgagtcttcttacagatctcgttaaccttaacctctcagagaccactgacaaaatcattgcggaatacatatgggttggaggttcaggaatggatatgagaagcaaagccaggactcttcctggaccagtgagtgacccttcggagctaccaaagtggaactatgatggctcaagcacaggccaagctcctggtgaagacagtgaagtcatcttataccctcaagccatattcaaagatcctttccgtagaggcaacaacattcttgtcatgtgcgatgcttacactccagcgggcgaaccgatcccaacaaacaaaagacacgctgcggctaaggtctttagccaccccgatgttgtagctgaagtgccatggtatggtattgagcaagagtatactttacttcagaaagatgtgaactggcctcttggttggcctattggcggcttccccggtcctcagggaccatactattgtagtgttggagcagataaatcttttggtagagacatcgttgatgctcactacaaggcctgcttatacgctggcatcaatattagtggcatcaacggagaagtcatgcctggtcagtgggagttccaagttggtccagctgttggtatctcggccggtgatgaaatttgggtcgcacgtttcattttggagaggatcacagagattgctggtgtggtggtatcttttgacccaaaaccgattcccggtgactggaatggtgctggtgctcactgcaactatagtaccaagtcaatgagggaagatggtggttacgagattattaagaaggcaatcgataaactgggactgagacacaaagaacacattgcagcttacggtgaaggcaatgagcgccgtctcacgggtcaccacgagactgctgacatcaacactttcctctggggtgttgcgaaccgtggagcatcaatccgtgtaggacgtgacacagagaaagaagggaaaggatactttgaggataggaggccagcttcgaacatggatccttacattgtgacttccatgattgcagagaccacaatcctctggaaaccttga。
本发明还提供了一种载体，其含有上述的核酸分子。
本发明还提供了一种重组菌或重组细胞，其含有上述的核酸分子或载体。
重组菌可以选自农杆菌；重组细胞可以是感受态细胞。
本发明还提供了上述具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、核酸分子、载体、重组菌或重组细胞在培育具有草铵膦抗性的植物品种中的应用。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述应用包括如下至少一种的应用方式：
将分离的核酸分子送入目的植物细胞，分离的核酸分子含有编码谷氨酰胺合成酶突变体的编码基因；
将载体转化目的植物，载体含有编码谷氨酰胺合成酶突变体的编码基因；
将重组菌或重组细胞导入目的植物，重组菌或重组细胞含有编码谷氨酰胺合成酶突变体的编码基因。
分离的核酸分子可以是质粒或DNA片段，在可选的实施方式中，可以通过基因枪法将分离的核酸分子送入目的植物细胞。
转化的方法包括不限于农杆菌介导基因转化法，基因枪转化法、花粉管通道法。
重组菌或重组细胞可通过侵染的方式导入目的植物体内。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述应用包括：修饰目的植物的内源谷氨酰胺合成酶基因，使其编码谷氨酰胺合成酶突变体。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述应用包括：对植物细胞、组织、个体或群体进行诱变和筛选，使其编码谷氨酰胺合成酶突变体。
在本发明提供了谷氨酰胺合成酶突变体的基础上，本领域技术人员容易想到通过本领域常规的转基因技术、基因编辑技术(如通过锌指核酸内切酶(ZFN，zinc-fingernucleases)技术、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN，transcription activator-likeeffector nucleases)技术或CRISPR/Cas9)、诱变育种技术(如化学、辐射诱变等)等对目标植物进行改造，使其具有编码如上谷氨酰胺合成酶突变体的基因，进而获得草铵膦抗性并能够正常生长和发育的植物新品种。因此，无论采用何种技术，只要其利用了本发明提供的谷氨酰胺合成酶突变体赋予植物草铵膦抗性，均属于本发明的保护范围。
在一种可选的实施方式中，目的植物选自小麦、水稻、大麦、燕麦、玉米、高粱、谷子、荞麦、黍稷、甘薯、马铃薯、棉花、油菜、芝麻、花生、向日葵、萝卜、胡萝卜、花椰菜、番茄、茄子、辣椒、韭菜、大葱、洋葱、韭葱、菠菜、芹菜、苋菜、莴苣、茼蒿、黄花菜、葡萄、草莓、甘蔗、烟草、芸薹属蔬菜、葫芦科植物、豆科植物、牧草、茶或木薯。
在一种可选的实施方式中，所述牧草选自禾本科牧草或豆科牧草。
在一种可选的实施方式中，所述芸薹属蔬菜选自芜菁、白菜、芥菜、甘蓝、芥蓝、菜苔、苦芥、擎蓝、芸苔、青菜或甜菜。
在一种可选的实施方式中，所述葫芦科植物选自黄瓜、西葫芦、南瓜、冬瓜、苦瓜、丝瓜、菜瓜、西瓜或甜瓜。
在一种可选的实施方式中，所述豆科植物选自绿豆、蚕豆、豌豆、扁豆、大豆、菜豆、豇豆或毛豆。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体，具有用于构建转化植物的表达载体、及培育抗草铵膦作物的应用潜力。本发明提供的谷氨酰胺合成酶突变体原始来源于植物，更容易被消费者接受。通过突变后具有了草铵膦抗性，转化该谷氨酰胺合成酶突变体的植物不仅具有适于商业化应用的草铵膦抗性，也能够保持谷氨酰胺合成酶正常的酶催化活性，可以满足植物正常的生长和发育。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1提供的水稻GS1突变体OG57A、OG57C、OG57D、OG57E、OG57F、OG57H、OG57I、OG57K、OG57L、OG57M、OG57N、OG57P、OG57Q、OG57R、OG57S、OG57V、OG57W、OG57Y和OG57X和野生型水稻GS1 OWT的氨基酸序列部分比对结果；
图2为本发明实施例2提供的大豆GS1突变体GG57C、GG57D、GG57E、GG57F、GG57H、GG57I、GG57K、GG57L、GG57M、GG57N、GG57P、GG57Q、GG57R、GG57S、GG57T、GG57V、GG57W、GG57Y和GG57X和野生型大豆GS1 GWT的氨基酸序列部分比对结果；
图3为本发明实施例3提供的玉米GS1突变体ZG57C、ZG57D、ZG57E、ZG57F、ZG57H、ZG57I、ZG57K、ZG57L、ZG57M、ZG57N、ZG57P、ZG57Q、ZG57R、ZG57S、ZG57T、ZG57V、ZG57W、ZG57Y和ZG57X和野生型玉米GS1 ZWT的氨基酸序列部分比对结果；
图4为本发明实施例4提供的小麦GS1突变体TG57C、TG57E、TG57F、TG57I、TG57M、TG57N、TG57P、TG57S、TG57T、TG57Y和TG57X和野生型小麦GS1 TWT的氨基酸序列部分比对结果；
图5为本发明实施例5提供的油菜GS1突变体BG57C、BG57D、BG57E、BG57F、BG57H、BG57I、BG57K、BG57L、BG57M、BG57N、BG57P、BG57Q、BG57R、BG57S、BG57T、BG57V、BG57W、BG57Y和BG57X和野生型油菜GS1 BWT的氨基酸序列部分比对结果；
图6为本发明实验例1提供的pADV7载体的结构示意图；
图7为本发明实验例1提供的转化实施例1提供的水稻GS1突变体OG57A、OG57C、OG57D、OG57E、OG57F、OG57H、OG57I、OG57K、OG57L、OG57M、OG57N、OG57P、OG57Q、OG57R、OG57S、OG57V、OG57W、OG57Y和OG57X和野生型水稻GS1 OWT的大肠杆菌在含不同浓度草铵膦的培养基上的生长结果；
图8为本发明实验例2提供的转化实施例2提供的大豆GS1突变体GG57C、GG57D、GG57E、GG57F、GG57H、GG57I、GG57K、GG57L、GG57M、GG57N、GG57P、GG57Q、GG57R、GG57S、GG57T、GG57V、GG57W、GG57Y和GG57X和野生型大豆GS1 GWT的大肠杆菌在含不同浓度草铵膦的培养基上的生长结果；
图9为本发明实验例3提供的转化实施例3提供的玉米GS1突变体ZG57C、ZG57D、ZG57E、ZG57F、ZG57H、ZG57I、ZG57K、ZG57L、ZG57M、ZG57N、ZG57P、ZG57Q、ZG57R、ZG57S、ZG57T、ZG57V、ZG57W、ZG57Y和ZG57X和野生型玉米GS1 ZWT的大肠杆菌在含不同浓度草铵膦的培养基上的生长结果；
图10为本发明实验例4提供的转化实施例4提供的小麦GS1突变体TG57C、TG57E、TG57F、TG57I、TG57M、TG57N、TG57P、TG57S、TG57T、TG57Y和TG57X和野生型小麦GS1 TWT的大肠杆菌在含不同浓度草铵膦的培养基上的生长结果；
图11为本发明实验例5提供的转化实施例5提供的油菜GS1突变体BG57C、BG57D、BG57E、BG57F、BG57H、BG57I、BG57K、BG57L、BG57M、BG57N、BG57P、BG57Q、BG57R、BG57S、BG57T、BG57V、BG57W、BG57Y和BG57X和野生型油菜GS1 BWT的大肠杆菌在含不同浓度草铵膦的培养基上的生长结果；
图12为本发明实验例6提供的水稻GS1突变体OG57P、大豆GS1突变体GG57P、玉米GS1突变体ZG57P、小麦GS1突变体TG57P、油菜GS1突变体BG57P、野生型水稻GS1 OWT、野生型大豆GS1 GWT、野生型玉米GS1 ZWT、野生型小麦GS1 TWT和野生型油菜GS1 BWT的草铵膦抗性参数IC50；
图13为不同植物野生型谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列比对结果；图中：TWT：小麦野生型谷氨酰胺合成酶体；OWT：水稻野生型谷氨酰胺合成酶体；ZWT：玉米野生型谷氨酰胺合成酶体；GWT：大豆野生型谷氨酰胺合成酶体；BWT：油菜野生型谷氨酰胺合成酶体。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试，但现在描述一些方法和材料。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。
除非另外指明，否则实践本发明将采用植物生理学、植物分子遗传学、细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《植物生理学》(苍晶等人，2017)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《当代分子生物学方法(Current Protocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《植物分子遗传学》(Monica A.Hughes等人著)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
本实施例及实验例中，X＝删除，是指野生型谷氨酰胺合成酶第n位氨基酸被删除，即缺失突变。
实施例1
本实施例提供的水稻(Oryza sativa)谷氨酰胺合成酶(GS1)突变体，其由野生型水稻谷氨酰胺合成酶自身(命名为OWT，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码核苷酸序列为SEQ ID NO.6)的第57位氨基酸残基G突变为A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W、Y或删除得到，得到的水稻GS1突变体分别命名为OG57A、OG57C、OG57D、OG57E、OG57F、OG57H、OG57I、OG57K、OG57L、OG57M、OG57N、OG57P、OG57Q、OG57R、OG57S、OG57V、OG57W、OG57Y和OG57X。
水稻GS1突变体OG57A、OG57C、OG57D、OG57E、OG57F、OG57H、OG57I、OG57K、OG57L、OG57M、OG57N、OG57P、OG57Q、OG57R、OG57S、OG57V、OG57W、OG57Y和OG57X和野生型水稻GS1OWT的氨基酸序列比对如图1所示，图中：箭头所指示的位置为突变位点。
本实施例中，各水稻GS1突变体的编码序列在编码第57位氨基酸的位置上，对应氨基酸所用的密码子如下表所示，其余位置的核苷酸同相应的野生型编码序列。
本实施例提供的水稻GS1突变体OG57A、OG57C、OG57D、OG57E、OG57F、OG57H、OG57I、OG57K、OG57L、OG57M、OG57N、OG57P、OG57Q、OG57R、OG57S、OG57V、OG57W、OG57Y和OG57X和编码它们的核酸分子均可以通过化学合成的方法获得。
实施例2
本实施例提供的大豆(Glycine max)GS1突变体，其由野生型大豆GS1自身(命名为GWT，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码核苷酸序列为SEQ ID NO.8)的第57位(对应于参考序列(SEQ ID NO.1)的第57位)由氨基酸残基G突变为C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y或删除得到。得到的大豆GS1突变体分别命名为GG57C、GG57D、GG57E、GG57F、GG57H、GG57I、GG57K、GG57L、GG57M、GG57N、GG57P、GG57Q、GG57R、GG57S、GG57T、GG57V、GG57W、GG57Y和GG57X。
大豆GS1突变体GG57C、GG57D、GG57E、GG57F、GG57H、GG57I、GG57K、GG57L、GG57M、GG57N、GG57P、GG57Q、GG57R、GG57S、GG57T、GG57V、GG57W、GG57Y和GG57X和野生型大豆GS1GWT的氨基酸序列比对如图2所示，图中：箭头所指示的位置为突变位点。
本实施例提供的大豆GS1突变体GG57C、GG57D、GG57E、GG57F、GG57H、GG57I、GG57K、GG57L、GG57M、GG57N、GG57P、GG57Q、GG57R、GG57S、GG57T、GG57V、GG57W、GG57Y和GG57X的编码序列对应于SEQ ID NO.3。
本实施例中，各大豆GS1突变体的编码序列在编码第57位氨基酸的位置上，对应氨基酸所用的密码子如下表所示，其余位置的核苷酸同相应的野生型编码序列。
本实施例提供的大豆GS1突变体GG57C、GG57D、GG57E、GG57F、GG57H、GG57I、GG57K、GG57L、GG57M、GG57N、GG57P、GG57Q、GG57R、GG57S、GG57T、GG57V、GG57W、GG57Y和GG57X和编码它们的核酸分子均可以通过化学合成的方法获得。
实施例3
本实施例提供的玉米(Zea mays)GS1突变体，其由野生型玉米GS1自身(命名为ZWT，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码核苷酸序列为SEQ ID NO.7)的第57位(对应于参考序列(SEQ ID NO.1)的第57位)由氨基酸残基G突变为C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y或删除得到。得到的玉米GS1突变体分别命名为ZG57C、ZG57D、ZG57E、ZG57F、ZG57H、ZG57I、ZG57K、ZG57L、ZG57M、ZG57N、ZG57P、ZG57Q、ZG57R、ZG57S、ZG57T、ZG57V、ZG57W、ZG57Y和ZG57X。
玉米GS1突变体ZG57C、ZG57D、ZG57E、ZG57F、ZG57H、ZG57I、ZG57K、ZG57L、ZG57M、ZG57N、ZG57P、ZG57Q、ZG57R、ZG57S、ZG57T、ZG57V、ZG57W、ZG57Y和ZG57X和野生型玉米GS1ZWT的氨基酸序列比对如图3所示，图中：箭头所指示的位置为突变位点。
本实施例中，各玉米GS1突变体的编码序列在编码第57位氨基酸的位置上，对应氨基酸所用的密码子如下表所示，其余位置的核苷酸同相应的野生型编码序列。
本实施例提供的玉米GS1突变体ZG57C、ZG57D、ZG57E、ZG57F、ZG57H、ZG57I、ZG57K、ZG57L、ZG57M、ZG57N、ZG57P、ZG57Q、ZG57R、ZG57S、ZG57T、ZG57V、ZG57W、ZG57Y和ZG57X和编码它们的核酸分子均可以通过化学合成的方法获得。
实施例4
本实施例提供的小麦(Triticum aestivum)GS1突变体，其由野生型小麦GS1自身(命名为TWT，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码核苷酸序列为SEQ ID NO.9)的第57位(对应于参考序列(SEQ ID NO.1)的第57位)由氨基酸残基G突变为C、E、F、I、M、N、P、S、T、Y或删除得到。得到的小麦GS1突变体分别命名为TG57C、TG57E、TG57F、TG57I、TG57M、TG57N、TG57P、TG57S、TG57T、TG57Y和TG57X。
小麦GS1突变体TG57C、TG57E、TG57F、TG57I、TG57M、TG57N、TG57P、TG57S、TG57T、TG57Y和TG57X和野生型小麦GS1 TWT的氨基酸序列比对如图4所示，图中：箭头所指示的位置为突变位点。
本实施例中，各小麦GS1突变体的编码序列在编码第57位氨基酸的位置上，对应氨基酸所用的密码子如下表所示，其余位置的核苷酸同相应的野生型编码序列。
本实施例提供的小麦GS1突变体TG57C、TG57E、TG57F、TG57I、TG57M、TG57N、TG57P、TG57S、TG57T、TG57Y和TG57X和编码它们的核酸分子均可以通过化学合成的方法获得。
实施例5
本实施例提供的油菜(Brassica napus)GS1突变体，其由野生型油菜GS1自身(命名为BWT，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码核苷酸序列为SEQ ID NO.10)的第57位(对应于参考序列(SEQ ID NO.1)的第57位)由氨基酸残基G突变为C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y或删除得到。得到的油菜GS1突变体分别命名为BG57C、BG57D、BG57E、BG57F、BG57H、BG57I、BG57K、BG57L、BG57M、BG57N、BG57P、BG57Q、BG57R、BG57S、BG57T、BG57V、BG57W、BG57Y和BG57X。
油菜GS1突变体BG57C、BG57D、BG57E、BG57F、BG57H、BG57I、BG57K、BG57L、BG57M、BG57N、BG57P、BG57Q、BG57R、BG57S、BG57T、BG57V、BG57W、BG57Y和BG57X和野生型油菜GS1BWT的氨基酸序列比对如图5所示，图中：箭头所指示的位置为突变位点。
本实施例中，各油菜GS1突变体的编码序列在编码第57位氨基酸的位置上，对应氨基酸所用的密码子如下表所示，其余位置的核苷酸同相应的野生型编码序列。
本实施例提供的油菜GS1突变体BG57C、BG57D、BG57E、BG57F、BG57H、BG57I、BG57K、BG57L、BG57M、BG57N、BG57P、BG57Q、BG57R、BG57S、BG57T、BG57V、BG57W、BG57Y和BG57X和编码它们的核酸分子均可以通过化学合成的方法获得。
实验例1
检测实施例1提供的水稻GS1突变体OG57A、OG57C、OG57D、OG57E、OG57F、OG57H、OG57I、OG57K、OG57L、OG57M、OG57N、OG57P、OG57Q、OG57R、OG57S、OG57V、OG57W、OG57Y和OG57X的草铵膦抗性，方法如下：
根据实施例1提供的核酸分子的序列，采用化学合成的方法合成编码水稻GS1突变体OG57A、OG57C、OG57D、OG57E、OG57F、OG57H、OG57I、OG57K、OG57L、OG57M、OG57N、OG57P、OG57Q、OG57R、OG57S、OG57V、OG57W、OG57Y和OG57X的编码基因，两端引入酶切位点(Pac1和Sbf1)，酶切后，在连接酶的作用下连接至经相同酶切处理后的表达载体(例如pADV7载体，其结构如图6所示)上，然后分别转化谷氨酰胺合成酶缺陷型大肠杆菌，经验证后，挑取阳性克隆，接种至含不同浓度草铵膦的M9培养基上生长，观察缺陷型大肠杆菌生长情况。以野生型水稻GS1突变体作为负对照，检测含有GS1突变体OG57A(G57A，水稻GS1的第57位的氨基酸G突变为A)、OG57C(G57C)、OG57D(G57D)、OG57E(G57E)、OG57F(G57F)、OG57H(G57H)、OG57I(G57I)、OG57K(G57K)、OG57L(G57L)、OG57M(G57M)、OG57N(G57N)、OG57P(G57P)、OG57Q(G57Q)、OG57R(G57R)、OG57S(G57S)、OG57V(G57V)、OG57W(G57W)、OG57Y(G57Y)和OG57X(G57Δ，水稻GS1的第57位的氨基酸G删除)的草铵膦抗性。结果如图7所示。
在含0mM草铵膦(KP0)的培养基上，转化编码野生型水稻GS1(OWT)及水稻GS1突变体OG57A、OG57C、OG57D、OG57E、OG57F、OG57H、OG57I、OG57K、OG57L、OG57M、OG57N、OG57P、OG57Q、OG57R、OG57S、OG57V、OG57W、OG57Y和OG57X的编码基因的缺陷型菌株均能正常生长，表明由OG57A、OG57C、OG57D、OG57E、OG57F、OG57H、OG57I、OG57K、OG57L、OG57M、OG57N、OG57P、OG57Q、OG57R、OG57S、OG57V、OG57W、OG57Y和OG57X编码的GS1都具有正常GS1酶活力；
在含5mM草铵膦(KP5)的培养基上，转化野生型水稻GS1 OWT的大肠杆菌不能生长，但转化了水稻突变体OG57A、OG57C、OG57D、OG57E、OG57F、OG57H、OG57I、OG57K、OG57L、OG57M、OG57N、OG57P、OG57Q、OG57R、OG57S、OG57V、OG57W、OG57Y和OG57X的大肠杆菌生长明显优于负对照，说明含OG57A、OG57C、OG57D、OG57E、OG57F、OG57H、OG57I、OG57K、OG57L、OG57M、OG57N、OG57P、OG57Q、OG57R、OG57S、OG57V、OG57W、OG57Y和OG57X的单突变体抗草铵膦的能力明显优于野生型；在更好草铵膦浓度(20mM，KP20)的培养基上，转化水稻GS1突变体OG57D、OG57E、OG57F、OG57H、OG57I、OG57L、OG57M、OG57P、OG57Q、OG57S、OG57V、OG57W、OG57Y和OG57X的大肠杆菌都还有明显生长。
这些结果说明OG57A、OG57C、OG57D、OG57E、OG57F、OG57H、OG57I、OG57K、OG57L、OG57M、OG57N、OG57P、OG57Q、OG57R、OG57S、OG57V、OG57W、OG57Y和OG57X的单突变体都具有抗草铵膦的能力。
实验例2
参考实验例1的检测方法，验证实施例2提供的大豆GS1突变体GG57C(G57C，大豆GS1的第57位的氨基酸G突变为C)、GG57D(G57D)、GG57E(G57E)、GG57F(G57F)、GG57H(G57H)、GG57I(G57I)、GG57K(G57K)、GG57L(G57L)、GG57M(G57M)、GG57N(G57N)、GG57P(G57P)、GG57Q(G57Q)、GG57R(G57R)、GG57S(G57S)、GG57T(G57T)、GG57V(G57V)、GG57W(G57W)、GG57Y(G57Y)和GG57X(G57Δ，大豆GS1的第57位的氨基酸G删除)的草铵膦抗性。结果如图8所示。
根据图8的结果可看出：
在含0mM草铵膦(KP0)的培养基上，转化编码野生型大豆GS1(GWT)及大豆GS1突变体GG57C、GG57D、GG57E、GG57F、GG57H、GG57I、GG57K、GG57L、GG57M、GG57N、GG57P、GG57Q、GG57R、GG57S、GG57T、GG57V、GG57W、GG57Y的编码基因的缺陷型菌株均能正常生长，表明由GG57C、GG57D、GG57E、GG57F、GG57H、GG57I、GG57K、GG57L、GG57M、GG57N、GG57P、GG57Q、GG57R、GG57S、GG57T、GG57V、GG57W、GG57Y编码的GS1都具有正常GS1酶活力；
在含1mM草铵膦(KP1)的培养基上，转化野生型大豆GS1的大肠杆菌基本上不能生长，但转化了大豆突变体GG57C、GG57D、GG57E、GG57F、GG57H、GG57I、GG57K、GG57L、GG57M、GG57N、GG57P、GG57Q、GG57R、GG57S、GG57T、GG57V、GG57W、GG57Y和GG57X的大肠杆菌生长明显优于负对照，说明含GG57C、GG57D、GG57E、GG57F、GG57H、GG57I、GG57K、GG57L、GG57M、GG57N、GG57P、GG57Q、GG57R、GG57S、GG57T、GG57V、GG57W、GG57Y和GG57X的单突变体抗草铵膦的能力明显优于野生型；在更高草铵膦浓度(20mM，KP20)的培养基上，转化大豆GS1突变体GG57P和GG57T的大肠杆菌都还有明显生长。
这些结果说明GG57C、GG57D、GG57E、GG57F、GG57H、GG57I、GG57K、GG57L、GG57M、GG57N、GG57P、GG57Q、GG57R、GG57S、GG57T、GG57V、GG57W、GG57Y和GG57X的单突变体都具有抗草铵膦的能力，且大豆GS1突变体GG57P和GG57T的抗草铵膦能力更强。
实验例3
参考实验例1的检测方法，验证实施例3提供的玉米GS1突变体ZG57C(G57C，玉米GS1的第57位的氨基酸G突变为C)、ZG57D(G57D)、ZG57E(G57E)、ZG57F(G57F)、ZG57H(G57H)、ZG57I(G57I)、ZG57K(G57K)、ZG57L(G57L)、ZG57M(G57M)、ZG57N(G57N)、ZG57P(G57P)、ZG57Q(G57Q)、ZG57R(G57R)、ZG57S(G57S)、ZG57T(G57T)、ZG57V(G57V)、ZG57W(G57W)、ZG57Y(G57Y)和ZG57X(G57Δ，玉米GS1的第57位的氨基酸G删除)的草铵膦抗性。结果如图9所示。
根据图9的结果可看出：
在含0mM草铵膦(KP0)的培养基上，转化编码野生型玉米GS1(ZWT)及玉米GS1突变体ZG57C、ZG57D、ZG57E、ZG57F、ZG57H、ZG57I、ZG57K、ZG57L、ZG57M、ZG57N、ZG57P、ZG57Q、ZG57R、ZG57S、ZG57T、ZG57V、ZG57Y的编码基因的缺陷型菌株均能正常生长，表明由ZG57C、ZG57D、ZG57E、ZG57F、ZG57H、ZG57I、ZG57K、ZG57L、ZG57M、ZG57N、ZG57P、ZG57Q、ZG57R、ZG57S、ZG57T、ZG57V、ZG57Y编码的GS1都具有正常GS1酶活力；
在含5mM草铵膦(KP5)的培养基上，转化野生型玉米GS1的大肠杆菌不能生长，但转化了玉米突变体ZG57C、ZG57D、ZG57E、ZG57F、ZG57H、ZG57I、ZG57K、ZG57L、ZG57M、ZG57N、ZG57P、ZG57Q、ZG57R、ZG57S、ZG57T、ZG57V、ZG57W、ZG57Y和ZG57X的大肠杆菌生长明显优于负对照，说明含ZG57C、ZG57D、ZG57E、ZG57F、ZG57H、ZG57I、ZG57K、ZG57L、ZG57M、ZG57N、ZG57P、ZG57Q、ZG57R、ZG57S、ZG57T、ZG57V、ZG57W、ZG57Y和ZG57X的单突变体抗草铵膦的能力明显优于野生型；在更高草铵膦浓度(20mM，KP20)的培养基上，转化玉米GS1突变体ZG57C、ZG57D、ZG57E、ZG57F、ZG57H、ZG57I、ZG57K、ZG57L、ZG57M、ZG57N、ZG57P、ZG57Q、ZG57R、ZG57T、ZG57V、ZG57W、ZG57Y和ZG57X的大肠杆菌都还有明显生长。
这些结果说明ZG57C、ZG57D、ZG57E、ZG57F、ZG57H、ZG57I、ZG57K、ZG57L、ZG57M、ZG57N、ZG57P、ZG57Q、ZG57R、ZG57S、ZG57T、ZG57V、ZG57W、ZG57Y和ZG57X的单突变体都具有抗草铵膦的能力。
实验例4
参考实验例1的检测方法，验证实施例4提供的小麦GS1突变体TG57C(G57C，小麦GS1的第57位的氨基酸G突变为C)、TG57E(G57E)、TG57F(G57F)、TG57I(G57I)、TG57M(G57M)、TG57N(G57N)、TG57P(G57P)、TG57S(G57S)、TG57T(G57T)、TG57Y(G57Y)和TG57X(G57Δ，小麦GS1的第57位的氨基酸G进行删除)的草铵膦抗性。结果如图10所示。
根据图10的结果可看出：
在含0mM草铵膦(KP0)的培养基上，转化编码野生型小麦GS1(TWT)及小麦GS1突变体TG57C、TG57E、TG57F、TG57I、TG57M、TG57N、TG57P、TG57S、TG57T、TG57Y和TG57X的编码基因的缺陷型菌株均能正常生长，表明由TG57C、TG57E、TG57F、TG57I、TG57M、TG57N、TG57P、TG57S、TG57T、TG57Y和TG57X编码的GS1都具有正常GS1酶活力；
在含1mM草铵膦(KP1)的培养基上，转化野生型小麦GS1的大肠杆菌基本上不能生长，但转化了小麦突变体TG57C、TG57E、TG57F、TG57I、TG57M、TG57N、TG57P、TG57S、TG57T、TG57Y和TG57X的大肠杆菌生长明显优于负对照，说明含TG57C、TG57E、TG57F、TG57I、TG57M、TG57N、TG57P、TG57S、TG57T、TG57Y和TG57X的单突变体抗草铵膦的能力明显优于野生型；在更高草铵膦浓度(20mM，KP20)的培养基上，转化小麦GS1突变体TG57C、TG57E、TG57F、TG57M、TG57N、TG57P、TG57S、TG57Y和TG57X的大肠杆菌都还有明显生长。
这些结果说明TG57C、TG57E、TG57F、TG57I、TG57M、TG57N、TG57P、TG57S、TG57T、TG57Y和TG57X的单突变体都具有抗草铵膦的能力。
实验例5
参考实验例1的检测方法，验证实施例5提供的油菜GS1突变体BG57C(G57C，油菜GS1的第57位的氨基酸G突变为C)、BG57D(G57D)、BG57E(G57E)、BG57F(G57F)、BG57H(G57H)、BG57I(G57I)、BG57K(G57K)、BG57L(G57L)、BG57M(G57M)、BG57N(G57N)、BG57P(G57P)、BG57Q(G57Q)、BG57R(G57R)、BG57S(G57S)、BG57T(G57T)、BG57V(G57V)、BG57W(G57W)、BG57Y(G57Y)和BG57X(G57Δ，油菜GS1的第57位的氨基酸G进行删除)的草铵膦抗性。结果如图11所示。
根据图11的结果可看出：
在含0mM草铵膦(KP0)的培养基上，转化编码野生型油菜GS1(BWT)及油菜GS1突变体BG57C、BG57D、BG57E、BG57F、BG57H、BG57I、BG57K、BG57L、BG57M、BG57N、BG57P、BG57Q、BG57R、BG57S、BG57T、BG57V、BG57W、BG57Y的编码基因的缺陷型菌株均能正常生长，表明由BG57C、BG57D、BG57E、BG57F、BG57H、BG57I、BG57K、BG57L、BG57M、BG57N、BG57P、BG57Q、BG57R、BG57S、BG57T、BG57V、BG57W、BG57Y编码的GS1都具有正常GS1酶活力；
在含1mM草铵膦(KP1)的培养基上，转化野生型油菜GS1的大肠杆菌基本上不能生长，但转化了油菜突变体BG57C、BG57D、BG57E、BG57F、BG57H、BG57I、BG57K、BG57L、BG57M、BG57N、BG57P、BG57Q、BG57R、BG57S、BG57T、BG57V、BG57W、BG57Y和BG57X的大肠杆菌生长明显优于负对照，说明含BG57C、BG57D、BG57E、BG57F、BG57H、BG57I、BG57K、BG57L、BG57M、BG57N、BG57P、BG57Q、BG57R、BG57S、BG57T、BG57V、BG57W、BG57Y和BG57X的单突变体抗草铵膦的能力明显优于野生型；在更高草铵膦浓度(20mM，KP20)的培养基上，转化油菜GS1突变体BG57C、BG57D、BG57E、BG57F、BG57K、BG57L、BG57M、BG57N、BG57P、BG57Q、BG57R、BG57W和BG57X的大肠杆菌都还有明显生长。
这些结果说明BG57C、BG57D、BG57E、BG57F、BG57H、BG57I、BG57K、BG57L、BG57M、BG57N、BG57P、BG57Q、BG57R、BG57S、BG57T、BG57V、BG57W、BG57Y和BG57X的单突变体都具有抗草铵膦的能力，且油菜GS1突变体BG57C、BG57D、BG57E、BG57F、BG57K、BG57L、BG57M、BG57N、BG57P、BG57Q、BG57R、BG57W和BG57X的抗草铵膦能力更强。
实验例6
检测实施例1提供的OG57P、实施例2提供的GG57P、实施例3提供的ZG57P、实施例4提供的TG57P和实施例5提供的BG57P突变体在有草铵膦时的酶动力学参数，以野生型水稻GS1 OWT、野生型大豆GS1GWT、野生型玉米GS1 ZWT、野生型小麦GS1 TWT和野生型油菜GS1BWT为对照，方法如下：
载体构建：
将编码上述突变体的核酸序列克隆到原核表达载体pET32a中，测序验证克隆。
6His蛋白纯化：
通过6His和用标准方法纯化突变体酶蛋白，用Bradford法蛋白浓度测定试剂盒测定浓度，蛋白保存在蛋白贮存液中。
酶活测定：
1.仪器和试剂：酶标仪(德铁：HBS-1096A)，草铵膦(利尔化学股份有限公司)，底物L-谷氨酸钠(CAS：6106-04-3)。
2.操作步骤：
谷氨酰胺合成酶酶活测定反应液组分为：100mM Tris-HCl(pH7.5)，5mM ATP，10mML-谷氨酸钠，30mM hydroxylamine，20mM MgCl2。100μl反应液混匀后35℃预热5min后，加入1μl突变体蛋白液(蛋白浓度为200ug/ml)开始反应，35℃反应60min后，加入110μl反应终止液(55g/L FeCl3·6H2O，20g/L三氯乙酸，2.1％浓盐酸)终止反应，静置10min。5000×g离心10min，取200μl在500nm处测定光吸收值。
结果如图12所示。
根据图12的结果可以看出：
野生型对照OWT、GWT、ZWT、TWT、BWT对草铵膦很敏感，IC50分别为7.93μM、13.55μM、8.92μM、7.22μM和1.53μM，突变体OG57P、GG57P、ZG57P、TG57P和BG57P的IC50远远高于野生型对照，表明突变体对草铵膦更不敏感。从突变体IC50和野生型IC50的倍数关系上也可以看出，OG57P、GG57P、ZG57P、TG57P和BG57P的IC50分别是对应野生型GS1 IC50的74.36倍、61.20倍、44.24倍、20.60倍和481.95倍，这些数据从酶动力学上说明了突变体的谷氨酰胺合成酶酶活力保持了较高的水平，也说明了抗草铵膦机制。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川天豫兴禾生物科技有限公司
<120> 一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、核酸分子及应用
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> PRT
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<400> 1
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<213> 人工序列
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<212> PRT
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<212> PRT
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tatgtggtta cttccatgat tgcagacaca accattctgt ggaagccatg a 1071
<210> 9
<211> 1071
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atggcgctcc tcaccgatct cctcaacctc gacctcaccg actccacgga gaagatcatc 60
gccgagtaca tatggatcgg cggatctggc atggatctca ggagcaaagc caggaccctc 120
cccggcccgg tcaccgaccc cagcaagctg cccaagtgga actacgacgg ctccagcacc 180
ggccaggccc ccggcgagga cagcgaggtc atcctgtacc cacaggccat cttcaaggac 240
ccgttcagga agggcaacaa catccttgtc atgtgcgatt gctacacccc agctggagtg 300
ccaatcccca ccaacaagag atacaacgct gccaagatct ttagcaaccc tgatgttgcc 360
aaggaggagc catggtacgg tatcgagcag gagtacaccc tcctacagaa ggacatcaac 420
tggcctctcg gctggcctgt tggtggattc cctggtcctc agggtcctta ctactgtagt 480
attggtgctg acaagtcgtt tgggcgtgac atagttgact cccactacaa ggcctgcctc 540
tttgccggcg tcaacatcag tggcatcaac ggcgaggtca tgcccggaca gtgggagttc 600
caagttggcc cgactgtcgg catctctgct ggtgaccaag tgtgggttgc tcgctacctt 660
cttgagagga tcactgagat cgccggagtt gtcgtcacat ttgaccccaa gcccatccca 720
ggcgactgga acggtgctgg tgctcacaca aactacagta ccgagtcgat gaggaaggac 780
ggcgggttca aggtcatcgt ggacgctgtc gagaagctca agctgaagca caaggagcac 840
atcgccgcct acggcgaggg caacgagcgc cgtctcaccg gcaagcacga aaccgccgac 900
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<210> 10
<211> 1071
<212> DNA
<213> 人工序列
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gcggaataca tatgggttgg aggttcagga atggatatga gaagcaaagc caggactctt 120
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