基于头孢菌素母核的7位立体异构体衍生物在抑制金属β-内酰胺酶和耐药细菌中的应用
阅读说明：本技术 基于头孢菌素母核的7位立体异构体衍生物在抑制金属β-内酰胺酶和耐药细菌中的应用 (Application of 7-position stereoisomer derivative based on cephalosporin parent nucleus in inhibiting metallo beta-lactamase and drug-resistant bacteria ) 是由 谢贺新 胡立强 薛淑媛 毛梧宇 于 2021-05-17 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种基于头孢菌素母核的7位立体异构体衍生物及其在抑制金属β-内酰胺酶和耐药细菌中的应用。具体地,本发明提供了一种如式I所示的化合物或其药学上可接受的盐,其中各基团如文中定义。该类化合物具有优异的金属β-内酰胺酶抑制活性以及与抗生素联用时可有效抑制耐药菌的生长。(The invention provides a 7-bit stereoisomer derivative based on a cephalosporin mother nucleus and application thereof in inhibiting metallo-beta-lactamase and drug-resistant bacteria. Specifically, the invention provides a compound shown as a formula I or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein each group is defined as the specification. The compound has excellent metallo-beta-lactamase inhibitory activity and can effectively inhibit the growth of drug-resistant bacteria when being combined with antibiotics.)
技术领域
本发明属于药物化学和药物治疗学领域，具体涉及一类基于头孢菌素母核的7位立体异构体衍生物在抑制金属β-内酰胺酶和耐药细菌中的应用。
背景技术
自青霉素首次应用于临床以来，β-内酰胺抗生素已成为治疗细菌感染的主要手段。然而随着这类药物的大量使用，对β-内酰胺类抗生素耐药的致病菌逐渐出现并在全世界范围内迅速扩散，目前已成为全球一个严重的公共健康问题。
细菌表达β-内酰胺酶是它们获得对β-内酰胺抗生素耐药的最主要方式，这类酶能快速水解破坏β-内酰胺抗生素的内酰胺环使其失活。值得警惕的是，部分金属β-内酰胺酶能水解目前临床所用的绝大多数β-内酰胺抗生素，这一特点引起人们的极大恐慌。
在抵抗细菌β-内酰胺抗生素耐药的几种方式中β-内酰胺酶抑制剂和抗生素的联合应用是一种行之有效的策略。遗憾的是，现在临床上使用的β-内酰胺酶抑制剂(如，克拉维酸，舒巴坦，他唑巴坦)对金属β-内酰胺酶(MBLs)并没有抑制作用。而且，到目前为止尚未有一种金属β-内酰胺酶抑制剂被批准用于临床。在表达金属β-内酰胺酶致病菌迅速扩散的形势下，金属β-内酰胺酶抑制剂的研制迫在眉睫。
综上所述，本领域急需开发一类优异的金属β-内酰胺酶抑制能应用于临床治疗。
发明内容
本发明的目的就是提供一种新的具有金属β-内酰胺酶抑制活性的药物。
在本发明的第一方面中，提供了一种化合物或其药学上可接受的盐，所述的化合物如式I所示
其中，
X选自下组：S、SO(即S＝O)或SO2；
R1选自下组：H、羟基、取代或未取代的C1-6烷氧基(较佳地，C1-2烷氧基)、取代或未取代的C1-6烷硫基(较佳地，C1-2烷硫基)、-NHCOR5；较佳地，R1选自下组：羟基、取代或未取代的C1-6烷氧基(较佳地，C1-2烷氧基)、取代或未取代的C1-6烷硫基(较佳地，C1-2烷硫基)、-NHCOR5；
R2选自下组：H、-NHCOR5；较佳地，R2为H；
R3选自下组：H、-W1-R6或-W1-CO-R6；
W1选自下组：O、S、Se；
R6为任选地被1、2或3个R8基团所取代的选自下组的基团：H、取代或未取代的C1-6烷基、取代或未取代的C3-10环烷基、取代或未取代的3至10元杂环基、取代或未取代的C6-10芳基、取代或未取代的5至10元杂芳基、-COR7；
R8各自独立地选自下组：硝基、卤素、取代或未取代的C1-6烷基、取代或未取代的C1-6卤代烷基、-NHCOR7、-COOR7、-COR7；或者位于相邻原子上的2个R8基团任选地结合形成、取代或未取代的C3-10环烷基(较佳地，C3-C7环烷基)、取代或未取代的3至10元杂环基(较佳地，3-7元杂环基)、取代或未取代的C6-10芳基(较佳地，苯基)、取代或未取代的5至10元杂芳基(较佳地，5或6元杂芳基)；
R4选自下组：H、取代或未取代的C1-6烷基、一价阳离子；
R5和R7各自独立地选自下组：取代或未取代的C1-6烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的5或6元杂芳基、取代或未取代的C1-4亚烷基-苯基、取代或未取代的C1-4亚烷基-5或6元杂芳基；
除非特别说明，所述取代是指基团中一个或多个氢任选地被选自下组的取代基所取代：卤素、C1-4烷基、C1-4卤代烷基。
在另一优选例中，所述C6-10芳基选自下组：苯基、萘基。
在另一优选例中，所述5至10元杂芳基选自下组：
其中，
代表双键或单键；
环Ar1选自下组：无、苯基、5或6元杂芳基；
W2各自独立地为N或C
W3选自下组：O、S、NH；
W4选自下组：C、NH。
在另一优选例中，所述5至10元杂芳基如下所示
其中，环Ar1选自下组：无、苯基、5或6元杂芳基；W2为N或C。
在另一优选例中，所述5至10元杂芳基选自下组：
在另一优选例中，所述一价阳离子选自下组：K、Na。
在另一优选例中，X为S。
在另一优选例中，R1和R2为不同的基团。
在另一优选例中，R1选自下组：羟基、取代或未取代的C1-6烷氧基(较佳地，C1-2烷氧基)、取代或未取代的C1-6烷硫基(较佳地，C1-2烷硫基)、-NHCOR5；并且R2为H。
在另一优选例中，R1选自下组：取代或未取代的C1-6烷氧基(较佳地，C1-2烷氧基)、取代或未取代的C1-6烷硫基(较佳地，C1-2烷硫基)；并且R2为H。
在另一优选例中，R1为取代或未取代的C1-6烷氧基；并且R2为H。
在另一优选例中，R1选自下组：甲氧基(-OMe)、乙氧基(-OEt)、甲硫基(-SMe)、乙硫基(-SEt)；并且R2为H。
在另一优选例中，R1为甲氧基；且R2为H。
在另一优选例中，R6为任选地被1、2或3个R8基团所取代的选自下组的基团：取代或未取代的C6-10芳基、取代或未取代的5至10元杂芳基。
在另一优选例中，R3为-W1-R6或-W1-CO-R6。
在另一优选例中，W1选自下组：S、Se。
在另一优选例中，R3为-W1-R6或-W1-CO-R6，并且W1选自下组：S、Se。
在另一优选例中，R6为任选地被1、2或3个R8基团所取代的选自下组的基团：取代或未取代的C6-10芳基、取代或未取代的5至10元杂芳基。
在另一优选例中，R6为任选地被1、2或3个R8基团所取代的选自下组的基团：
在另一优选例中，R6选自下组：
其中，n＝1、2或3。
在另一优选例中，R3为-W1-R6或-W1-CO-R6，W1选自下组：S、Se；并且R6为任选地被1、2或3个R8基团所取代的选自下组的基团：取代或未取代的C6-10芳基、取代或未取代的5至10元杂芳基。
在另一优选例中，X为S；R1为取代或未取代的C1-6烷氧基(较佳地，C1-2烷氧基)、取代或未取代的C1-6烷硫基(较佳地，C1-2烷硫基)；R2为H；以及其余变量如前定义。
在另一优选例中，X为S；R1为取代或未取代的C1-6烷氧基(较佳地，C1-2烷氧基)、取代或未取代的C1-6烷硫基(较佳地，C1-2烷硫基)；R2为H；R3为-W1-R6或-W1-CO-R6；W1选自下组：O、S、Se；R6为任选地被1、2或3个R8基团所取代的选自下组的基团：取代或未取代的C6-10芳基、取代或未取代的5至10元杂芳基；以及其余变量如前定义。
在另一优选例中，X为S；R1为取代或未取代的C1-6烷氧基(较佳地，C1-2烷氧基)、取代或未取代的C1-6烷硫基(较佳地，C1-2烷硫基)；R2为H；R3为-W1-R6或-W1-CO-R6；W1选自下组：S、Se；R6为任选地被1、2或3个R8基团所取代的选自下组的基团：取代或未取代的C6-10芳基、取代或未取代的5至10元杂芳基；以及其余变量如前定义。
在另一优选例中，X为S；R1为取代或未取代的C1-2烷氧基、取代或未取代的C1-2烷硫基；R2为H；R3为-W1-R6；W1选自下组：O、S、Se；R6为任选地被1、2或3个R8基团所取代的选自下组的基团：取代或未取代的C6-10芳基、取代或未取代的5至10元杂芳基；以及其余变量如前定义。
在另一优选例中，X为S；R1为取代或未取代的C1-2烷氧基、取代或未取代的C1-2烷硫基；R2为H；R3为-W1-R6；W1选自下组：S、Se；R6为任选地被1、2或3个R8基团所取代的选自下组的基团：取代或未取代的C6-10芳基、取代或未取代的5至10元杂芳基；以及其余变量如前定义。
在另一优选例中，X、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、W1、W2、W3、W4、n各自独立地为表A所示具体化合物中对应的具体基团。
在另一优选例中，所述的化合物选自表A；
表A
或它们药学上可接受的盐。
在另一优选例中，所述化合物为选自A的化合物1b、1f、1g、1h、1i、1j、1k、1l、1m、1n、1o、1p、1q、1r、1s、1t、1u、1v、1w，或它们药学上可接受的盐。
在另一优选例中，所述化合物的至少90％，较佳地，至少95％，更佳地，至少98％，最佳地，至少99％不含其它异构体。
在另一优选例中，所述化合物不含其它异构体。
在本发明的第二方面中，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：
(a1)第一活性成分：如第一方面所述的化合物或其药学上可接受的盐；和
(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述药物组合物还包括：(a2)第二活性成分：至少一种抗生素。
在另一优选例中，所述药物组合物包括：
(a1)第一活性成分：如如第一方面所述的化合物或其异构体或其药学上可接受的盐；
(a2)任选地第二活性成分：至少一种抗生素；和
(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，在所述药物组合物中，第一活性成分和第二活性成分的质量比为1:100～100:1。
在另一优选例中，活性成分的含量为0.1～99.9wt％，以组合物的总质量计；其中，所述活性成分包括第一活性成分和第二活性成分。
在另一优选例中，所示抗生素为碳青霉烯类抗生素。
在另一优选例中，所述抗生素包括：美罗培南、亚胺培南、头孢他啶，或它们的组合。
在本发明的第三方面中，提供了一种如第一方面所述的化合物或其药学上可接受的盐或如第二方面所述的药物组合物在制备用于治疗或预防由致病菌引起的的疾病的药物中的用途。
在另一优选例中，所述的致病菌为耐药致病菌。
在另一优选例中，所述的致病菌为能够表达金属β-内酰胺酶的致病菌。
在另一优选例中，所述金属β-内酰胺酶包括：NDM-1、NDM-3、NDM-4、NDM-12、NDM-13、VIM-27、IMP-1或它们的组合。
在另一优选例中，所述的致病菌包括：大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、绿脓杆菌、变形杆菌、沙门氏菌，或它们的组合。
在另一优选例中，所述由致病菌引起的疾病包括：脓肿、伤口感染、淋巴管炎、尿路感染等细菌引起的感染、或它们的组合。
在本发明的第四方面中，提供了一种如第一方面所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备金属β-内酰胺酶抑制剂中的用途。
在另一优选例中，所述金属β-内酰胺酶包括：NDM-1、NDM-3、NDM-4、NDM-12、NDM-13、VIM-27、IMP-1或它们的组合。
在另一优选例中，所述金属β-内酰胺酶至少包括：NDM-1。
在本发明的第五方面中，提供一种用于杀灭或抑制致病菌的药物组合，所述的药物组合包括：
(a1)包含第一活性成分的组合物或药物；和(a2)包含第二活性成分的组合物或药物；
其中，第一活性成分为如第一方面所述的化合物或其药学上可接受的盐；所述第二活性成分包括至少一种抗生素。
在另一优选例中，在所述药物组合中，第一活性成分和第二活性成分的质量比为1:100～100:1。
在本发明的第六方面中，提供了一种如第一方面所述的化合物或其药学上可接受的盐与至少一种抗生素联用用途，用于杀灭或抑制致病菌或者用于治疗和/或预防由致病菌引起的疾病。
在本发明的第七方面中，提供了一种抑制或杀灭致病菌的方法，包括步骤：使致病菌与如第一方面所述的化合物或其药学上可接受的盐接触；或者使致病菌与第一活性成分和第二活性成分接触，从而抑制或杀灭致病菌；其中，第一活性成分为如第一方面所述的化合物或其药学上可接受的盐；所述第二活性成分包括至少一种抗生素。
在另一优选例中，所述致病菌如前定义。
在另一优选例中，所述的方法是体外非治疗性的。
在另一优选例中，所述的方法是治疗性的或预防性的。
在另一优选例中，使致病菌同时与第一活性成分和第二活性成分接触。
在另一优选例中，使致病菌分别与第一活性成分和第二活性成分接触。
在另一优选例中，使致病菌依次与第二活性成分接触和第一活性成分接触。
在本发明的第八方面中，提供了一种抑制金属β-内酰胺酶的方法，包括步骤：使β-内酰胺酶与如第一方面所述的化合物或其药学上可接受的盐接触，从而抑制β-内酰胺酶的活性。
在另一优选例中，所述的方法是体外非治疗的。
在本发明的第九方面中，提供了一种治疗和/或预防由致病菌引起的疾病的方法，其中，所述的方法包括步骤：
向需要的对象施用如第一方面所述的化合物或其异构体或其药学上可接受的盐和任选地至少一种金属β-内酰胺类抗生素，或施用如第二方面所述的药物组合物，或施用如第三方面所述的药物组合；或者施用包含第一活性成分的组合物或药物和第二活性成分或包含第一活性成分的组合物或药物。
在另一优选例中，所述对象包括人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，向需要的对象同时施用第一活性成分或包含第一活性成分的组合物或药物和第二活性成分或包含第一活性成分的组合物或药物。
在另一优选例中，向需要的对象间隔施用第一活性成分或包含第一活性成分的组合物或药物和第二活性成分或包含第一活性成分的组合物或药物。
在本发明的第十方面中，提供了一种如第一方面所述化合物的制备方法，所述制备方法包括步骤：
(1)使式II化合物和R6-W1H或R6-CO-W1H反应，从而得到式I-a化合物；
(2)使式I-a化合物任选地进行脱保护反应，和任选地进一步进行酯化反应或成盐反应，从而得到如式I所示的化合物；
其中，
RP选自下组：R4、保护基团(如PMB、CHPh2)；
RL选自下组：卤素(较佳地，为Cl)、-OCOC1-6烷基；
R3为-W1-R6或-W1-CO-R6
X、W1、R1、R2、R4和R6如第一方面中定义。
在另一优选例中，步骤(1)的反应在惰性溶剂中进行。
在另一优选例中，当RL为卤素时，步骤(1)包括步骤：
(1.1)在惰性溶剂中，使式II化合物在NaI的存在下反应；
(1.2)向步骤(1.1)得到的反应体系中加入NaHCO3和R6-W1H或R6-CO-W1H，继续反应，从而得到式I-a化合物。
在另一优选例中，步骤(1.1)和(1.2)的反应在0～40℃(较佳地，15～30℃，更佳地，室温)下进行。
在另一优选例中，当RL为-OCOC1-6烷基时，步骤(1)包括步骤：
在NaHCO3的存在下，使式II化合物和R6-W1H或R6-CO-W1H反应，从而得到式I-a化合物。
在另一优选例中，步骤(1)中，所述反应在加热至40～80℃(如60℃)条件下进行。
在另一优选例中，当R1选自下组：取代或未取代的C1-6烷氧基、取代或未取代的C1-6烷硫基，且R2为H时，式II化合物通过包括如下步骤的方法制备：
(S1)在惰性溶剂中，使式IV化合物在PCl5和吡啶的存在下反应，从而得到式III化合物；
(S2)在惰性溶剂中，在酸存在下，在≤10℃(优选地，≤0℃)下，使式III化合物与亚硝酸盐进行重氮化反应，从而得到式III化合物的重氮盐；向所述含式III化合物的重氮盐的反应混合物中加入能够引入R1的亲核试剂(如当R1为羟基、取代或未取代的C1-6烷氧基或取代或未取代的C1-6烷硫基时，所述亲核试剂可为H-R1)在对甲苯磺酸催化下进行反应，从而得到式II化合物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示CDC-1的结构及其检测β-内酰胺酶活性的机理
图2显示了基于头孢菌素母核的C7位立体异构体衍生物1b对NDM-1的抑制效果。其中图2a展示了化合物1a和1b的化学结构；图2b显示了在存在或者不存在1b时NDM-1水解CDC-1的反应速率；图2c显示了化合物1a和1b分别抑制NDM-1的IC50差异。
图3a展示了化合物1b、美罗培南(MEM)和头孢噻吩(CEF)的化学结构。图3b比较了等浓度的1b、美罗培南(MEM)或者头孢噻吩(CEF)分别抑制NDM-1的活性差异。
图4显示了化合物1u和碳青霉烯类抗生素(美罗培南)对模型大肠杆菌(pBAD/Myc-HisA-NDM-1-DH5α)的联合给药实验结果。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入地努力，发现对头孢菌素母核的7位进行特定的修饰或改造后意外地得到了一类能有效抑制金属β-内酰胺酶活性的小分子化合物，并且这些化合物和抗生素联用时能有效降低抗生素抑制耐药细菌的MIC(minimal inhibitconcentration)。基于此，发明人完成了本发明。
特别地，基于头孢菌素母核的C7位立体异构体衍生物的意外发现还包括(1)头孢菌素母核C7位为S-构型且位阻相对较小的取代基可使此类化合物具有提升的抑制金属β-内酰胺酶NDM-1的活性；(2)头孢菌素母核5位硫原子的存在状态以硫醚最佳；(3)头孢菌素母核3′位离去基团才能有利于提升此类化合物有抑制金属β-内酰胺酶NDM-1的活性。
术语
在本文中，除非特别说明，各缩写或术语具有本领域技术人员所熟知的义。
如本文所用，“卤素”指F、Cl、Br、和I。更佳地，卤原子选自F、Cl和Br。
除非另有表述，术语“烷基”本身或作为另一取代基的一部分是指具有指定碳原子数的直链或支链烃基(即，C1-6表示1-6个碳)。烷基的例子包括甲基(Me)、乙基(Et)、正丙基(nPr)、异丙基(iPr)、正丁基(nBu)、叔丁基(tBu)、异丁基(iBu)、仲丁基(sBu)、正戊基(Am)、正己基(Hx)、正庚基(Heptyl)、正辛基(Octyl)等。
如本文所用，“卤代烷基”如前定义的烷基被一个或多个卤素所取代。卤代烷基的例子包括三氟甲基。
术语"烷氧基"和"烷硫基"(或硫代烷氧基)以其常规意义使用，指代分别经氧原子或硫原子连接于分子的其余部分的那些烷基。
术语“环烷基”是指具有指定环原子数(例如，C3-10环烷基)并且完全饱和的或在环顶之间具有不超过一个双键的烃环。优选地，在本文中环烷基具有3、4、5、6、7、8、9或10个环原子(即C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、或C10环烷基)“环烷基”也指双环和多环烃环。术语“杂环烷基”或“杂环基”是指含有1至5个选自N、O和S的杂原子的环烷基，其中氮和硫原子任选被氧化，且氮原子任选被季铵化。杂环烷基可以是单环、双环或多环体系。杂环烷基的非限制性例子包括吡咯烷、咪唑烷、吡唑烷、丁内酰胺、戊内酰胺、四氢呋喃、四氢噻吩、奎宁环等。杂环烷基可以经环碳或杂原子连接于分子的其余部分。
术语“亚烷基”本身或作为另一取代基的一部分是指衍生自烷烃的二价基团，例如-CH2CH2-、-CH2-。烷基(或亚烷基)通常具有1-2个碳原子。
除非另有表述，术语“芳基”表示多不饱和的(通常芳香性)的烃基，其可以是单环或稠合在一起或共价连接的多环(最多二环)。一般地，芳基具有6到10碳环原子(即C6-10芳基)，更优选地，具有6个碳环原子即苯基。术语"杂芳基"是指含有1至5个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环)，其中氮和硫原子任选被氧化，氮原子任选被季铵化。一般地，杂芳基具有5至10个环原子，即5至10元杂芳基，更优选地具有5或6个环原子，即5或6元杂芳环。杂芳基可通过杂原子连接于分子的其余部分。芳基的非限制性例子包括苯基、萘基和联苯基，而杂芳基的非限制性例子包括噻二唑基、苯并噻唑基、吡啶基等、噁唑基、异噁唑基、吡咯基、噻唑基、呋喃基、噻吩基等。
如本文所用，术语“杂原子”意在包括氧(O)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)。
如本文所用，术语“酰胺基团”是指包括-NHCO-的基团。例如，NHCOBn。
如本文所用，各基团缩写具有下表所示的含义
Bn
苄基
p-NHAc
对位取代的-NHAc
Me
甲基
Ac
乙酰基
Bz
苯甲酰基
Ph
苯基
Et
乙基
p-CF<sub>3</sub>
对位取代的CF<sub>3</sub>
PMB
对甲氧基苄基
金属β-内酰胺酶抑制剂
Ambler分类法基于氨基酸序列的同源性将β-内酰胺酶分为A、B、C、D类。A、C、D类是以丝氨酸为活性中心的丝氨酸β-内酰胺酶(SBLs)，B类酶则为以锌离子为活性中心的金属β-内酰胺酶(MBLs)。
虽然目前表达丝氨酸类β-内酰胺酶(SBLs)的细菌在临床上占据主要地位，但人们在这类酶的抑制剂方面已取得长足进步。金属β-内酰胺酶(MBLs)的出现又让我们在战胜致病菌的征途上受到了更加严重的威胁。例如表达NDM-1的肺炎克雷伯链球菌的全球迅速扩散是一个突出的例子。金属β-内酰胺酶最引人们关注的是部分金属β-内酰胺酶对目前临床上使用的几乎所有β-内酰胺抗生素和抑制剂均表现出了耐药性。
丝氨酸类β-内酰胺酶水解β-内酰胺抗生素通过了丝氨酸亲核进攻β-内酰胺环形成的酶-乙酰化中间体，然而金属β-内酰胺酶所具有的独特进化机制，使其依赖于酶活性位点结合的锌离子所介导的-OH发起对β-内酰胺环的亲核进攻。这种非共价作用的方式对于金属β-内酰胺酶的抑制剂设计造成一定的挑战性。此外，由于B类酶的多样性(B1、B2、B3)以及其依赖于一个或两个Zn2+离子水解机制的复杂性严重阻碍了抑制剂的研发进展。为了解决上述问题，本发明人设计合成了一类基于头孢菌素母核的7位立体异构体化合物，在经研究测试后意外地发现该类化合物具有较好的抑制金属β-内酰胺酶的活性。而且这类化合物制备工艺简洁和制备成本低，有望被开发为一类新的金属β-内酰胺酶抑制剂或抗生素药物。
因此，本发明的第一个目的是提供一类新颖的基于头孢菌素母核的7位立体异构体化合物作为潜在的金属β-内酰胺酶抑制剂，所述的化合物如式I所示
其中，X、R1、R2、R3和R4如第一方面中定义。
在一个具体实施方案中，所述化合物具有以下结构通式：
式中，R1为S构型的烷氧基、烷硫基、羟基、酰胺基团；R2为R构型氢或酰胺基团；R3为硫醚、硒醚、硫代酸酯、或酯；R4为H+，或Na+,K+等一价阳离子；或者药学上可接受的盐。
表1本发明所述的一系列基于头孢菌素母核的7位立体异构体衍生物
进一步，所述的基于头孢菌素母核的7位立体异构体化合物的优先结构及名称见表1
药物组合物和施用方法
在本文中，“本发明化合物”或“基于头孢菌素母核的7位立体异构体”或“头孢菌素类衍生物”可以互换使用是指如第一方面所述的化合物。
由于本发明所涉及的化合物具有优异的抑制金属β-内酰胺酶的能力，并且与抗生素联用时具有优异的抗菌作用。因此本发明化合物及其各种晶型，药学上可接受的无机或有机盐，以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物，或者药物组合等可用于治疗、预防和/或缓解由致病菌引起的疾病，尤其是由耐药菌和/或能够表达根据现有技术，本发明化合物可用于治疗以下疾病：伤口感染、组织发炎、呼吸道感染、泌尿系统感染、腹腔细菌感染、败血症等细菌引起的感染等。
本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物(式I化合物)或其药理上可接受的盐。优选地，本发明的组合物还包括至少一种β-内酰胺类抗生素。本发明的药物组合物还可包括药理上可以接受的赋形剂或载体。
“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有10-500mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。
“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，可以通过常规方式施用于所需的对象(如人和非人哺乳动物)。代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、注射(如静脉内、肌肉内或皮下)和吸入(如雾化吸入)等给药。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放(即缓释制剂)。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
本发明的药物组合也可以被制成粉剂用于雾化吸入。
本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物(例如与抗生素如碳青霉烯类抗生素)联合给药。
使用本发明药物组合物时，是将安全有效量的药物施用于哺乳动物(如人或非人哺乳动物)，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重(每日)，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重，更佳地，为1～20mg/kg体重，最佳地，1-5mg/kg体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
金属β-内酰胺酶抑制剂的制备方法
本发明的第二个目的是提供本文所述的β-内酰胺酶抑制剂的制备方法或的合成方法。
进一步，本发明化合物在头孢菌素母核的基础上，按照不同化合物的结构差异提供了以下五类方法合成潜在的金属β-内酰胺酶抑制剂。第一类：头孢菌素母核3′位亲核取代和7位甲氧基的引入，以1a和1c的合成为例；第二类：7位为S-构型的烷氧基、烷硫基和羟基取代的头孢菌素类化合物的合成，以1b的合成为例；第三类：以头孢菌素为母核的亚砜和砜类化合物的合成，以1d和1e的合成为例；第四类：头孢菌素3′位无离去基团的化合物的合成，以1w的合成为例；第五类：7位为S-构型酰胺结构的头孢菌素类化合物的合成，以1x的合成为例。化合物通用合成方法主要包括以下步骤：
第一类：头孢菌素母核3′位亲核取代和7位甲氧基的引入反应
(1)化合物1a的合成
室温下，将GCLE和NaI溶于无水DMF中搅拌反应10min，接着将硫代苯甲酸和NaHCO3加入反应液继续搅拌1h,TLC监测GCLE消失后用乙酸乙酯稀释，并依次用饱和氯化铵和饱和食盐水洗涤。有机相用无水NaSO4干燥，过滤浓缩后，通过硅胶色谱柱纯化得化合物1。
在0℃下，将化合物1加入DCM/TFA/TIPS/H2O的酸性混合溶液反应30min。HPLC监测反应完全后，接着加入乙腈，在20℃左右真空旋蒸除去大量的有机溶剂和三氟乙酸，最后以含有0.1％三氟乙酸的乙腈-水体系作为流动相通过C18制备柱纯化，冷冻干燥得到白色固体产物1a。
(2)化合物1c的合成
在氮气保护下，将LiOMe溶于干燥的THF和干燥的MeOH中后冷却至-78℃，再将化合物1的THF溶液缓慢滴入，接着加入叔丁基次氯酸脂反应搅拌1h。反应完毕，将反应液倒入冰冷的饱和NH4Cl中，用乙酸乙酯萃取，有机相依次用饱和食盐水洗涤，无水MgSO4干燥后用短硅胶柱纯化得化合物2的粗产品。接着，将化合物2加入DCM/TFA/TIPS/H2O的酸性混合溶液反应30min。HPLC监测反应完全后，接着加入乙腈低温旋蒸，除去大量的有机溶剂和三氟乙酸，最后以含有0.1％三氟乙酸的乙腈-水体系作为流动相通过C18制备柱纯化，冷冻干燥的白色固体产物1c。
第二类：7位为S-构型的烷氧基、烷硫基和羟基取代的头孢菌素类化合物的合成
化合物1b的合成
将PCl5加入干燥的二氯甲烷中形成悬浮液,待反应液冷却至0℃后缓慢滴加吡啶继续搅拌30min。再将GCLE加入上述反应液中0℃反应2h，接着将反应液冷却至-50℃后加入甲醇在-50～-20℃反应1h。反应液真空旋蒸，除去二氯甲烷,在0℃下加入H2O搅拌30min后，依次加入乙酸乙酯和甲基叔丁基醚继续搅拌2h，待固体完全析出后过滤，冷冻干燥得化合物3粗产品。
在0℃下，将化合物3溶于二氯甲烷后，加入NaNO2水溶液同时缓慢滴入2MH2SO4剧烈搅拌1h。静置分离有机，水相用二氯甲烷洗涤三次后合并，用饱和食盐水洗涤，无水MgSO4干燥后过滤，得化合物3的重氮盐溶液。在0℃下，向该重氮盐溶液中加入MeOH，接着分批加入对甲苯磺酸，随后移除冰浴，反应继续在室温下反应2h。反应完成后，将反应液倒入水中，饱和食盐水洗涤，有机相用无水MgSO4干燥浓缩，硅胶色谱柱纯化得化合物4。
室温下，将化合物4溶于DMF中，加入NaI反应30min。接着加入硫代苯甲酸和NaHCO3继续反应1h，反应完毕后加入乙酸乙酯稀释，依次用水和饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥后色谱柱纯化得化合物5粗产品。
将化合物5溶于二氯甲烷中，冷却至0℃后加入三异丙基硅烷TIPS，接着滴加三氟乙酸，反应搅拌30min。HPLC分析反应完毕后加入乙腈稀释，旋蒸除去溶剂，利用反向C18柱分离纯化得化合物1b。
第三类：以头孢菌素为母核的亚砜和砜类化合物的合成
(1)化合物1d的合成
在0℃下，将化合物4溶于二氯甲烷中，接着分批加入1.1当量间氯过氧苯甲酸，该混合液搅拌反应30min至TLC监测化合物4完全消失。随后加入二氯甲烷稀释，依次用亚硫酸钠水溶液，饱和食盐水洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥，用短硅胶柱纯化得化合物6的粗产品。后续操作同化合物1a的合成相似。最终经过反向C18制备纯化，冷冻干燥得化合物1d。
(2)化合物1e的合成
加入3当量间氯过氧苯甲酸后，硫原子将被氧化为砜结构，后续操作与化合物1e的合成相同，最终得到化合物1e
第四类：头孢菌素3′位无离去基团的化合物的合成
化合物1w的合成
在0℃下，将二氧化锰快速加入二苯甲酮腙和无水硫酸镁的二氯甲烷悬浮液中。该反应混合物室温下搅拌6h后被过滤，生成的二苯基重氮甲烷溶液未经处理直接用于下一步。在0℃下，将7-ADCA溶于CH2Cl2/MeOH＝3/2的混合溶液中，随后加入二苯基重氮甲烷溶液搅拌直到颜色消退。该反应混合液依次用水洗涤，再用饱和食盐水涤，有机相用无水MgSO4干燥后过滤，旋蒸浓缩除去溶剂后，用短硅胶色谱柱纯化得化合物10的粗产品。后续反应和化合物4的合成方法一致，经过重氮化后用甲醇亲核进攻，再脱去二苯甲基保护。最后得化合物1w。
第五类：7位为S-构型酰胺结构的头孢菌素类化合物的合成
化合物1x的合成
在0℃下，将化合物12和苯乙酰氯溶于无水乙腈中，接着滴入吡啶。该反应混合物移除冰浴，在室温下继续搅拌2h。待TLC监测反应完全后，反应液用乙酸乙酸稀释，接着依次用水,饱和食盐水洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，虑液浓缩，再用短硅胶柱纯化得化合物13的粗产品。在0℃下，将化合物13加入到DCM/TFA/TIPS的酸性混合物溶液中，反应混合液持续搅拌1h。待反应完全后加入乙腈稀释。在0℃下旋蒸浓缩，剩余残渣用石油醚/乙酸乙酯洗涤即可得到化合物14的粗产品。随后，将化合物14溶于磷酸盐的缓冲溶液，接着加入碳酸氢钠和硫代苯甲酸，该反应混合物在60℃搅拌12h。经HPLC监测反应完全后，反应液冷却至室温，用1N HCl调节pH大约在2左右。水相接着用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤，旋蒸浓缩，所得残渣用反向C18制备柱纯化得到1x。
本发明化合物在抑制金属β-内酰胺酶活性中的应用
本发明的第三个目的是提供所述头孢菌素衍生物作为潜在的金属β-内酰胺酶抑制剂在抑制酶活性中的应用；为了实现该目的，本发明提供了该类衍生物在抑制金属β-内酰胺酶活性中的具体测试方法。
进一步，所述应用包括以下步骤：
在室温下，将12组不同浓度的本发明分别加入到96孔板中，与此同时每个孔中加入一定浓度的金属β-内酰胺酶混匀并孵育10min，然后加入荧光底物CDC-1并立即用酶标仪测试其30min内荧光强度变化(激发波长365nm,发射波长460nm)。最后通过每个孔中的荧光增强变化情况来推算所述化合物抑制金属β-内酰胺酶的IC50值。CDC-1的结构和检测机理如图1所示。
本发明化合物与抗生素联合用药
本发明的第四个目的是提供该类头孢菌素类衍生物作为作为潜在的金属β-内酰胺酶抑制剂和临床上常见的抗生素联合用药时在抑制表达金属β-内酰胺酶细菌中的应用。为了实现该目的，本发明提供了以下技术方案。
进一步，所述应用包括以下步骤：
(1)将不同浓度的本发明化合物与菌液混合，在37℃下进行培养。以确定所述的本发明化合物对实验中所用细菌的抑制作用不会对联合用药的实验产生干扰；
(2)将不同浓度的碳青霉烯类抗生素(如美罗培南)以及本发明化合物和菌液(包括构建的模型菌)混合后在37℃下进行孵育。并设置碳青霉烯类抗生素(如美罗培南)和菌液单独混合的对照组；
(3)测试不同组菌液在600nm处的吸光度(OD600)，推算加和不加本发明化合物时，抗生素能够抑制细菌生长的最低浓度值(MIC)的变化，以此来评估本发明中所提供的化合物作为金属β-内酰胺酶抑制剂的潜在可能性。
本发明的第五个目的是提供所述的头孢菌素类衍生物作为新型β-内酰胺抗生素在抑制表达金属β-内酰胺酶的耐药致病菌生长中的应用。为实现该目的，本发明提供了头孢菌素类衍生物作为新型β-内酰胺抗生素在抑制表达金属β-内酰胺酶的模型菌中的具体应用方法
进一步，所述应用包括以下步骤：
(1)将不同浓度的头孢菌素类衍生物和菌液混合后在37℃下孵育。
(2)测试不同组菌液在600nm处的吸光度(OD600)，推算所述的头孢菌素衍生物抑制细菌生长的最低浓度值(MIC)，以此来评估所述本发明化合物作为金属β-内酰胺类抗生素的潜在可能性。
本发明的主要优点包括
a.本发明的化合物能够有效抑制金属β-内酰胺酶(如NDM-1)的活性。例如本发明的优选化合物1u抑制金属β-内酰胺酶NDM-1的IC50可达0.13±0.01μM，这证明本发明的化合物如化合物1u是优异的金属β-内酰胺酶(如NDM-1)抑制剂。
b.本发明的化合物抑制金属β-内酰胺酶具有一定的广谱性。例如，本发明中的优选化合物1u对金属β-内酰胺酶NDM的五种亚型(NDM-1、NDM-3、NDM-4、NDM-12、NDM-13)均表现出良好的抑制活性。此外，类似化合物1i对IMP-1的IC50可达0.80±0.01μM，化合物1v对VIM-27的抑制活性也可低至1.0±0.1μM。因此该类头孢菌素衍生物有作为广谱金属β-内酰胺酶抑制剂的潜力。
c.本发明的化合物与抗生素联用时能够显著降低抗生素对致病耐药菌的MIC。例如，本发明通过优选化合物1u和美罗培南的联合给药实验，评估了该化合物作为金属β-内酰胺酶抑制剂的可能性，根据实验结果可以看出化合物1u与美罗培南联合使用能够将美罗培南对表达NDM-1模型菌的MIC显著降低4倍。这一结果证明本发明的化合物为解决由细菌表达金属β-内酰胺酶引起的耐药性问题提供了更多可能的解决方案。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
本发明提供的基于头孢菌素母核的小分子化合物，是对头孢菌素母核7位基团进行修饰，最终得到一系列7位为S构型的立体异构体化合物。这类化合物对金属β-内酰胺酶具有优异的抑制活性，可作为潜在的β-内酰胺酶抗生素。当用所述的化合物与已上市的抗生素联合使用的时能明显恢复耐药菌对抗生素的敏感性，可作为潜在的金属β-内酰胺酶抑制剂。所述基于头孢菌素母核的小分子化合物的结构通式：
上式中，R1为S构型氢，羟基，烷氧基，烷硫基，酰胺基。R2为R构型氢，酰胺基团。R3为硫醚，硒醚，硫代酸脂，酯。R4为H+，Na+，K+或者医学上可接受的盐。n为0-2的整数。
除特别说明外，本发明的实施中所涉及到的化学反应均是在室内环境下进行，反应所用溶剂为色谱纯、分析纯或化学纯，所用溶剂的无水化处理均按规定的特殊溶剂处理方法进行处理得到。产品的分析纯化除特殊说明外，均使用硅胶柱色谱法以及通过高效液相色谱(HPLC)的方法。所使用的硅胶为100～200目以及200～300目，HPLC流动相是加有HPLC级的三氟乙酸(0.1％，0.01％(体积比))。1HNMR以及13CNMR用Bruker 400MHz或600MHz型仪器测定，测试溶剂为氘代三氯甲烷(CHCl3)、氘代甲醇(CD3OD)、氘代水(D2O)以及氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)，测试的内标化合物是四甲基硅烷(TMS)。高分辨质谱用ESI-高分辨飞行时间质谱仪(m/z范围：50-4000Da)测定。
实施例1
化合物1a和1c的合成
(6R,7R)-4-甲氧基苄基-3-((苯甲酰硫基)甲基)-8-氧-7-(2-苯乙酰胺基)-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯(1)
室温下，将GCLE(20.0mg,0.04mmol)和NaI(6.0mg,0.04mmol)溶于300μL无水DMF中搅拌反应10min，接着将硫代苯甲酸(11.0mg,0.08mmol)和NaHCO3(6.7mg,0.08mmol)加入反应液继续搅拌1h,TLC监测GCLE消失后用乙酸乙酯(10mL)稀释，并依次用饱和氯化铵(10mL×3)和饱和食盐水(10mL×1)洗涤。有机相用无水NaSO4干燥，过滤浓缩后，通过硅胶色谱柱纯化得化合物1(20.3mg,86％)。
化合物1的结构表征：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.93(d,J＝7.8Hz,2H),7.60(t,J＝7.3Hz,1H),7.46(t,J＝7.6Hz,2H),7.30(m,7H),6.88(d,J＝8.4Hz,2H),6.09(d,J＝9.1Hz,1H),5.80(dd,J＝9.1,4.8Hz,1H),5.30–5.15(m,2H),4.90(d,J＝4.8Hz,1H),4.30(d,J＝13.4Hz,1H),3.97(d,J＝13.4Hz,1H),3.79(s,2H),3.62(m,3H),3.34(d,J＝18.6Hz,1H).13CNMR(151MHz,CDCl3)δ191.43,171.10,164.51,161.61,159.90,136.23,133.88,133.57,130.76,129.46,129.22,128.76,128.56,127.77,127.41,126.82,124.76,113.96,68.00,59.08,57.32,55.26,43.34,30.49,27.66.HRMS(ESI)m/z C31H28N2NaO6S2(M+Na)+计算值：611.1286,实测实：611.1273.
(6R，7R)-3-((苯甲酰硫基)甲基)-8-氧-7-(2-苯乙酰胺基)-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸(1a)
在0℃下，将化合物1(17.6mg,0.03mmol)加入1.0mL的DCM/TFA/TIPS/H2O＝85/10/2.5/2.5的混合溶液反应30min。HPLC监测反应完全后，接着加入30mL乙腈，在20℃左右真空旋蒸，除去大量的有机溶剂和三氟乙酸，最后以含有0.1％三氟乙酸的乙腈-水体系作为流动相通过C18制备柱纯化，冷冻干燥得到白色固体产物1a(9.5mg,68％)。
化合物1a的结构表征：1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ13.67(s,1H),9.10(d,J＝8.3Hz,1H),7.93(d,J＝7.3Hz,2H),7.71(t,J＝7.4Hz,1H),7.56(t,J＝7.7Hz,2H),7.31–7.19(m,5H),5.66(dd,J＝8.2,4.8Hz,1H),5.08(d,J＝4.8Hz,1H),4.31(d,J＝13.3Hz,1H),3.98(d,J＝13.3Hz,1H),3.73(d,J＝18.1Hz,1H),3.55(d,J＝13.9Hz,1H),3.47(d,J＝13.9Hz,1H),3.41(d,J＝18.0Hz,1H).13C NMR(150MHz,d6-DMSO)δ190.79,170.92,164.66,163.01,135.93,135.80,134.17,129.17,129.00,128.21,126.99,126.47,125.63,125.59,58.99,57.50,41.57,30.59,26.78.HRMS(ESI)m/z C23H19N2O5S2(M-H)-计算值：467.0735,实测值：467.0743.
(6R,7S)-3-((苯甲硫基)甲基)-7-甲氧基-8-氧-7-(2-苯乙酰胺基)-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸(1c)
在氮气保护下，将LiOMe(8.9mg,0.23mmol)溶于2.75mL干燥的THF和0.44mL干燥的MeOH中后冷却至-78℃，再将0.8mL化合物1(53.0mg,0.09mmol)的THF溶液缓慢滴入，接着加入叔丁基次氯酸脂(62.0mg,0.11mmol)反应搅拌1h。反应完毕，将反应液倒入冰冷的饱和NH4Cl中，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，有机相依次用饱和食盐水(10mL×1)洗涤，无水MgSO4干燥后用短硅胶柱纯化得化合物2的粗产品。接着，将化合物2加入1.0mL的DCM/TFA/TIPS/H2O＝85/10/2.5/2.5的混合溶液反应30min。HPLC监测反应完全后，接着加入30mL乙腈低温旋蒸，除去大量的有机溶剂和三氟乙酸，最后以含有0.1％三氟乙酸的乙腈-水体系作为流动相通过C18制备柱纯化，冷冻干燥的白色固体产物1c(20.6mg,两步产率46％)。
化合物1c的结构表征：1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ13.78(s,1H),9.42(s,1H),7.92(d,J＝7.2Hz,2H),7.71(t,J＝7.4Hz,1H),7.56(t,J＝7.8Hz,2H),7.32–7.17(m,5H),5.12(s,1H),4.29(d,J＝13.4Hz,1H),3.95(d,J＝13.4Hz,1H),3.66(d,J＝18.1Hz,1H),3.60(d,J＝14.2Hz,1H),3.55(d,J＝14.2Hz,1H),3.33(s,3H),3.26(d,J＝17.9Hz,1H).13C NMR(150MHz,d6-DMSO)δ190.62,171.50,162.71,160.31,135.89,135.59,134.18,129.16,129.13,128.20,127.00,126.80,126.48,125.62,95.08,62.95,52.48,41.67,30.31,27.17.HRMS(ESI)m/z C24H22N2NaO6S2(M+Na)+计算值：521.0817，实测值：521.0804
实施例2
化合物1b及其衍生物的合成
(6R,7S)-4-甲氧基苄-3-(氯甲基)-7-甲氧基-8-氧-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯(4)
将PCl5(2.1g,10.34mmol)加入33.0mL干燥的二氯甲烷中形成悬浮液,待反应液冷却至0℃后缓慢滴加吡啶(0.8mL,10.34mmol)继续搅拌30min。再将GCLE(3.4g,7.0mmol)加入上述反应液中0℃反应2h，接着将反应液冷却至-50℃后加入10.0mL甲醇在-50～-20℃反应1h。反应液真空旋蒸，除去二氯甲烷,在0℃下加入H2O(6.0mL)搅拌30min后，依次加入乙酸乙酯(20mL)和甲基叔丁基醚(150mL)继续搅拌2h，待固体完全析出后过滤，冷冻干燥得化合物3粗产品。
在0℃下，将化合物3溶于二氯甲烷(40.0mL)后，加入40mL的NaNO2(690.0mg，10mmol)水溶液同时缓慢滴入7.6mL 2M H2SO4剧烈搅拌1h。静置分离有机，水相用二氯甲烷(30mL×3)洗涤三次后合并，用饱和食盐水洗涤(30mL×3)，无水MgSO4干燥后过滤，得化合物3的重氮盐溶液。在0℃下，向该重氮盐溶液中加入MeOH(20.0mL,500mmol)，接着分批加入对甲苯磺酸(1.9g,10.0mmol)，随后移除冰浴，反应继续在室温下反应2h。反应完成后，将反应液倒入水(30mL)中，饱和食盐水(30mL×1)洗涤，有机相用无水MgSO4干燥浓缩，硅胶色谱柱纯化得化合物4(0.56g，21％)。
化合物4的结构表征：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.38(d,J＝8.5Hz,2H),6.90(d,J＝8.5Hz,2H),5.31(d,J＝11.8Hz,1H),5.22(d,J＝11.8Hz,1H),4.69(s,1H),4.52(s,1H),4.42(d,J＝11.9Hz,1H),4.31(d,J＝11.8Hz,1H),3.81(s,3H),3.66(d,J＝18.1Hz,1H),3.54(s,3H),3.40(d,J＝18.1Hz,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ161.12,161.06,159.96,130.74,126.91,126.74,122.28,114.00,90.00,68.31,58.28,56.22,55.31,43.39,28.49.HRMS(ESI)m/zC17H18ClNNaO5S(M+Na)+计算值：406.0492,实测值：406.0491.
(6R,7S)-3-((苯甲酰硫基)甲基)-7-甲氧基-8-氧-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0] 辛-2-烯-2-羧酸(1b)
室温下，将化合物4(30.0mg,0.08mmol)溶于1.3mL DMF中，加入NaI(12.0mg,0.08mmol)反应30min。接着加入硫代苯甲酸(16.6mg,0.12mmol)和NaHCO3(6.7mg,0.08mmol)继续反应1h，反应完毕后加入乙酸乙酯(10mL)稀释，依次用水(10mL×3)和饱和食盐水(10mL×1)洗涤，无水Na2SO4干燥色谱柱纯化得28mg化合物5粗产品。
将化合物5溶于1.0mL二氯甲烷中，冷却至0℃后加入0.1mL三异丙基硅烷TIPS，接着滴加0.1mL三氟乙酸。反应搅拌30min。HPLC分析反应完毕后加入30.0mL乙腈稀释，旋蒸除去溶剂，利用反向C18柱分离纯化得化合物1b(15mg，两步产率52％)。
化合物1b的结构表征：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.93(d,J＝7.4Hz,2H),7.71(t,J＝7.4Hz,1H),7.57(t,J＝7.7Hz,2H),4.97(d,J＝1.2Hz,1H),4.71(d,J＝1.2Hz,1H),4.29(d,J＝13.4Hz,1H),3.92(d,J＝13.4Hz,1H),3.74(d,J＝17.9Hz,1H),3.43(s,3H),3.39(d,J＝18.4Hz,1H).13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ191.12,163.30,161.52,136.36,134.65,129.64,127.47,126.93,123.85,89.44,57.74,55.75,30.81,28.61.HRMS(ESI)m/zC16H15NO5S2(M-H)-计算值：364.0313，实测值：364.0317
后续化合物的合成均采用类似化合物1a的合成方法，但均以4或其他其他相应底物为初始原料。
(6R,7S)-3-((苯甲酰硫基)甲基)-7-乙氧基-8-氧-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0] 辛-2-烯-2-羧酸(1f)
化合物1f的产率及结构表征：产率(10.6mg,70％)；1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ7.93(d,J＝7.8Hz,2H),7.71(t,J＝7.3Hz,1H),7.56(t,J＝7.7Hz,2H),4.91(s,1H),4.73(s,1H),4.29(d,J＝13.5Hz,1H),3.92(d,J＝13.4Hz,1H),3.74(d,J＝18.1Hz,1H)),3.70–3.56(m,2H)),1.16(t,J＝7.0Hz,3H).13C NMR(150MHz,d6-DMSO)δ190.64,162.84,161.31,135.90,134.19,129.18,126.99,126.46,123.39,87.83,65.79,56.11,30.33,28.15,15.02.HRMS(ESI)m/z C17H16NO5S2(M-H)–计算值：378.0470,实测值：378.0468.
(6R,7S)-3-((苯甲酰硫基)甲基)-7-异丙氧基-8-氧-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0] 辛-2-烯-2-羧酸(1g)
化合物1g的产率及结构表征：产率(9.6mg,61％)；1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ7.93(d,J＝7.3Hz,2H),7.71(t,J＝7.4Hz,1H),7.56(t,J＝7.7Hz,2H),4.80(d,J＝1.4Hz,1H),4.72(d,J＝1.4Hz,1H),4.28(d,J＝13.5Hz,1H),3.92(d,J＝13.4Hz,1H),3.83(td,J＝12.2,6.1Hz,1H),3.74(d,J＝17.9Hz,1H),1.15(dd,J＝10.5,6.1Hz,6H).13C NMR(150MHz,d6-DMSO)δ190.66,162.87,161.62,135.91,134.19,129.19,127.00,126.53,123.35,86.68,73.28,57.45,30.34,28.17,22.28,22.22.HRMS(ESI)m/z C18H19NNaO5S2(M+Na)+计算值：416.0602,实测值：416.0604.
(6R,7S)-3-(((苯甲酰硫基)甲基)-7-羟基-8-氧-5-硫代-1-氮杂双环[4.2.0]辛- 2-烯-2-羧酸(1h)
化合物1h的产率及结构表征：产率(10.7mg,76％)；1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ7.93(d,J＝7.2Hz,2H),7.71(t,J＝7.4Hz,1H),7.57(t,J＝7.8Hz,2H),5.42(d,J＝1.6Hz,1H),5.10(d,J＝1.6Hz,1H),4.35(d,J＝13.5Hz,1H),3.96(d,J＝13.4Hz,1H),3.76(d,J＝17.9Hz,1H),3.47(d,J＝17.8Hz,1H).13C NMR(150MHz,d6-DMSO)δ190.60,162.58,158.99,135.88,134.22,129.19,127.01,60.21,58.45,30.29,28.26.HRMS(ESI)m/z C15H13NNaO5S2(M+Na)+计算值：374.0133,实测值：374.0124
(6R,7S)-3-((苯甲酰硫基)甲基)-7-(乙硫基)-8-氧-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0] 辛-2-烯-2-羧酸(1i)
化合物1i的产率及结构表征：产率(9.9mg,63％)；1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ7.93(d,J＝7.5Hz,2H),7.71(t,J＝7.4Hz,1H),7.56(t,J＝7.7Hz,2H),4.85(s,1H),4.46(s,1H),4.31(d,J＝13.4Hz,1H),3.94(d,J＝13.3Hz,1H),3.74(d,J＝17.9Hz,1H),2.68(q,J＝7.4Hz,2H),1.23(t,J＝7.4Hz,3H).13CNMR(150MHz,d6-DMSO)δ190.80,190.77,163.32,161.62,135.95,134.19,129.19,127.01,56.49,56.24,30.46,28.32,24.65,14.99.HRMS(ESI)m/z C17H16NO4S3(M-H)-计算值：394.0241,实测值：394.0248
(6R,7S)-7-甲氧基-8-氧-3-((苯硫基)甲基)-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2- 烯-2-羧酸(1j)
化合物1j的产率及结构表征：产率(6.2mg,46％)；1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ7.40–7.36(m,2H),7.34-7.29(m,2H),7.27-7.22(m,1H),4.94(d,J＝1.5Hz,1H),4.71(d,J＝1.6Hz,1H),4.13(d,J＝13.1Hz,1H),3.93(d,J＝13.1Hz,1H),3.71(d,J＝17.6Hz,1H),3.48(d,J＝17.6Hz,1H),3.42(s,2H).13C NMR(150MHz,d6-DMSO)δ163.04,161.01,135.18,129.97,129.14,126.77,88.96,57.32,55.77,35.77,28.44.HRMS(ESI)m/z C15H14NO4S2(M-H)-计算值：336.0364,实测值：336.0375
(6R,7S)-7-甲氧基-8-氧-3-4-((((三氟甲基)苯基)硫代)甲基)-5-硫杂-1-氮杂 双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸(1k)
化合物1k的产率及结构表征：产率(9.4mg,58％)；1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ7.64(d,J＝8.4Hz,2H),7.51(d,J＝8.3Hz,2H),4.98(s,1H),4.72(s,1H),4.19(d,J＝13.0Hz,1H),4.05(d,J＝12.9Hz,1H),3.73(d,J＝17.6Hz,1H),3.50(d,J＝17.6Hz,1H),3.42(s,3H).13C NMR(150MHz,d6-DMSO)δ163.23,161.56,141.98,126.98(q,J＝32.1Hz),126.91,124.67(q,J＝271.8Hz),129.39,126.19,126.16,124.15,89.44,57.77,56.23,35.13,28.87.HRMS(ESI)m/z C16H13F3NO4S2(M-H)-计算值：404.0238,实测值：404.0238
(6R,7S)-3-(((4-(乙酰氧胺基)苯基)硫代)甲基)-7-甲氧基-8-氧-5-硫杂-1-氮 杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸(1l)
化合物1l的产率及结构表征：产率(12.1mg,74％)；1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ10.02(s,1H),7.54(d,J＝8.6Hz,2H),7.32(d,J＝8.6Hz,2H),4.92(d,J＝1.0Hz,1H),4.68(d,J＝1.4Hz,1H),4.07(d,J＝13.1Hz,1H),3.83(d,J＝13.1Hz,1H),3.68(d,J＝17.4Hz,1H),3.47–3.38(m,4H),2.03(s,3H).13C NMR(150MHz,d6-DMSO)δ168.39,162.90,160.98,138.78,132.21,127.67,119.38,88.98,57.30,55.81,36.96,28.47,24.04.HRMS(ESI)m/zC17H17N2O5S2 -(M-H)-计算值：393.0579，实测值：393.0579
(6R,7S)-3-(((乙硫基)甲基)-7-甲氧基-8-氧-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2- 烯-2-羧酸(1m)
化合物1m的产率及结构表征：产率(5.8mg,50％)；1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ5.01(s,1H),4.73(s,1H),3.68(d,J＝17.3Hz,1H),3.56(s,2H),3.52(d,J＝17.5Hz,1H),3.43(s,3H),2.48–2.39(m,2H),1.14(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(150MHz,d6-DMSO)δ163.07,161.11,125.77,125.46,88.94,57.26,55.96,32.14,28.13,24.42,14.74.HRMS(ESI)m/zC11H16NO4S2(M+H)+计算值：290.0521,实测值：290.0507.
(6R,7S)-3-((((2-乙氧基-2-氧乙基)硫代)甲基)-7-甲氧基-8-氧-5-硫杂-1-氮 杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸(1n)
化合物1n的产率及结构表征：产率(5.9mg,43％)；1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ4.98(d,J＝1.5Hz,1H),4.72(d,J＝1.6Hz,1H),4.07(q,J＝7.1Hz,2H),3.68(d,J＝17.5Hz,1H),3.61(s,2H),3.50(d,J＝17.5Hz,1H),3.43(s,3H),3.34(s,2H),1.18(t,J＝7.1Hz,3H).13CNMR(150MHz,d6-DMSO)δ169.70,162.85,160.98,126.10,124.00,88.90,60.81,57.30,55.74,33.22,32.41,28.08,14.01.HRMS(ESI)m/z C13H16NO6S2(M-H)-计算值：346.0419,实测值：346.0422
(6R,7S)-7-甲氧基-8-氧-3-((苯基硒基)甲基)-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛- 2-烯-2-羧酸(1o)
化合物1o的产率及结构表征：产率(9.5mg,62％)；1H NMR(400MHz,d6-DMSO):δ7.57-7.51(m,2H),7.31-7.28(m,3H),4.92(d,J＝1.4Hz,1H),4.69(d,J＝1.5Hz,1H),4.06(d,J＝11.6Hz,1H),3.98(d,J＝11.6Hz,1H),3.71(d,J＝17.4Hz,1H),3.44-3.39(m,4H).13CNMR(150MHz,d6-DMSO)δ162.79,161.11,133.32,129.45,129.28,127.79,127.60,124.87,89.14,57.31,55.96,29.30,28.94.HRMS(ESI)m/z C15H15NNaO4SSe(M+Na)+计算值：407.9785,实测值：407.9768
(6R,7S)-3-(乙酰氧基甲基)-7-甲氧基-8-氧-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2- 烯-2-羧酸(1p)
化合物1p的产率及结构表征：产率(5.1mg,45％)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.09(d,J＝13.5Hz,1H),4.98(d,J＝13.4Hz,1H),4.73(s,1H),4.54(s,1H),3.62(d,J＝18.5Hz,1H),3.56(s,3H),3.40(d,J＝18.4Hz,1H),2.10(s,3H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ170.41,161.90,124.45,88.66,62.49,57.69,55.63,27.27,20.13.HRMS(ESI)m/z C11H12NO6S(M-H)-计算值：286.0385,实测值：286.0395
(6R,7S)-7-甲氧基-8-氧-3-((嘧啶-2-基硫基)甲基)-5-硫杂-1-氮杂双环 [4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸(1q)
化合物1q的产率及结构表征：产率(10.6mg,78％)；1H NMR(400MHz,d6-DMSO):δ8.61(d,J＝4.8Hz,2H),7.24(t,J＝4.9Hz,1H),4.95(d,J＝1.3Hz,1H),4.70(d,J＝1.3Hz,1H),4.55(d,J＝13.6Hz,1H),3.89(d,J＝13.5Hz,1H),3.77(d,J＝17.8Hz,1H),3.48(d,J＝17.8Hz,1H),3.41(s,3H).13CNMR(150MHz,d6-DMSO)δ170.31,163.00,161.04,157.85,126.41,123.56,117.54,88.93,57.26,55.41,32.14,28.34.HRMS(ESI)m/z C13H14N3O4S2(M+H)+计算值：340.0426，实测值：340.0429
(6R,7S)-3-(((1,3,4-噻二唑-2-基)硫代)甲基)-7-甲氧基-8-氧-5-硫杂-1-氮杂 双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸(1r)
化合物1r的产率及结构表征：产率(9.8mg,71％)；1H NMR(400MHz,d6-DMSO):δ9.56(s,1H),4.97(d,J＝1.6Hz,1H),4.73(d,J＝1.6Hz,1H),4.52(d,J＝13.3Hz,1H),4.21(d,J＝13.3Hz,1H),3.78(d,J＝17.8Hz,1H),3.57(d,J＝17.8Hz,1H),3.42(s,3H).13C NMR(150MHz,d6-DMSO)δ164.41,162.73,161.06,154.86,127.27,122.72,88.95,57.32,55.52,35.90,28.31.HRMS(ESI)m/z C11H10N3O4S3(M-H)-计算值：343.9833，实测值：343.9832
(6R,7S)-7-甲氧基-3-(((5-甲基-1,3,4-噻二唑-2-基)硫代)甲基)-8-氧-5-硫 杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸(1s)
化合物1s的产率及结构表征：产率(7.6mg,53％)；1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ4.97(s,1H),4.72(s,1H),4.46(d,J＝13.3Hz,1H),4.15(d,J＝13.3Hz,1H),3.77(d,J＝17.8Hz,1H),3.55(d,J＝18.1Hz,11H),3.43(s,3H),2.68(s,3H)13C NMR(150MHz,d6-DMSO)δ166.27,163.80,162.64,161.03,126.98,123.00,88.92,57.29,55.46,35.70,28.28,15.24.HRMS(ESI)m/zC12H12N3O4S3(M-H)-计算值：357.9990，实测值：357.9986.
(6R,7S)-7-甲氧基-3-(((1-甲基-1H-四唑-5-基)硫代)甲基)-8-氧-5-硫杂-1-氮 杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸(1t)
化合物1t的产率及结构表征：产率(8.9mg,65％)；1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ4.95(d,J＝1.4Hz,1H),4.72(d,J＝1.4Hz,1H),4.33(d,J＝13.4Hz,1H),4.16(d,J＝13.4Hz,1H),3.93(s,3H),3.77(d,J＝17.9Hz,1H),3.58(d,J＝17.9Hz,1H),3.42(s,3H).13C NMR(150MHz,d6-DMSO)δ162.62,161.06,152.95,126.81,123.11,88.97,57.35,55.39,35.33,33.79,28.18.HRMS(ESI)m/z C11H12N5O4S2(M-H)-计算值：342.0331，实测值：342.0331
(6R,7S)-3-((苯并噻唑-2-基硫代)甲基)-7-甲氧基-8-氧-5-硫杂-1-氮杂双环 [4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸(1u)
化合物1u的产率及结构表征：产率(11.7mg,74％)；1H NMR(400MHz,d6-DMSO):δ8.01(d,J＝8.1Hz,1H),7.88(d,J＝8.2Hz,1H),7.47(t,J＝7.5Hz,1H),7.37(t,J＝8.0Hz,1H),4.97(s,1H),4.77(d,J＝13.4Hz,1H),4.72(s,1H),4.18(d,J＝13.0Hz,1H),3.81(d,J＝17.6Hz,1H),3.57(d,J＝16.5Hz,1H),3.41(s,3H).13C NMR(150MHz,d6-DMSO)δ165.59,162.84,161.08,152.44,134.85,127.11,126.36,124.65,122.81,121.84,121.36,88.93,57.28,55.49,34.77,28.38.HRMS(ESI)m/z C16H14N2NaO4S3(M+Na)+计算值：417.0013,实测值：417.0007.
(6R,7S)-7-甲氧基-3-(((6-硝基苯并噻唑-2-基)硫代)甲基)-8-氧-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸(1v)
化合物1v的产率及结构表征：产率(11.9mg,68％)；1H NMR(400MHz,d6-DMSO):δ9.08(d,J＝2.3Hz,1H),8.32(dd,J＝9.0,2.4Hz,1H),8.02(d,J＝9.0Hz,1H),4.98(d,J＝1.5Hz,1H),4.86(d,J＝13.5Hz,1H),4.73(d,J＝1.5Hz,1H),4.22(d,J＝13.3Hz,1H),3.82(d,J＝17.8Hz,2H),3.58(d,J＝17.8Hz,1H),3.41(s,3H).13C NMR(150MHz,d6-DMSO)δ173.63,162.84,161.07,156.25,143.69,135.69,127.38,122.27,121.92,121.32,118.86,88.90,57.28,55.47,35.01,28.36.HRMS(ESI)m/z C16H12N3O6S3(M-H)-计算值：437.9888,实测值：437.9882
实施例3
化合物1d和1e的合成
(6R,7S)-3-((苯甲酰基硫代)甲基)-7-甲氧基-8-氧-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸-5-氧化物(1d)
在0℃下，将化合物4(30mg,0.08mmol)溶于0.8mL二氯甲烷中，接着分批加入间氯过氧苯甲酸(m-CPBA,68％,22mg,0.09mmol)，该混合液搅拌反应30min至TLC监测化合物4完全消失。随后加入二氯甲烷(10mL)稀释，依次用亚硫酸钠水溶液(10mL×2)，饱和食盐水(10mL×1)洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥，用短硅胶柱纯化得化合物6的粗产品。后续操作同化合物1a的合成相似。最终经过反向C18制备纯化，冷冻干燥得化合物1d(16.1mg,三步产率53％)。
化合物1d的结构表征：1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ7.92(d,J＝7.3Hz,2H),7.71(t,J＝7.4Hz,1H),7.57(t,J＝7.7Hz,2H),4.92(s,1H),4.86(s,1H),4.37(d,J＝13.6Hz,1H),3.88(d,J＝13.6Hz,1H),3.75(d,J＝18.5Hz,1H),3.68(d,J＝18.6Hz,1H),3.46(s,3H).13CNMR(150MHz,d6-DMSO)δ190.65,162.20,161.22,135.90,134.24,129.21,126.99,84.59,65.25,57.36,46.60,30.83.HRMS(ESI)m/z C16H15NNaO6S2(M+Na)+计算值：404.0238,实测值：404.0247
(6R,7S)-3-((苯甲酰基硫代)甲基)-7-甲氧基-8-氧-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸5,5-二氧化物(1e)
当加入3当量间氯过氧苯甲酸后，硫原子将被氧化为砜结构，后续操作与化合物1e的合成相同，最终得到化合物1e(13.6mg,三步产率43％)；
化合物1e的结构表征：1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ7.93(d,J＝7.3Hz,2H),7.71(t,J＝7.4Hz,1H),7.57(t,J＝7.7Hz,2H),5.46(s,1H),5.19(d,J＝1.2Hz,1H),4.37(t,J＝15.6Hz,2H),4.17(d,J＝17.9Hz,1H),3.86(d,J＝13.8Hz,1H),3.44(s,3H).13C NMR(150MHz,d6-DMSO)δ190.38,162.01,161.01,135.84,134.29,129.20,127.10,125.14,123.56,83.61,67.98,57.70,51.42,29.86.HRMS(ESI)m/z C16H15NKO7S2(M+K)+计算值：435.9927,实测值：435.9908.
实施例4
化合物1w的合成
(6R,7S)-7-甲氧基-3-甲基-8-氧-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸(1w)
在0℃下，将二氧化锰(0.2g,1.94mmol)快速加入二苯甲酮腙(0.5g,2.79mmol)和无水硫酸镁(0.2g)的二氯甲烷(2.2mL)悬浮液中。该反应混合物室温下搅拌6h后被过滤，生成的二苯基重氮甲烷溶液未经处理直接用于下一步。在0℃下，将7-ADCA(0.3g,1.4mmol)溶于4.5mL CH2Cl2/MeOH＝3/2的混合溶液中，随后加入二苯基重氮甲烷溶液搅拌直到颜色消退。该反应混合液依次用水(10mL×3)洗涤，再用饱和食盐水(10mL×1)洗涤，有机相用无水MgSO4干燥后过滤，旋蒸浓缩除去溶剂后，用短硅胶色谱柱纯化得化合物10的粗产品。后续反应和化合物4的合成方法一致，经过重氮化后用甲醇亲核进攻，再脱去二苯甲基保护。最后得化合物1w(48.1mg,三步产率15％)。
化合物1w的结构表征：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.44(s,1H),4.70(d,J＝1.2Hz,1H),4.51(d,J＝1.3Hz,1H),3.53(d,J＝17.8Hz,4H),3.22(d,J＝18.1Hz,1H),2.20(s,3H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ164.31,162.83,133.93,123.58,89.65,58.34,56.60,32.00,20.19.HRMS(ESI)m/z C9H11NNaO4S(M+Na)+计算值：252.0306,实测值：252.0299
实施例5
化合物1x的合成
(6R,7S)-3-((苯甲酰硫基)甲基)-8-氧-7-(2-苯乙酰胺基)-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸(1x)
在0℃下，将化合物12(61.0mg,0.14mmol)和苯乙酰氯(37.0μl,0.28mmol)溶于无水乙腈(1.4mL)中，接着滴入吡啶(33.0ul,0.41mmol)。该反应混合物移除冰浴，在室温下继续搅拌2h。待TLC监测反应完全后，反应液用乙酸乙酸(10mL)稀释，接着依次用水(10mL×3),饱和食盐水(10mL×1)洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，虑液浓缩，再用短硅胶柱纯化得化合物13的粗产品。在0℃下，将化合物13加入到1.0mL的DCM/TFA/TIPS＝85/10/5混合物溶液中，反应混合液持续搅拌1h。待反应完全后加入20mL乙腈稀释。在0℃下旋蒸浓缩，剩余残渣用石油醚/乙酸乙酯(30mL)洗涤即可得到化合物14的粗产品。随后，将化合物14溶于1.8mL磷酸盐的缓冲溶液(pH＝6.4)，接着加入碳酸氢钠(30mg,0.27mmol)和硫代苯甲酸(19mg,0.14mmol)，该反应混合物在60℃搅拌12h。经HPLC监测反应完全后，反应液冷却至室温，用1N HCl调节pH大约在2左右。水相接着用乙酸乙酯(10mL×3)萃取三次，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤，旋蒸浓缩，所得残渣用反向C18制备柱纯化得到1x(20.33mg,三步产率31％)。
化合物1x的结构表征：1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ9.22(d,J＝8.0Hz,1H),7.92(d,J＝7.3Hz,2H),7.70(t,J＝7.4Hz,1H),7.56(t,J＝7.8Hz,2H),7.33–7.21(m,5H),4.78-4.76(m,2H),4.27(d,J＝13.4Hz,1H),3.91(d,J＝13.4Hz,1H),3.74(d,J＝17.9Hz,1H),3.50(s,2H),3.32(d,J＝17.9Hz,1H).13C NMR(150MHz,d6-DMSO)δ191.22,171.19,163.48,161.86,136.42,135.97,134.62,129.64,129.55,128.77,127.45,127.05,63.67,56.99,42.25,30.97,28.48.HRMS(ESI)m/z C23H20N2NaO5S2(M+Na)+计算值：491.0711,实测值：491.0719活性测试例
将本发明中所述的基于头孢菌素母核的衍生物(1a-1x)应运于抑制金属β-内酰胺酶的活性中，以下提供测试例对此应用进行介绍。
除特别说明外，测试实验中检测底物的荧光强度变化均通过SpectraMax i3酶标仪检测，激发波长的狭缝宽度默认为9nm，发射波长的狭缝宽度默认为15nm。缓冲溶液的pH调配通过电子pH计(FiveEasy Plus)完成。本发明中所涉及到的β-内酰胺酶(NDM-1、NDM-3、NDM-4、NDM-12、NDM-13、VIM-27、IMP-1)均采用常规方法构建，例如表达NDM-1模型菌的构建方法具体如下：
实验原料：PMSF、Lysozyme、Rnase A、SDS-PAGE试剂盒；50×TAE；1kb的DNAmarker；考马斯亮蓝；卡那霉素；氨苄西林；琼脂粉；诱导剂IPTG；磷酸二氢钠；磷酸氢二钠；酵母提取物；胰蛋白胨；PCR酶；DNA纯化回收试剂盒；高纯度质粒小提试剂盒；限制性内切酶；咪唑；Ni-NTA beads；ULP1酶等。
(1)重组质粒的构建：用含有NDM-1基因的ATCC-BAA-2146临床菌当做模板，对NDM-1基因片段进行聚合酶链式反应(PCR)进行扩增，与此同时对pBAD、pET-28b、pET-28b-sumo载体质进行双酶切，以此获得线性载体。将扩增获得的NDM-1目的基因和线性载体纯化后进行同源重组，并对重组后的质粒进行鉴定。
(2)β-内酰胺酶的表达和纯化：首先制备LMG194和BL21 E.coli的感受态，然后将重组的质粒转化到感受态中并对β-内酰胺酶进行小量试表达。确认无误后在pBAD、pET-28b、pET-28b-sumo体系中进行大量表达。最后对得到的酶进行活性检测。
选择以去除氨苄基因的pBAD/myc-HisA质粒作为blaNDM-1模型菌表达β-内酰胺酶NDM-1的体系。再次以PCR扩增NDM-1和pBAD/myc-HisA的基因序列，接着通过两者的琼脂糖凝胶将产物纯化回收。将回收的产物进行同源重组，重组质粒转化至DH5α感受态中，接着再将感受态细菌转移至含有氨苄西林的固体培养基中37℃培养过夜。挑选单克隆细菌进行基因测序验证质粒构建成功。
测试例1：金属β-内酰胺酶的抑制活性
本发明所述的基于头孢菌素母核的衍生物(1a～1x)对金属β-内酰胺酶的抑制活性实验。
(1)实验材料和方法
本发明化合物对金属β-内酰胺酶的抑制活性试验的具体实施方法，以化合物1b抑制金属β-内酰胺酶NDM-1的半数抑制浓度(IC50)检测实验为例来说明。其它所涉及的化合物对金属β-内酰胺酶的IC50检测实验操作与化合物1b的实验操作保持一致。
本实验中所用的缓冲溶液是pH为7.2的HEPES缓冲液(50mM HEPES,100mM NaCl,0.01％Triton,1μg/mL BSA)。所用荧光测试底物为CDC-1，其终浓度为10μM,激发波长是365nm，发射波长是460nm。化合物1b冻干后的固体粉末配置成20mM的DMSO溶液于-80℃冰箱保存备用。NDM-1酶测试浓度的确定：将几组不同浓度的NDM-1分别和10μM的CDC-1震荡摇匀后在37℃下立即用酶标仪测试30分钟内各组荧光强度变化，最终选择荧光强度变化为线性且斜率在0.2-0.4时的NDM-1的浓度作为用于IC50检测实验的最佳浓度，根据实验结果我们最终确定NDM-1的浓度为100pM。
化合物1b的浓度梯度设置：首先用HEPES缓冲溶液配制几组浓度跨度较大的化合物1b，然后分别将它们与NDM-1(100pM)孵育10min，接着加入CDC-1检测不同浓度的化合物1b下各组的荧光强度变化并将实验数据转化为抑制率。最后以抑制率为50％附近对应的浓度为参考，在其左右设置12-15个浓度点。
接着，按以上浓度设置将稀释好的化合物1b分别加入到96孔黑板中，与此同时在每个孔中同样加入NDM-1(100pM)后混匀并孵育10min。接着加入CDC-1并立即用酶标仪检测每孔的荧光强度变化(激发波长365nm，发射波长460nm)，监测时间间隔1min，共测试30min，测试体系温度设为37℃，每组浓度设置三组平行对照。
(2)本发明所述化合物1b对金属β-内酰胺酶NDM-1的抑制活性实验结果化合物1b对金属β-内酰胺酶NDM-1的抑制效果见附图2。从附图2b可以看出在没有加入化合物1b的测试样品中，CDC-1(10μM)的荧光信号快速增强，表明NDM-1(100pM)能够有效水解荧光底物CDC-1。但是，在加入化合物1b(15μM)后，在同等条件下，荧光信号基本没有明显的增强，表明化合物1b能够有效抑制NDM-1的活性，显著减少其对荧光底物CDC-1的水解。进一步比较这两个条件下CDC-1的初始水解速率(V0)发现，1b对NDM-1酶的抑制率高达98％，显示出非常高的抑制效率。
化合物1b是在已报道化合物1a的结构基础上将头孢菌素母核C7位上R-构型的β-苯乙酰氨基变换为S-构型的甲氧基而来，其它结构两者则保持一致。如附图2c所示，通过测试化合物1b和1a抑制NDM-1的活性发现，1b抑制NDM-1的IC50仅为0.25±0.01μM，而1a抑制NDM-1的IC50为9.44±0.17μM，1b比1a的IC50值小38倍。由此可见，在头孢菌素母核C7位引入S-构型甲氧基意外地显著提升了头孢菌素化合物抑制NDM-1的活性。
由于碳青霉烯类化合物也具有C6位羟乙基侧链为S-构型的结构特点。如附图3b所示，通过分别测试等浓度的1b、头孢噻吩(CEF，结构如图3a所示)或者美罗培南(MEM，结构如图3a所示)对NDM-1(100pM)的抑制活性大小发现，2μM的1b对NDM-1的抑制能率高达87％，表现出了较强的抑制能力。然而在相同浓度及测试条件下，美罗培南和头孢噻吩几乎对NDM-1都没有抑制作用。
以上结果说明对头孢菌素母核C7位取代基团的结构修饰是获得金属β-内酰胺酶抑制剂的潜在途径。
(3)化合物1a～1x抑制金属β-内酰胺酶NDM-1的实验结果
实验方法如前所述，结果见表2。1x在结构上与1a高度相似，唯一的区别在于与7位取代顺式的1a不同，1x为反式取代。测试数据显示，1x抑制NDM-1的IC50大于50μM，这与1b抑制NDM-1的活性(IC50＝0.25±0.01μM)相差甚远，这也就是说明了1b抑制NDM-1的活性不仅取决于其反式构型，也与其取代基团的性质密切相关。
化合物1c融合了1a和1b在头孢菌素7位上的结构特点，同时具有顺式的的苯乙酰氨基和反式的甲氧基。但两者抑制NDM-1的IC50数据分别显示：1c(IC50＝9.6±0.7μM)和1a(IC50＝9.44±0.17μM)抑制NDM-1的能力基本保持一致，仅额外引入的反式甲氧基具有与1a相当的酶抑制活性。
其他化合物的活性如表2所示
表2基于头孢菌素母核的7位立体异构体化合物抑制金属β-内酰胺酶的活性总结
由表2的实验数据结果可以看出，当7位S构型取代基(R1)具有特定立体位阻、电性等性质基团(如为羟基、烷氧基、烷硫基等基团)时，化合物的抑制活性得到了明显的提升。此外，还可看出，当7位S构型取代基(R1)为例如甲氧基、乙氧基(1f，IC50＝0.46±0.01μM)、乙硫基(1i,IC50＝0.31±0.01μM))，具有显与1b相当的极低的IC50值。可见，相比现有化合物，本发明的化合物，尤其是7位S构型取代基为烷氧基或烷硫基(如低碳原子数的烷氧基和烷硫基)具有显著提升的抑制活性。硫原子一般有亚砜和砜两种氧化状态。在化合物1b的结构基础上将其5位硫原子氧化分别获得亚砜类化合物1d和砜类化合物1e。从两者抑制NDM-1的IC50结果显示，5位硫原子的氧化造成1d(IC50＝7.4±0.2μM)和1e(IC50＞50μM)抑制NDM-1活性能力的减弱甚至消失。由此结果得出，5位硫原子的氧化使它们并不适合充当β-内酰胺酶NDM-1的抑制剂。
此外，根据表2，可以看出3′位离去基团(R3)的存在对于对抑制NDM-1酶活性的能力是有利的，例如，在其他结构均接近的情况下，3′位不存在离去基团时(即化合物1w)基本无抑制NDM-1酶活性的能力(IC50＞50μM)。
(4)本发明化合物抑制金属β-内酰胺酶的广谱性化合物1u作为本发明中筛选获得的最优化合物。利用化合物1u对NDM的其它四种亚型(NDM-3，NDM-4，NDM-12，NDM-13)进行了抑制活性测试。测试结果如表3所示，化合物1u对另外四种NDM亚型同样表现出了较好的抑制活性，这说明化合物1u能较为广谱的抑制NDM型β-内酰胺酶的活性。
此外，除了测试这类化合物对NDM型金属酶的抑制活性外，还对它们抑制另外两种重要的金属β-内酰胺酶IMP-1和VIM-27的活性进行了研究。如表2所示，此类化合物中有些化合物对IMP-1，VIM-27也表现出较好的抑制能力。其中化合物1i对IMP-1的抑制能力最强，IC50为0.80±0.01μM。化合物1v抑制VIM-27的IC50也可低至1.0±0.1μM。这一结果说明基于头孢菌素母核所设计的7位立体异构体衍生物拥有比较广泛的抑制金属β-内酰胺酶活性的能力。
表3化合物1u抑制NDM亚型酶的活性总结
测试例2
将所述基于头孢菌素母核的7位立体异构体作为金属β-内酰胺酶抑制剂与临床中使用的抗生素联合用药，以此评价该类化合物作为金属β-内酰胺酶抑制剂的潜力。该实验的具体测试方法以最优化合物1u与美罗培南联用抑制模型大肠杆菌(pBAD/Myc-HisA-NDM-1-DH5α)的实验为例进行说明。其它化合物对所测试细菌的抑制实验操作和上述实验的操作流程保持一致。
首先，将甘油菌pBAD/Myc-HisA-NDM-1-DH5α稀释后涂在Mueller-Hinton(MH)固体培养基上在37℃下培养过夜，然后挑选单克隆细菌并接种至MH液体培养基上培养4小时后用酶标仪测试其600nm处的吸光度OD600为1.032。参照当大肠杆菌菌液吸光度OD600＝1时，其浓度相当于8×108CFU/mL。以此参数推算得到的菌液浓度为2.8×108CFU/mL，然后用MH液体培养基将菌液稀释至5×105CFU/mL备用。
参照美国CLSI标准，本发明采用微量稀释法来进行化合物1u和美罗培南对模型菌(pBAD/Myc-HisA-NDM-1-DH5α)的联合给药实验。将化合物储备液用MH液体培养基稀释成4倍倍比质量浓度(美罗培南的终质量浓度范围为：0～64μg/mL，化合物1u的终质量浓度范围为：0～16μg/mL)。实验按照以下具体操作进行展开：首先，按照从低浓度到高浓度的顺序将50μL倍比稀释的美罗培南加入到96孔板的第1～10列，然后按照由高浓度到低浓度的顺序，将50μL倍比稀释的化合物1u加入到96孔板的第A～G行。向所有孔中加100μL上述稀释好的菌液并混匀并测试此时的OD600值。以上实验共设置三个平行实验。最后，将接种好的96孔板移至37℃恒温箱进行培养。18h后以OD600值测定法来计算最终结果。
从附图4可知，当对pBAD/Myc-HisA-NDM-1-DH5α模型大肠杆菌进行单独用药时，美罗培南的最小抑菌浓度(MIC)是64μg/mL。而当加入化合物1u和美罗培南一起给药18h后，美罗培南的最小抑制浓度降低到16μg/mL。这一结果说明化合物1u的加入，降低了美罗培南的用量，使得美罗培南对表达NDM-1的模型菌(pBAD/Myc-HisA-NDM-1-DH5α)的生长抑制效果提高了4倍。
综上所述，以头孢菌素为母核结构的小分子化合物1u在和β-内酰胺类抗生素美罗培南进行联合用药时，能够有效地提高美罗培南对表达NDM-1模型大肠杆菌(pBAD/Myc-HisA-NDM-1-DH5α)的药效。因此，在作为金属β-内酰胺酶抑制剂方面具有很大潜力。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。