用抗体修饰的自组装蛋白质纳米笼(sapna)及其部分

文档序号：395044 发布日期：2021-12-14 浏览：22次 >En<

阅读说明：本技术 用抗体修饰的自组装蛋白质纳米笼(sapna)及其部分 (Self-assembled protein nanocages (SAPNA) and portions thereof modified with antibodies ) 是由柯蒂斯·D·霍奇格雷戈里·L·胡拉托德·O·耶茨于 2020-04-27 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种可用于或能够形成中空四面体金字塔结构的蛋白质笼多肽(或支架蛋白),以及“用抗体修饰的自组装蛋白纳米颗粒”(SAPNA),其为嵌合蛋白组装体,包含：(a)一种或多种抗体和(b)提供在其上排列抗体的支架的蛋白质笼多肽。在一些实施例中,所述抗体能够与致病生物剂或其部分特异性地结合。(The present invention provides a protein cage polypeptide (or scaffold protein) useful for or capable of forming hollow tetrahedral pyramid structures, and a "self-assembled protein nanoparticle modified with antibody" (SAPNA), which is a chimeric protein assembly comprising: (a) one or more antibodies and (b) a protein cage polypeptide providing a scaffold on which the antibodies are arranged. In some embodiments, the antibody is capable of specifically binding to a pathogenic agent or portion thereof.)

用抗体修饰的自组装蛋白质纳米笼(SAPNA)及其部分

相关专利申请

本申请要求2019年4月25日提交的美国临时专利申请序列号62/838,826的优先权，其通过引用整体并入本文。

政府支持的声明

本发明是在美国能源部授予的合同编号DE-AC02-05CH11231的政府支持下完成的。政府对本发明具有一定的权利。

技术领域

本发明属于基于蛋白质的抗体支架的生产领域。

背景技术

治疗性单克隆抗体是生物制药行业的巨大力量，而癌症免疫疗法是蓬勃发展的密集研究领域。根据Ecker等人(5)，在2013年，单克隆抗体产品价值近750亿美元，约占所有生物制药产品总销售额的一半。从这个角度开看，截至2014年底，只有47种单克隆抗体产品被批准在美国或欧洲使用。因此，存在巨大的增长空间，很可能大多数大型制药公司都具有抗体开发计划。事实上，据预测，到2020年大约70种新的单克隆抗体产品将上市，全球销售额将接近1250亿美元(5)。

美国专利第6,756,039号(Yeates，Padilla和Colovos)公开了能够自组装成规则结构的融合蛋白，其中融合蛋白包含至少两个通过例如α螺旋连接基团刚性连接在一起的寡聚化结构域。

美国专利第7,608,681号(Dennis，Lowman和DeLano)公开了对IgG或血清白蛋白具有亲和力的肽配体。

美国专利第8,969,521号(Baker，King，Sheffler和Yeates)公开了用于设计自组装蛋白质纳米材料的一般方法，以及能够形成多聚体组装体的分离的多肽，其包含特定的184个氨基酸序列。

美国专利申请公开号20070218547(Yeates，Padilla，Yoshida和Colovos)公开了用于产生延伸材料的自组装蛋白，包括融合蛋白，该融合蛋白包含天然结合成同二聚体结构的第一寡聚化结构域和天然结合成同四聚体结构的第二寡聚化结构域，其中所述第一寡聚化结构域和第二寡聚化结构域彼此刚性地连接。

发明内容

本发明提供了可用于或能够形成中空四面体金字塔结构的蛋白质笼多肽(或支架蛋白)，其中所述蛋白质笼多肽或支架蛋白能够与抗体或其部分，或包含所述抗体或其部分的任何嵌合蛋白、分子或化合物特异性地结合。

在一些实施例中，抗体是IgG抗体。在一些实施例中，抗体的部分是抗体的Fc区，例如IgG、IgA、IgD、IgE或IgM抗体。在一些实施例中，抗体是人、鸡、小鼠、兔、绵羊或山羊抗体。在一些实施例中，抗体是人源化抗体。在一些实施例中，IgG抗体是人IgG抗体。在一些实施例中，抗体是包含抗体或其部分的嵌合蛋白、分子或化合物的一部分。在一些实施例中，嵌合蛋白或其他分子或化合物包含抗体的Fc区。在一些实施例中，抗体或其部分与嵌合蛋白、分子或化合物共价结合。在一些实施例中，蛋白质笼多肽或支架蛋白对抗体或其部分的结合亲和力K_a等于或大于10⁷M^-1、10⁸M^-1或10⁹M^-1。

在一些实施例中，蛋白质笼多肽包含约400至约700个氨基酸残基的多肽。在一些实施例中，蛋白质笼多肽包含约450至约650个氨基酸残基的多肽。

在一些实施例中，蛋白质笼多肽包含具有以下结构的氨基酸序列：

多肽1—AHL—多肽2—插入物A—多肽3—插入物B—多肽4(化学结构I)；

其中AHL是“α螺旋接头”，并且插入物A和/或插入物B各自独立地能够与抗体或其部分特异性地结合。

在一些实施例中，插入物A具有约17至约25个氨基酸的长度。在一些实施例中，插入物B具有约28至约85个氨基酸的长度。在一些实施例中，插入物A和/或插入物B对抗体或其部分的结合亲和力K_a各自独立地等于或大于10⁷M^-1、10⁸M^-1或10⁹M^-1。在一些实施例中，插入物A和/或插入物B各自独立地包含氨基酸序列DCAWHLGELVWCT(SEQ ID NO:41)或GCDCAWHLGELVWCTCG(SEQ ID NO:42)。

在一些实施例中，蛋白质笼多肽包含具有以下结构的氨基酸序列：

多肽1—AHL—多肽2—插入物A—多肽3—插入物B—多肽4

(化学结构I)；

其中AHL是“α螺旋接头”，插入物A具有约17至约25个氨基酸的长度并包含氨基酸序列DCAWHLGELVWCT(SEQ ID NO:41)或GCDCAWHLGELVWCTCG(SEQ ID NO:42)，并且插入物B具有约28至约85个氨基酸的长度并包含氨基酸序列DCAWHLGELVWCT(SEQ ID NO:41)或GCDCAWHLGELVWCTCG(SEQ ID NO:42)。SEQ ID NOs:41和42能够结合至IgG的Fc区。

在一些实施例中，多肽1包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1-40中任一个的从N-末端直至AQEAQKQK序列的氨基酸序列包含至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的氨基酸同一性。在一些实施例中，多肽1包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含以下：YGTAR、TDD、LXENLGTR、IDV、TGXRT和/或SA；其中X是任何带电荷的氨基酸残基。在一些实施例中，多肽1包含约278至约303个氨基酸残基。

在一些实施例中，AHL包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含：AQEAQKQK。在一些实施例中，AHL包含约5、6、7、8、9、10或11个氨基酸残基。

在一些实施例中，多肽2包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1-40中任一个的从AQEAQKQK序列的C-末端到插入物A的N-末端的氨基酸序列包含至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的氨基酸同一性。在一些实施例中，多肽2包括包含以下的氨基酸序列：LTEVETYVLS(SEQ ID NO:43)。在一些实施例中，多肽2包含约30至约36个氨基酸残基。在一些实施例中，多肽2包含约33个氨基酸残基。

在一些实施例中，多肽3包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1-40中任一个的从插入物A的C-末端至插入物B的N-末端的氨基酸序列包含至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的氨基酸同一性。在一些实施例中，多肽3包括包含以下的氨基酸序列：FTLTVPSERGLQR(SEQ ID NO:44)和/或CATCEQIAD(SEQ ID NO:45)。在一些实施例中，多肽3包含约110至约130个氨基酸残基。在一些实施例中，多肽3包含约121个氨基酸残基。

在一些实施例中，多肽4包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与来自SEQ ID NO:1-40中任一个的插入物B的C-末端的氨基酸序列包含至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的氨基酸同一性。在一些实施例中，多肽4包括包含以下的氨基酸序列：EHHHHHH。在一些实施例中，多肽4包含约5至约13个氨基酸残基。在一些实施例中，多肽4包含约8个氨基酸残基。

在一些实施例中，所述蛋白质笼多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NOs:1-40中任一个包含至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的氨基酸同一性。在一些实施例中，蛋白质笼多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含由图6中的星号指示的任意一个或多个、或所有的氨基酸残基的区段或单个氨基酸残基。在一些实施例中，蛋白质笼多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在图6中由“#”指示的相应位置中的任何一个或多个或所有带电荷的氨基酸区段。

本发明提供了一种中空四面体金字塔结构，其包含组装为中空四面体金字塔结构的十二种本发明的蛋白质笼多肽，其中所述蛋白质笼多肽能够与抗体或其部分结合。在一些实施例中，中空四面体金字塔结构封装了一个或多个较小的目的分子。在一些实施例中，较小的目的分子是治疗性的或可检测的。

本发明提供了一种“用抗体修饰的自组装蛋白质纳米颗粒”(SAPNA)，它是一种嵌合蛋白组装体，包括：(a)一种或多种抗体和(b)蛋白质笼多肽，该蛋白质笼多肽提供了在其上排列抗体的支架，其中一种或多种抗体与蛋白质笼多肽的插入物A和/或插入物B结合。

本发明提供了一种SAPNA，它是一种嵌合蛋白组装体，包含：(a)一种或多种抗体和(b)工程改造的蛋白，该工程改造的蛋白提供了在其上排列抗体的支架。支架蛋白形成中空四面体金字塔，其可以根据缓冲条件进行组装或拆卸。由于支架是中空的，一旦抗体将SAPNA定位于靶，系统就可以封装较小的目的分子以供释放。这些颗粒被工程改造，以通过与抗体Fc CH2/CH3结构域的高亲和力相互作用，可调节地结合和展示任何IgG抗体(或仅Fc区)，诸如人或兔IgG抗体(或仅Fc区)或其片段。每个纳米颗粒的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个抗体或Fc结构域的物理约束定位允许激活抗体对于其可用的任何寡聚化依赖性受体介导的途径。在一些实施例中，通过单独加载和混合，识别不同表位的抗体可以加载到相同的纳米颗粒上，从而赋予多功能性。在一些实施例中，纳米颗粒可以用于刺激先天或适应性免疫细胞，因为Fc受体寡聚化是激活的必要组分。

本发明提供了一种SAPNA结构，其包含：(1)一种蛋白质笼多肽或支架蛋白(或工程改造的蛋白质笼蛋白(PC))，或组装成三维组装体(诸如四面体金字塔)的多种蛋白质笼多肽或支架蛋白(或工程改造的蛋白质笼蛋白(PC))，和(2)任选一种或多种人或兔IgG抗体，(3)任选IgG结合环，和(4)任选地，当所述多种多肽或支架蛋白(或工程改造的蛋白质笼蛋白(PC))与抗体被组装成三维组装体时，目的货物(例如化合物或分子，例如大分子)被所述三维组装体限制或包围。在图1A中示出了本发明的一个实施例。

人IgG抗体识别并紧密地结合至多种靶。在一些实施例中，靶是病原体的部分。在一些实施例中，靶是天然细胞组分。在一些实施例中，IgG结合环是整合到PC中并充当抗体与PC之间的连接的蛋白质的序列。PC已经有几篇专门针对它的出版物(1-3)，但从未有任何与抗体相关的上下文。在大多数生理条件下，PC组分可以从其自身的12个拷贝自组装成中空的四面体金字塔。在一些实施例中，SAPNA结构能够将货物递送或携带至SAPNA被抗体定位的任何地方。在一些实施例中，货物大小在约150kDa与约20kDa之间。许多有用的大分子符合这一范围。

SAPNA结构可以组装和拆卸。这一功能可以用于初始捕获货物或释放货物。此外，由于存在许多种类的抗体。可以将具有多种抗体的PC混合，以创建在其表面上具有多种抗体的SAPNA。互换抗体的能力提供了额外的功能。

在一些实施例中，除了携带和定位货物的能力之外，SAPNA还可以在没有货物的情况下改变细胞行为。影响细胞的外部刺激通常从配体结合开始，以使跨膜受体紧密接触(寡聚化)(4)。这是通过两种或更多种受体与配体(诸如细胞因子)的结合实现的，然而用于许多受体的配体是未知的，或者可能局限于另一种细胞的细胞表面。在一些实施例中，通过在PC上显示(图1A，B；图7)，针对任何单一受体开发的任何IgG抗体的功能能力将被显著增强。抗体可以激活细胞内信号传导通路，从而导致更好地控制细胞活性，而不是在很大程度上局限于阻断受体。在一些实施例中，PC上显示不同种类的抗体，并且蛋白可以影响通过多链免疫识别受体(MIRR)操作的信号。许多免疫细胞依赖于MIRR来控制细胞内信号传导(4)。MIRR通常需要通过细胞外配体的多链参与来进行寡聚化和随后的激活。在一些实施例中，SAPNA将模块化地赋予IgG抗体激活/信号传导能力，这些能力目前限于阻断机制。这可能为针对任何需要调节细胞信号传导的疾病的现有以及新开发的人IgG抗体打开全新的治疗途径。

SAPNA具有巨大的潜力，因为它们的用途将不限于单一或少数疾病。它们的潜力也不是固定的，随着所开发的单克隆抗体产品数量的增加，SAPNA的潜在用途也在增加。在一些实施例中，SAPNA结构用于在免疫疗法中靶向癌症，因为存在可以调节的明确定义的配体-受体相互作用，以及几种可用的治疗性IgG抗体(例如，抗PD-1/PD-L1，抗CTLA4)。对于治疗性抗体、其来源和同种型、作用方法和许可的适应症，参见参考文献(6)。此外，癌症免疫学是一个主要基于使用基于抗体染色的流式细胞术的研究领域，这将允许广泛的临床前候选人进行测试。本发明提供了一种编码本发明的蛋白质笼多肽的核酸。在一些实施例中，核酸是多核苷酸。在一些实施例中，核酸是载体，例如表达载体。在一些实施例中，编码蛋白质笼多肽的核酸与能够在宿主细胞中表达蛋白质笼多肽的启动子可操作地连接。在一些实施例中，核酸是能够稳定引入到宿主细胞中和/或维持在宿主细胞中的载体。

本发明提供了一种包含编码本发明的蛋白质笼多肽的核酸的宿主细胞。在一些实施例中，核酸是能够稳定引入到宿主细胞中和/或维持在宿主细胞中的载体。

本发明提供了一种包含本发明的蛋白质笼多肽(或支架蛋白)或中空四面体金字塔结构的组合物，其中所述蛋白质笼多肽(或支架蛋白)或中空四面体金字塔结构与抗体或其部分，或包含所述抗体或其部分的任何嵌合蛋白、分子或化合物特异性地结合。

本发明提供了一种用于生产蛋白质笼多肽的方法，包含：(a)提供本发明的宿主细胞，(b)在表达蛋白质笼多肽的合适条件下培养宿主细胞，以及(c)任选地回收蛋白质笼多肽。

本发明提供了一种用于检测或分离致病生物剂或其部分的方法，所述方法包括：(a)提供“用抗体修饰的自组装蛋白质纳米颗粒”(SAPNA)，其中所述抗体能够与致病生物剂或其部分特异性地结合；(b)使所述SAPNA与包含所述致病生物剂或其部分的样品接触，使得所述SAPNA与所述致病生物剂或其部分结合；(c)通过检测来检测所述SAPNA致病性生物制剂或其部分，和/或从所述样品的其余部分分离所述SAPNA结合的致病生物剂或其部分；和(d)确定致病生物剂或其部分的丰度。

在一些实施例中，所述方法进一步包括：从患有、诊断患有或怀疑患有由致病生物剂引起的疾病的受试者获得样本。在一些实施例中，受试者是人。在一些实施例中，受试者是哺乳动物或鸟类。在一些实施例中，受试者是普通的宠物或家畜。在一些实施例中，方法进一步包括：治疗受试者的疾病，例如向受试者施用治疗有效剂量的已知或能够治愈或减轻疾病的影响的药物。

本发明提供了一种SAPNA，所述SAPNA与一种或多种化合物诸如一种或多种药物化学缀合，然后以类似于抗体-药物缀合物(ADC)的方式靶向生物/细胞位点以用于药物沉积。

附图说明

当结合附图阅读时，本领域技术人员从以下对说明性实施例的描述中将容易地理解上述方面和其他方面。

图1A.：一种SAPNA模型及其部分。

图1B.：各种支架状态的预测结构的模型。

图2A：具有PerCP标记的人IgG1 Fc结构域的支架的SEC峰移结合测定。在280nm处的吸光度。

图2B：具有PerCP标记的人IgG1 Fc结构域的支架的SEC峰移结合测定。在482nm处的吸光度。

图3A：使用Alexa-488-标记的人IgG1同种型抗体的支架的SEC峰移结合测定。在280nm处的吸光度。Alexa是Thermo Fisher Scientific(Waltham,MA)拥有的注册商标。

图3B：使用Alexa-488-标记的人IgG1同种型抗体的支架的SEC峰移结合测定。在488nm处的吸光度。

图4A：具有人IgG1 Fc结构域的支架的SEC SAXS。来自SEC-SAXS-MALS的样品跟踪。

图4B：具有人IgG1 Fc结构域的支架的SEC SAXS。P(r)函数直方图。

图5A：具有兔抗GFP抗体的支架的SEC SAXS。来自SEC-SAXS-MALS的样品跟踪。

图5B：具有兔抗GFP抗体的支架的SEC SAXS。P(r)函数直方图。

图6：SAPNA保守序列。图例：284个保守/保留的残基(284/456＝62％)；“*”＝基于进化的保守寡聚化界面残基和高度保守残基(多序列比对)；还包括被确定不耐受插入/缺失的残基。这包括尝试插入两侧的残基(粗体*)；“$”＝在这些残基之间允许和耐受的插入；“^”＝允许不同长度的替换插入的缺失(第一位点：长度为17至25个残基并且必须包括DCAWHLGELVWCT(SEQ ID NO:41)或GCDCAWHLGELVWCTCG(SEQ ID NO:42)，而第二位点：长度为28至85个残基并且必须包括DCAWHLGELVWCT(SEQ ID NO:41)或GCDCAWHLGELVWCTCG(SEQID NO:42))；“#”＝点突变，例如允许从负到正的单电荷交换突变；“@”＝连接两个可以耐受长度调节的结构域的α-螺旋；“”＝残基上方的空格表示非保守的，可以是任何氨基酸。

图7：SAPNA可以装载多达12种抗体。

图8：动态光散射显示加载有兔抗ROBO1抗体的SAPNA。

图9：SAPNA在T细胞免疫突触处强制受体聚集的示意图。

图10：加载有抗CD3/抗CD28抗体的SAPNA，其用于在刺激和扩增献血者来源的T细胞超过14天，其中以流式细胞术作为读数。这些数据表明，相对于两种市场上的技术ThermoFisher的Dynabeads CD3/CD28和StemCell的ImmunoCult CD3/CD28，原代T细胞的扩增能力更出色。

图11：与珠结合的SAPNA可以分离(阴性选择)T细胞群。

图12：SAPNA在与Alexa-488化学缀合后保持其结构。

图13：Alexa-488标记的SAPNA与兔抗ROBO1抗体结合，靶向HeLa宫颈癌细胞的表面。

具体实施方式

在详细地描述本发明之前，应当理解，除非另有说明，否则本发明不限于特定的序列、表达载体、酶、宿主微生物或过程，因为这些可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅为了描述特定实施例，而非旨在进行限制。

在本说明书中和在所附的权利要求中，将参考许多术语，这些术语应被定义为具有以下含义：

如本文使用的术语“任选的”或“任选地”表示随后描述的特征或结构可以存在或可以不存在，或者随后描述的事件或情况可以发生或可以不发生，并且该描述包括特定特征或结构存在的情况和特征或结构不存在的情况，或者事件或情况发生的情况和事件或情况不发生的情况。

如在说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包含复数指代物，除非上下文另有明确指示。因此，例如，提及“多肽”包括一个多肽分子以及多个特异性氨基酸序列的多肽。

在提供数值范围的情况下，应理解的是，除非上下文清楚地另外指出，否则也具体公开在该范围的上限与下限之间的每个中间值，至下限单位的十分之一。在规定范围内的任何规定值或中间值与该规定范围内的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围都包含在本发明中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或排除在外，并且其中任一个，没有一个或两个限值包括在较小范围内的每个范围也涵盖在本发明内，受限于所述范围中任何明确排除的限值。在规定范围包括所述界限中的一者或两者的情况下，排除那些被包括界限中的任一者或两者的范围也被包括在本发明中。

术语“约”指包括比规定值大10％和比规定值小10％的值。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试，但现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物都通过引用并入本文，以结合引用的出版物公开和描述方法和/或材料。

术语“宿主细胞”在本文中用于指可以通过插入表达载体而转化的活生物细胞。

术语“表达载体”或“载体”是指化合物和/或组合物，其转导、转化或感染宿主细胞，从而使细胞表达不同于细胞天然的核酸和/或蛋白质，或者以非细胞天然的方式表达。“表达载体”包含有待由宿主细胞表达的核酸序列(通常是RNA或DNA)。任选地，表达载体还包含有助于实现核酸进入宿主细胞中的材料，诸如病毒、脂质体、蛋白质包被等。预期用于本发明的表达载体包括其中可以插入核酸序列的表达载体，以及任何优选的或必需的操作元素。此外，表达载体必须是可以被转移到宿主细胞中并在其中复制的载体。特定的表达载体是质粒，特别是那些具有限制位点的质粒，这些质粒已被很好地记载并且含有对于核酸序列的转录优选的或所需的操作元素。此类质粒以及其他表达载体为本领域普通技术人员所熟知。

术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用，并且是指从5’端至3’端阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。本发明的核酸通常含有磷酸二酯键，尽管在一些情况下，可以使用可以具有替代主链的核酸类似物，包括例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或O-甲基亚磷酰胺键(参见Eckstein，《寡核苷酸和类似物:实用方法(Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach)》，牛津大学出版社(OxfordUniversity Press))；正主链；非离子主链和非核糖主链。因此，核酸或多核苷酸也可以包括允许聚合酶正确通读的修饰的核苷酸。“多核苷酸序列”或“核酸序列”包括作为单个单链或双链形式的核酸的有义链和反义链。如本领域技术人员将理解的，单链的描述也定义了互补链的序列；因此，本文所述的序列也提供了该序列的互补序列。除非另有说明，否则特定核酸序列还隐含地包括其变体(例如简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。核酸可以是DNA、基因组和cDNA、RNA或杂交体，其中核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及碱基的组合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤等。

如本文所使用的术语“启动子”是指能够驱动细胞中DNA序列的转录的多核苷酸序列。因此，本发明的多核苷酸构建体中使用的启动子包括顺式和反式作用的转录控制元件和调控序列，其参与调控或调节基因转录的时间和/或速率。例如，启动子可以是顺式作用的转录控制元件，包括增强子、启动子、转录终止子、复制起点、染色体整合序列、5’和3’非翻译区或内含子序列，它们参与转录调节。这些顺式作用序列通常与蛋白质或其他生物分子相互作用以进行(开启/关闭、调节、调控等)基因转录。启动子位于转录基因的5’上，并且如本文中所使用的，包括距翻译起始密码子5’的序列(即包括mRNA的5’非翻译区，通常包含100-200bp)。最常见的是，核心启动子序列位于翻译起始位点的1-2kb内，更常见的是位于翻译起始位点的1kbp内并且经常位于500bp内。按照惯例，启动子序列通常作为它所控制的基因的编码链上的序列提供。在本申请的上下文中，启动子通常是指其天然地调节表达的基因的名称。在本发明的表达构建体中使用的启动子通过基因的名称提及。通过名称提及启动子包括野生型、天然启动子以及保持诱导表达的能力的启动子的变体。通过名称提及启动子并不局限于特定物种，还包括来自其他物种中的相应基因的启动子。

术语“可操作地连接”是指两个或更多个多核苷酸(例如DNA)区段之间的功能关系。通常，它指转录调节序列与转录的序列的功能关系。例如，如果启动子或增强子序列在合适的宿主细胞或其他表达系统中刺激或调节DNA或RNA序列的转录，则该启动子或增强子序列与DNA或RNA序列可操作地连接。通常，与转录的序列可操作地连接的启动子转录调节序列在物理上与转录的序列邻接，即它们是顺式作用的。然而，一些转录调节序列(例如增强子)不需要物理上邻接或位于它们增强其转录的编码序列附近。

术语“细胞(cell)”或“细胞(cells)”是指任何生物体的任何细胞，其范围从单细胞生物体到哺乳动物细胞，在体外或体内。

根据本发明的方法，可以通过多种方法来修饰编码本文教导的任何蛋白质笼多肽的核酸的表达。本领域技术人员将认识到，增加基因拷贝数、核糖体结合位点强度、启动子强度和各种转录调节因子可以用于改变蛋白质表达水平。

本发明可以用于多种目的(如所描述的，其可以在研究环境中用作工具，或在临床环境中用作治疗剂)：在一些实施例中，SAPNA结构是能够通过结合/阻断人或研究模型中的细胞表面和可溶性受体/配体来调节免疫系统的治疗或研究工具。在一些实施例中，SAPNA结构能够通过增强外部细胞表面受体/配体寡聚化来激活一种或多种内部细胞途径。在一些实施例中，SAPNA结构例如用荧光染料或标记物来标记，并且可以用于使细胞表面靶向抗体可视化，例如在免疫荧光或流式细胞术中。在一些实施例中，荧光染料是Alexa荧光染料。在一些实施例中，SAPNA结构是测试/筛选使用人/兔IgG抗体的任何组合来影响活生物体中的细胞变化或生理反应的可行性的工具。在一些实施例中，SAPNA结构可用于在体内循环和侵入颗粒的调理。在一些实施例中，SAPNA结构能够靶向和操纵水性或半水性环境中的病毒/病毒颗粒。在一些实施例中，SAPNA结构能够包封货物，随后靶向细胞表面。在一些实施例中，SAPNA结构能够在有或没有货物的情况下(内吞作用的启动和调节)通过内吞作用进入内部细胞环境。在一些实施例中，SAPNA结构是疫苗或疫苗佐剂。在一些实施例中，SAPNA结构是体外免疫细胞活化工具。在一些实施例中，SAPNA结构是可生物降解的美容产品，其通过在相同的支架上展示抗荧光抗体和抗角蛋白抗体而将荧光蛋白与毛发和皮肤中的角蛋白结合。在一些实施例中，负载有抗体的SAPNA分子可以从细胞的混合池中阳性地或阴性地选择细胞群。

不存在本发明的临床等同物。存在另一个研究工程铁蛋白的小组(7)，然而，由于铁蛋白分子的间距，抗体占据的可预测性会低得多，因此通过抗体展示进行免疫调节的纳米笼较差。由于我们正在工程改造的SAPNA纳米笼中更大的孔，因此它可能是小分子的更好载体。这一小组似乎也更专注于使用铁蛋白质笼将货物递送到细胞中(8，9)。两种不同但相互竞争类型的技术是具有工程改造的Fc区的抗体和双特异性抗体。

许多抗体未通过临床试验(10)，这导致了对增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的研究。然而，这些努力主要旨在通过Fc突变增强Fc-γ受体与抗体Fc区的结合。SAPNA纳米笼将优于这些方法，因为ADCC需要通过Fc结合进行Fc-γ受体聚集，而SAPNA将实际执行这一点。此外，SAPNA可以利用这些努力，并且实际上被装载有突变的Fc，以进一步增强治疗效果。

双特异性/多特异性抗体(11-15)(其基本上是包含两个或更多个不同抗原识别区的抗体)以多种方式连接(14，15)。虽然双特异性/多特异性抗体具有巨大潜力，但与SAPNA相比，每种抗体都必须单独设计、测试和优化，SAPNA将是模块化的并且可用于几乎任何市售的IgG抗体。SAPNA所具有的主要优势是，其他非抗体分子可以与抗体同时展示。预先配制不同抗体的混合物并且随后添加未装载的SAPNA笼，允许将数种(约2-12)不同抗体装载到同一纳米笼中。于是，这可以充当大的多特异性纳米颗粒，这相对于目前的多特异性抗体是很大的优势。SAPNA的模块化性质和多功能性是下一代生物治疗学中非常期望的特征。

在一些实施例中，蛋白质笼多肽(或支架蛋白)特异性地结合至抗体或其部分，或包含抗体或其部分的任何嵌合蛋白、分子或化合物；其中所述抗体或其部分与致病生物剂或其部分特异性地结合。

在一些实施例中，四面体金字塔结构特异性地结合至抗体或其部分，或包含抗体或其部分的任何嵌合蛋白、分子或化合物；其中所述抗体或其部分与致病生物剂或其部分特异性地结合。

在一些实施例中，通过用一种或多种针对抗原蛋白的抗体或特定于那些药剂的其他表面分子加载SAPNA分子，SAPNA分子可以用作致病生物剂的多价检测平台，所述致病生物剂包括但不限于病毒、细菌和与任何人/哺乳动物疾病(例如朊病毒和其他淀粉样蛋白)有关的错误折叠的蛋白。检测应用扩展到病原体的分离和丰度(即感染严重程度)的测定。如前所述，出于分析的目的，可以用分子(诸如用于检测的荧光团)共价地标记SAPNA分子，而可以使用多价His标签(最多12个拷贝)来操作和分离各种抗原结合部分。除了人之外，待分析的病原体还扩展到那些影响动物(例如，普通宠物、家畜等)的病原体，这些病原体关系到人类的健康和福利。在一些实施例中，普通宠物是狗、猫、兔、豚鼠、仓鼠、小鼠等。在一些实施例中，家畜是哺乳动物(例如牛、马、猪、绵羊或山羊)，或鸟类(例如鸡、鸭或鹅)。

病毒和细菌的表面被蛋白质或其他分子包被或修饰，这些蛋白质或其他分子是它们的生物学功能所必需的，包括宿主细胞附着和宿主进入，以及在恶劣条件下的存活。由于它们对繁殖的重要性，此类分子或这些分子的部分对于给定的病毒或细菌的物种或菌株倾向于是保守的。因此，此类分子可以作为稳健的用于鉴定的靶。此外，此类分子对不同的病毒和细菌是特异性的和独特的，因此适合于诊断应用中的特定身份分配。通过抗体结合至特定病毒和细菌的表面分子(或有时结合至由其裂解产生的分子)来识别特定病毒和细菌的能力已被理解并广泛地应用于实践中。在一些实施例中，由于SAPNA显示赋予结合的特异性识别谱的所选抗体的多价和模块化能力，以及它们支持用于分离和报告物读出(例如通过荧光)的化学特征，SAPNA分子提供了用于鉴定和分离病毒和细菌的独特和有利的特征。

本发明的不同实施例可以在SAPNA分子上呈递多于一种不同类型的抗体。例如，SAPNA分子可以同时呈递针对一种类型的病毒或细菌的不同菌株或亚型的特异性抗体。这将提供对群体中具有已知变体或亚型的病毒的简便且有效的鉴定。流感病毒是广为人知的例子。这将消除对设计用于检测病毒的变体菌株的不同试剂的需要。此外，多于一种类型的抗体的呈递可以在区分表达部分重叠的表面抗原组的病原体(例如，不同细菌)方面提供有价值的优势。作为一个示例，如果细菌A表达表面蛋白X和Y，并且细菌B表达蛋白Y和Z，并且细菌C表达蛋白X和Z，那么呈递针对蛋白Y和Z的抗原的SAPNA分子将通过亲合力效应优先地鉴定细菌B。当然，优先检测表面抗原的组合的其他情况将是可能的，这对于细菌和病毒都是如此。

本发明的不同实施例可以具有不同数量的在SAPNA分子上呈递的单一类型抗体，其通过添加相对于SAPNA核心的不同化学计量量的抗体实现。因为分子结合中的多价性程度被理解为强烈地影响结合亲合力，所以定制在SAPNA分子上呈递的抗体数量的能力可以赋予对最终结合亲和力(即可调节性)的有价值的控制。这种控制在为预期靶分子的阳性结合创建具有最期望的检测窗口的试剂方面提供了价值，同时仍对可能在不同程度上与预期检测靶相似的非同源分子给出阴性结合读数。对于以前用于细菌靶鉴定的单价或低价试剂，亲和力相对于靶特异性的窄范围是共同的挑战。

本发明的不同实施例将对不同的病毒、细菌和淀粉样蛋白标记物蛋白是特异性的。可能的靶列表是广泛的，随着新病原体的发现而不断增加，并且只需要已知或可以为感兴趣的标记物蛋白建立特异性抗体(这种能力在今天的工业中常规地得到证明)。在医疗紧迫性的病毒中，各种冠状病毒(包括SARS-CoV、SARS-CoV-2和MERS-CoV)的刺突(S)蛋白将是用于鉴定的示例性靶。gp120糖蛋白是HIV病毒的示例性鉴定靶。GP表面蛋白是埃博拉病毒的示例性靶。血凝素(HA)蛋白是流感病毒的示例性靶，其中不同的病毒亚型可通过不同的HA变体识别。对于细菌靶，示例性的实施例将针对不同的表面蛋白和多糖分子。在人类发病机制中有价值的具体示例将包括携带抗来自b型流感嗜血杆菌(Hib)或B组链球菌的荚膜多糖(CPS)的抗体的SAPNA分子，或任何数量的具有荚膜多糖外壳的其他病原体。另外的示例将是具有抗以下的抗体的SAPNA分子：莱姆病的病原体(伯氏疏螺旋体或相关物种)的外表面蛋白(OspA)、炭疽杆菌的聚D-谷氨酸荚膜抗原或淋病奈瑟氏球菌的肝素结合抗原(NHBA)。朊病毒和其他淀粉样蛋白疾病通常是神经变性的，并且可以影响人类和动物。在这些病变中，天然蛋白质会以其他方式错误折叠，然后聚集以形成细胞毒性淀粉样蛋白聚集物，这些聚集物可以全身性分布，在不同的器官系统中累积，并且导致疾病。与本发明的该实施例相关的是，朊病毒/淀粉样蛋白的未折叠的/聚集的毒性形式具有与蛋白的天然折叠形式不同的构象，使得这些病原体的毒性形式可通过抗体区分。朊病毒疾病(其致病蛋白可以使用SAPNA分子检测)的示例是人类的克雅氏病(Creutzfeldt-Jokob Disease)和牛的牛海绵状脑病(“疯牛病”)。致病蛋白的检测将扩展至其他淀粉样蛋白：A-β(参与阿尔茨海默病)、tau蛋白(参与多种tau病变)、α-突触核蛋白(参与帕金森病)、甲状腺运载蛋白(参与系统性淀粉样变性)等。这些仅代表了选定的示例。

引用的参考文献：

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应当理解，虽然已经结合本发明的优选具体实施例描述了本发明，但是前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围。对于本发明所属领域的技术人员来说，本发明的范围内的其他方面、优点和修改将是明显的。

本文提及的所有专利、专利申请和出版物据此通过引用整体并入本文。

已经描述了本发明，提供以下实例以通过说明的方式而非限制的方式说明本发明。

实例1

材料与方法

用抗体修饰的自组装蛋白质纳米颗粒(SAPNA)的设计。SAPNA的工作流程是反复的过程：设计一组DNA构建体，尝试表达蛋白质，并且如果蛋白质被表达，表征所述构建体并测试其与人Fc(hFc)的结合。使用定点突变将合成的DNA片段整合到模板支架中(克隆到pET22b+载体中)，并对任何新构建体进行后续突变。支架模板(一个自组装的四面体蛋白质笼)起源于UCLA的Yeates实验室的工作(1-3)。通过最近的合作，我们团队开发的高通量小角度X光散射(HT-SAXS)束线的独特能力被用于在溶液中不同盐和pH条件下对两种支架变体进行结构表征(4)。这两种支架变体被用作进一步功能工程改造的模板。我们旨在将支架功能化，以显示抗体，并考虑到许多可能的用途(参见上文)。通过观察模板支架的可用结构和进化相关同源物的多序列比对，我们确定了潜在的用于诱变的位点。在对正确序列进行测序验证后，并行表达和纯化构建体。在纯化中使用了下列缓冲液：1.裂解(50mM Tris pH8.0，300mM NaCl，10mM咪唑)，2.清洗(50mM Tris pH 8.0，300mM NaCl，100mM咪唑)，3.洗脱(50mM Tris pH 8.0，300mM NaCl，300mM咪唑)，4.凝胶过滤(20mM Tris pH 7.4或8.0，100mM NaCl，或PBS pH 7.4，或PBS pH 7.4，0.05％Triton-X100)。在从Ni-NTA珠洗脱His标记的蛋白后，通过吸光度和理论消光系数来测量浓度。由于构建体的高化合价(12种单体，每种都具有His-标签)，对Ni-NTA珠的增加的亲和力导致相对纯的级分。因此，任何高于基线的明显蛋白质浓度都被预测为适当的半折叠突变体支架。产生所述蛋白的那些构建体通过尺寸排阻色谱法(SEC)被进一步纯化，并在峰移测定中测试hFc结合。重复这一诱变过程，直到发现结合hFc而不形成明显量的支架低聚物的构型(表2)。通过结构技术尺寸排阻色谱法小角度X射线散射耦合多角度光散射(SEC-SAXS-MALS)进一步表征了一组最佳构型。

相关研究

2000年首次描述了被工程改造成结合IgG抗体的Fc区的原始小肽基序，被称为Fc-III[DCAWHLGELVWCT](5)。该基序是通过使用肽噬菌体展示发现的，肽噬菌体展示是选择大分子结合相互作用的迭代方式。通过添加被称为Fc-III-4C[CDCAWHLGELVWCTC]的环肽形式的稳定氨基酸，Fc-III被进一步增强(6)。在2012年，Fc-III肽被整合到铁蛋白蛋白质笼的环中，并证明了结合和靶向抗体的能力(7)。这种铁蛋白蛋白质笼似乎已经被公开(WO2013055058A9)。如下所述，我们将Fc-III和Fc-III-4C序列工程改造到前面提到的支架模板中的几个位点中，我们证明了该支架模板可以在溶液中可重复地结合并展示人和兔IgG抗体。

结果

我们成功地工程改造了基于自组装蛋白的支架，以结合并展示抗体。图1中的SAPNA结构是预测的结构的代表性模型，当结合人或兔IgG Fc结构域或抗体时，动态系统可以在溶液中对这些结构进行采样。为了在生物化学上证明我们的支架分子的抗体/Fc结合能力，将与荧光蛋白PerCP(Fc-PerCP)缀合的人IgG1 Fc加入到支架中并在SEC上运行(图2A和2B)。在280nm处的峰值吸光度(A280)(其是蛋白质的读数(图2A))从保留体积13.2mL移至12.9mL，显示支架尺寸的增加。此外，在482nm处的峰值吸光度(A482)(其是来自PerCP的荧光的读数)出现在12.9mL，支持支架尺寸的增加是由于Fc-PerCP的结合。类似地，用Alexa-488标记的人IgG1同种型抗体(hIgG1抗体-488)的峰移测定是使用支架完成的(图3A和3B)。A280峰(图3A)从保留体积13.2mL移至12.3mL，显示支架尺寸的增加。吸光度488(A488)峰(其是来自Alexa-488荧光染料的荧光的读数)出现在12.3mL，支持支架尺寸的增加是由于hIgG1抗体-488的结合。应当注意，我们有证据表明，荧光团和荧光蛋白(可能通过广泛使用的伯胺法)与抗体/Fcs的化学缀合可能会降低抗体/Fcs结合功能化支架的能力。因此，我们预计图2B和图3B中不会出现这些数据所反映的较大A482和A488峰。

为了从结构上评估用于Fc和抗体结合的支架，我们使用了溶液技术SEC-SAXS-MALS(分别是图4A、4B、5A和5B)。选择支架、hFc和支架-hFc复合物的样品峰的区域用于进一步的散射分析(图4A)。在图4B中使用P(r)函数比较了所有分子/复合物，P(r)函数是散射粒子(8)的取向平均距离的直方图。因此，这些直方图下的面积越大，分子内“分子边缘到分子边缘”距离的幅度和数量就越大。因此，通过添加hFc和抗体分子增加支架的直径将容易地通过P(r)函数显而易见。在图4B中，很明显，图4A中沿着支架-hFc峰的各种支架状态(X，Y，Z)代表hFc分子在支架上的负载。这种负载趋势也在表1中的回转半径(Rg)和最大尺寸(Dmax)的增加中看到。表1中的MALS数据进一步支持了将hFc负载到支架上，其中随着向支架中添加hFc，峰的MALS平均分子量从764kDa增加到1020kDa。当使用图5A和5B中的SEC-SAXS-MALS表征多克隆IgG兔抗GFP抗体与支架(支架-R-抗GFP)的结合时，发现了类似的结果。对支架-R-抗GFP峰的单个区域的分析表明P(r)函数(图5B)，以及峰的Rg、Dmax和MALS平均分子量(表1)的增加。

表1.具有hFc(IgG1)和R-抗GFP抗体(IgG)的支架的特性。

表2.迄今为止设计和实验测试的支架变体的序列。

初始发布的模板：

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在实例1中引用的参考文献：

1.Y.T.Lai,D.Cascio,T.O.Yeates,“通过使用蛋白质寡聚体设计的16nm笼的结构(Structure of a 16-nm cage designed by using protein oligomers)”.《科学(Science)》336,1129(2012)。

4.Y.T.Lai等人,“设计和定义溶液中的动态蛋白质笼纳米组装体(Designing anddefining dynamic protein cage nanoassemblies in solution)”.Sci Adv 2,e1501855(2016)。

5.W.L.DeLano,M.H.Ultsch,A.M.de Vos,J.A.Wells,“z蛋白质-蛋白质界面结合的收敛溶液(Convergent solutions to binding at a protein-protein interface)”.《科学》287,1279-1283(2000)。

6.Y.Gong,L.Zhang,J.Li,S.Feng,H.Deng,“用于抗体纯化和蛋白质检测的双环肽配体的开发(Development of the Double Cyclic Peptide Ligand for AntibodyPurification and Protein Detection)”.《生物共轭化学(Bioconjug Chem)》27,1569-1573(2016)。

8.C.D.Putnam,M.Hammel,G.L.Hura,J.A.Tainer,“X射线溶液散射(SAXS)与晶体学和计算相结合：定义溶液中精确的大分子结构、构象和组装体(X-ray solutionscattering(SAXS)combined with crystallography and computation:definingaccurate macromolecular structures,conformations and assemblies insolution)”.《生物物理学的季度评论(Q.Rev.Biophys.)》40,191-285(2007)。

实例2

材料与方法

抗体的SAPNA结合的动态光散射(DLS)分析。将样品在pH 7.4的PBS中稀释，并在DynaPro平板读取器III上运行。DLS采集时间为5秒，并且每个样品进行5次采集。温度是20摄氏度。

原代人T细胞扩增测定。将从随机供体的外周血(PB)单核细胞(MNC)中分离的原代人泛T细胞(包括CD4⁺和CD8⁺T细胞以及一些γ/δT细胞子集)置于96孔板中。在第1天，用负载有不同比率的抗CD3/抗CD28抗体或竞争技术的可溶性SAPNA处理一式三份孔。每隔3-4天加入含有外源重组人IL-2的新鲜无异种培养基。用以下对T细胞进行染色：活/死染色、抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CCR7、抗CD45RA和抗CD95抗体。使用文献支持的T细胞子集鉴定染色方案，通过流式细胞术来评估T细胞分化：T_CM(CCR7+CD45RA-)、T_EM(CCR7-CD45RA-)、T_EMRA(CCR7-CD45RA+)、T_SCM(CD45RA+CCR7+→CD95+)、T_天然(CD45RA+CCR7+→CD95-)。样品在LSR FortessaX20分析仪流式细胞仪上运行，并且使用FlowJo 10.6.1分析数据。

使用珠结合的SAPNA分离CD8+T细胞。将14天扩增的原代人泛T细胞置于96孔板中。首先在室温下将SAPNA与磁性Ni-NTA(mag)珠一起孵育5分钟，然后加入兔抗CD8抗体并额外孵育20分钟。制备了从混合物中保留SAPNA的对照。将对照和mag-SAPNA-CD8珠添加到一式三份孔中，并将板放回37摄氏度、5％CO₂的培养箱中持续1小时。将细胞珠溶液重新悬浮并置于磁铁上2分钟。珠结合的组分被吸引到磁铁上，而含有细胞悬浮液的上清液被转移到新的平板上用于流式细胞术染色。与“原代人T细胞扩增测定”部分相同地，将细胞染色并且评估。

免疫荧光显微镜。将HeLa细胞在37摄氏度、5％CO₂的培养箱中培养，并接种在盖玻片上。将细胞固定在PBS+0.2％Triton X-100的4％多聚甲醛中。然后将它们在PBS+0.5％Triton X-100(PBST)中透化30分钟。将透化的细胞在PBST(+5％FBS)中封闭30分钟。使用兔抗ROBO1抗体和山羊抗兔A488二级抗体进行对照染色。对于实验组，将SAPNA用Alexa-488化学标记，并与兔抗ROBO1一起孵育至少30分钟。然后在室温下，将负载的SAPNA分子在PBST(+5％FBS)中孵育1小时。将盖玻片用PBST洗涤，然后只用PBS洗涤。盖玻片是使用含有DNA染色剂DAPI的防伪安装介质安装的。

结果

SAPNA分子具有12个潜在的抗体Fc结合位点，并且可以安装任何人或兔IgG(图7)。我们通过将SAPNA与兔抗ROBO1抗体结合，证明了SAPNA的能力(图8)。我们假设SAPNA可以通过物理方式迫使细胞表面受体紧密靠近，这是T细胞的激活和扩增中的必要步骤(图9)。

为了评估和基准化SAPNA，我们用临床相关的供体来源的外周血T细胞进行了14天的T细胞扩增(图10)。这些数据表明，SAPNA产生含有最高数量的细胞毒性CD8⁺T细胞的T细胞产物(图4-左上图)，这些细胞是用嵌合抗原受体(CAR)进行工程改造的预期细胞，旨在将其靶向癌细胞。相对于竞争技术，SAPNA在CD4+T细胞扩增方面的表现位居前2位(图10-左下图)；这些是最终CAR T细胞产物¹的重要组成部分。此外，研究表明，具有更类似干细胞表型的T细胞子集(诸如记忆干细胞(T_SCM)T细胞)在体内具有最大的长期抗癌功效，因此，在最终扩增的CAR T细胞产物中增加这些细胞的数量具有非常重要的治疗价值(Turtle，C.J.等人，“成人B细胞ALL患者中确定的CD4+:CD8+组成的CD19 CAR-T细胞(CD19 CAR-T cells ofdefined CD4+:CD8+composition in adult B cell ALL patients)”《临床研究杂志(J.Clin.Invest)》126,2123-2138(2016)；Gattinoni,L等人.“Wnt信号传导抑制效应T细胞分化并且产生CD8+记忆干细胞(Wnt signaling arrests effector T celldifferentiation and generates CD8+memory stem cells)”《自然医学(Nat.Med.)》15,808-813(2009))。在扩增期间，SAPNA技术产生最多数量的CD4⁺和CD8⁺T_SCM细胞(图10-右上图和右下图)。总之，这些数据表明，SAPNA在技术上是优越的，并且具有产生更多数量的具有更有效的抗癌活性的CAR T细胞的潜力。

由于SAPNA分子上有12个his-标签(每个单体上有一个)，我们假设它可以与磁性镍珠结合，同时也结合并展示抗体。通过这种双重作用，我们证明了SAPNA可以用于从混合的细胞群中分离(或阴性地选择)具有特定细胞表面标记物的细胞群，例如CD8(图11)。

为了评估SAPNA是否可以靶向癌细胞的表面，我们采用了免疫荧光显微镜。在使用小角X射线散射(SAXS)来验证用Alexa-488化学标记SAPNA对其结构几乎没有影响(图12)之后，我们通过用与图8中DLS所用相同的兔抗ROBO1抗体加载标记的纳米颗粒，将该纳米颗粒靶向HeLa宫颈癌细胞的表面。488标记的SAPNA特异性地靶向细胞的表面(图13)。

虽然已经参照本发明的具体实施例描述了本发明，但是本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，可以进行各种改变并且可以替换等同物。此外，可以进行许多修改以使特定情况、材料、物质的组成、工艺、一个或多个工艺步骤适应本发明的目的、精神和范围。所有这些修改都意图在所附权利要求的范围内。

所有引用的参考文献据此均通过引用以其整体具体地并入。

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