具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

以下实施例中所使用的豌豆蛋白和菊粉均购买于上海源叶生物科技有限公司，且纯度为90％。

以下实施例中，豌豆蛋白-菊粉物理混合物(命名为Mix)的制备方法为：配制豌豆蛋白与菊粉的混合溶液，其中豌豆蛋白的浓度为1wt％，菊粉的浓度为0.5wt％，随后经过48h的透析处理，冷冻干燥得到物理混合物。

实施例1

1.豌豆蛋白-菊粉复合物的制备方法：

(1)精确称量豌豆蛋白和不同质量的菊粉，并分散在去离子水中，分别将其在磁力搅拌器上以600rpm的转速搅拌过夜以确保它们完全溶解。将豌豆蛋白和菊粉溶液等体积混合在一起并搅拌5h以形成胶体分散体，混合溶液中豌豆蛋白的浓度为1wt％，菊粉的浓度为0.25-1.25wt％。

(2)用2M的NaOH溶液将混合溶液的pH值调节至10.0。然后在80℃水浴条件下于超声细胞破碎器中以100-600W的功率处理20-40min。

(3)超声处理后，将样品降至5℃以停止反应，然后使用2M的HCl溶液将pH值调回至7.0。将所得溶液进行透析，透析时间为48h，期间换水6次，以除去盐离子和未反应的菊粉。随后对溶液进行冷冻干燥得到豌豆蛋白-菊粉复合物。

2.进行单因素实验

按照表1进行单因素实验，制备得到豌豆蛋白-菊粉复合物。

表1

3.糖基化蛋白的接枝度检测方法：

将80mg邻苯二甲醛(OPA)试剂溶于2mL甲醇中，然后与50mL 0.1mol/L的四硼酸钠缓冲液(pH9.7)，5mL 20％(w/w)十二烷基硫酸钠(SDS)溶液和200μL的β-巯基乙醇混合，使用蒸馏水调节体积至100mL。在测量过程中，将200μL的样品溶液(5mg/mL)添加到4mL的OPA试剂中，并在35℃下孵育2min。然后使用紫外-可见分光光度计在340nm下测量样品的吸光度值。将未处理豌豆蛋白作为对照样品，并将蒸馏水用作空白。接枝度(DG)计算如下：

DG＝(Ac-As)/Ac×100％

其中，Ac是对照(未处理豌豆蛋白)的吸光度，而As是样品的吸光度。

4.褐变指数检测方法：

制备豌豆蛋白-菊粉复合物溶液(蛋白质浓度＝10mg/mL)并使用紫外-可见分光光度计测定其在420nm处的吸光度，以蒸馏水作为空白对照。

实施例1的接枝度和褐变指数如图1所示。如图1(A-C)所示，接枝度随着超声处理功率、超声处理时间和菊粉浓度的增加而增加，在400W的超声功率、25min的超声时间和0.5wt％的菊粉浓度下，接枝度分别达到10.9％、16.9％和13.8％的最大值。超声处理提高接枝度可归因于与高强度超声相关的空化效应，其促进部分蛋白质解折叠，从而通过暴露更多活性氨基进而促进接枝反应。随着菊粉浓度的增加，更多的菊粉分子可与蛋白质相互作用，从而使得接枝度增加。当超声处理功率和时间分别大于400W和25min时，接枝度下降，主要是由于过度的超声处理可能会导致蛋白质聚集。此外，菊粉浓度高于0.5wt％时，接枝度的降低可能是由于系统粘度的增加，从而降低了蛋白质和菊粉分子之间发生碰撞的频率。

豌豆蛋白-菊粉复合物在420nm处的吸光度通常用于表征美拉德反应褐变的程度，这也可以检测美拉德反应的进程。如图1(A-C)所示，A420表现出与接枝度相似的趋势。随着超声处理功率、超声处理时间和菊粉浓度的增加，A420先增加然后减少，在400W的超声功率，25min的超声时间和0.5wt％的菊粉浓度时达到最大值。这表明此时在豌豆蛋白和菊粉之间生成了最多的高分子量类黑精，这与前面讨论的接枝度的结果一致。

实施例2

(1)精确称量豌豆蛋白和菊粉，并分散在去离子水中，分别在磁力搅拌器上搅拌过夜以确保它们完全溶解。将豌豆蛋白和菊粉溶液等体积混合在一起并搅拌5h以形成胶体分散体，溶液中豌豆蛋白的浓度为1wt％，菊粉的浓度为0.5wt％。

(2)用2M的NaOH溶液将混合溶液的pH值调节至10.0。然后在80℃水浴条件下于超声细胞破碎器中以400W的功率处理25min。

(3)超声处理后，将样品置于冰水浴中以停止反应，然后使用2M的HCl溶液将pH值回调至7.0。将所得溶液进行透析，透析时间为48h，期间换水6次，以除去盐离子和未反应的菊粉。随后对溶液进行冷冻干燥得到接枝产物，将其命名为C4。

对比例1

同实施例2，区别仅在于，仅进行水浴加热处理，无超声及pH偏移处理，制备得到的豌豆蛋白-菊粉复合物样品命名为C1。

对比例2

同实施例2，区别仅在于，仅进行pH偏移和水浴加热处理，无超声处理，制备得到的豌豆蛋白-菊粉复合物样品命名为C2。

对比例3

同实施例2，区别仅在于，仅进行超声和水浴加热处理，无pH偏移处理，制备得到的豌豆蛋白-菊粉复合物样品命名为C3。

性能检测

1.比较不同处理方法对豌豆蛋白-菊粉复合物接枝度的影响

将实施例2和对比例1-3进行接枝度检测，比较不同处理方法对豌豆蛋白-菊粉复合物接枝度的影响，结果见图1(D)。C4具有最大的接枝度，表明同时使用pH偏移和超声处理在促进美拉德反应方面比单独使用它们中的任何一种方法更有效。这主要是因为在远高于蛋白质等电点的pH值下进行超声处理可以更加有效地促进豌豆蛋白分子展开，从而暴露出更多的游离氨基，进而增强美拉德反应。

2.溶解性

溶解性的检测方法：

制备总蛋白质浓度为1mg/mL的豌豆蛋白和豌豆蛋白-菊粉复合物溶液。然后使用2M HCl或NaOH溶液将这些溶液的pH值调节至2-11。在室温下搅拌2h后，将样品以6000rpm的转速离心20min。然后使用福林酚法测量上清液的蛋白质浓度。根据以下公式计算溶解性：

溶解性(％)＝100×C_S/C_T

其中，Cs是上清液中蛋白质的浓度，C_T是溶液中总蛋白质的浓度。

将未处理豌豆蛋白(命名为PPI)、实施例2与对比例1-3制备的豌豆蛋白-菊粉复合物进行溶解性检测，结果见图2。PPI的溶解性高度依赖于pH值，随着pH值的升高，溶解性先降低后升高，在pH4-5附近达到最小值。这主要是因为蛋白质在接近等电点时倾向于聚集。与菊粉结合后，蛋白质的溶解性在2-11的pH值范围内大大增加。这可归因于亲水性菊粉与豌豆蛋白分子的共价连接，这增加了它们之间的空间斥力并阻碍了它们的聚集。与其他复合物相比，C4的溶解性最好，尤其是在等电点附近，这主要是由于相对于其他复合物，C4具有较高的接枝度。因此，超声和pH偏移联合辅助湿热法可有效地提高豌豆蛋白的溶解性。

3.热稳定性

热稳定性的检测方法：

采用差示扫描量热仪测量样品的热行为。称取约3.0mg样品放入固体铝盘中，然后用铝盖密封。同时，使用空样品盘作为参考。将样品以10℃/min的速率从50℃加热到200℃，氮气流速为50mL/min。记录差示扫描量热法(DSC)热谱图并计算峰值变性温度(Ta)。

将未处理豌豆蛋白(命名为PPI)、豌豆蛋白-菊粉物理混合物(命名为Mix)、实施例2与对比例1-3制备的豌豆蛋白-菊粉复合物进行热稳定性检测，结果见图3。豌豆蛋白-菊粉复合物的变性温度(101.92-109.13℃)高于纯PPI(101.59℃)和物理混合物(90.40℃)。这些结果表明，美拉德反应显着提高了豌豆蛋白的热稳定性，这可能是因为糖基化产物通过空间效应限制了蛋白质的展开。此外，与其他复合物相比，C4的变性温度最高，因此热稳定性最好。

4.抗氧化性

抗氧化性的检测方法：

使用DPPH自由基清除法评估豌豆蛋白、豌豆蛋白-菊粉物理混合物和豌豆蛋白-菊粉复合物的抗氧化能力。首先，用无水乙醇制备DPPH溶液(0.1mM)，然后用蒸馏水制备不同浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL)的样品。将0.5mL样品与2.5mL的DPPH溶液混合，并在室温下黑暗环境中反应30min。随后，使用紫外-可见分光光度计在517nm处测量样品的吸光度。样品的DPPH自由基清除活性(％)按下式计算：

DPPH清除自由基活性(％)＝[1-(As-Ac)/Ab]×100％

其中As为样品的吸光度，Ac为对照(加入乙醇代替DPPH)的吸光度，Ab为空白(加入乙醇代替样品)的吸光度。

将未处理豌豆蛋白(命名为PPI)、豌豆蛋白-菊粉物理混合物(命名为Mix)、实施例2与对比例1-3制备的豌豆蛋白-菊粉复合物进行抗氧化性检测，结果见图4。当样品浓度在0.2-1.0mg/mL时，自由基清除活性按以下顺序降低：C4>C3>C2>C1>Mix>PPI。此外，所有样品的抗氧化能力均以剂量依赖性方式增加。在1.0mg/mL的浓度下，四种复合物的自由基清除能力分别是PPI的1.31、1.45、1.57和1.88倍。这种现象主要是因为美拉德反应中产生的结合物可以通过供给氢形成稳定的DPPH-H分子，达到清除自由基的目的。此外，美拉德反应后期产生的类黑精具有良好的抗氧化活性。在所有复合物中，C4表现出最高的抗氧化活性，表明pH偏移和超声联合处理可以有效地加速美拉德反应，从而促进抗氧化反应产物的形成。

5.泡沫性质

起泡能力(FC)和泡沫稳定性(FS)的检测方法：

将不同样品(2mg/mL蛋白质)放入小瓶中，测量并记录样品溶液的高度(H₁)。使用高速剪切机以12000rpm剪切样品5min，然后立即测量并记录样品溶液的高度(H₂)。30min后，记录样品高度(H₃)。样品的起泡能力(FC)和泡沫稳定性(FS)计算公式如下：

FC(％)＝(H₂-H₁)/H₁×100％

FS(％)＝(H₃-H₁)/H₁×100％

将未处理豌豆蛋白(命名为PPI)、实施例2与对比例1-3制备的豌豆蛋白-菊粉复合物进行起泡能力(FC)和泡沫稳定性(FS)检测，结果见图5。未处理豌豆蛋白的起泡能力和泡沫稳定性分别为31.2％和26.8％。糖基化后，起泡能力和起泡稳定性得到改善，其中C4的增加幅度最大，分别比纯PPI高约3.4和3.3倍。这表明超声和pH偏移联合处理可以有效改善豌豆蛋白的泡沫性质。

6.乳化性质

乳化活性指数(EAI)和乳化稳定性指数(ESI)的检测方法：

利用0.01M的磷酸缓冲液(pH＝7)制备样品溶液(2mg/mL蛋白质)，然后将2mL玉米油与8mL样品溶液混合，并用高速剪切机于13000rpm下剪切3min。剪切完成后，立即从容器底部取出50μL乳液，加入至5mL 0.1％(w/v)SDS溶液中。静置10min，进行同样处理，用紫外-可见分光光度计在500nm处测量样品的吸光度。按下式计算EAI和ESI：

EAI(m₂/g)＝(2×2.303×A₀)/(C×10⁴×Φ)×100

ESI(％)＝A₁₀/A₀×100％

其中，A₀和A₁₀分别是0min和10min时的吸光度；C是蛋白质浓度(g/mL)；Φ是油相的比例(0.2)。

将未处理豌豆蛋白(命名为PPI)、实施例2与对比例1-3制备的豌豆蛋白-菊粉复合物进行乳化活性指数(EAI)和乳化稳定性指数(ESI)检测，结果见图6。与豌豆蛋白相比，豌豆蛋白-菊粉复合物的EAI和ESI值增加，乳化特性得以改善，这可能是由于其水溶性的增加。此外，亲水性菊粉链与豌豆蛋白表面的共价连接可能通过增加它们之间的空间斥力来降低油滴彼此聚集的趋势。与其他复合物相比，C4表现出最好的乳化性质。因此，超声和pH偏移联合辅助湿热法可以有效地提高豌豆蛋白的乳化性质。

7.环境稳定性

按照下述方法制备乳液以提高其环境稳定性：

(1)乳液的制备

将0.27g的样品溶于54mL的去离子水中，在磁力搅拌器上以600rpm的转速搅拌过夜，使其充分溶解，作为水相。将含有0.6wt％柠檬精油的藻油作为油相。将6mL油相加入至水相中，利用高速剪切机于10000rpm下剪切3min得到粗乳液。利用高压均质机对粗乳液进行高压均质处理，处理条件为50MPa，循环3次，得到不同的乳液。

(2)乳液环境稳定性的评估

将未处理豌豆蛋白(命名为PPI)、豌豆蛋白-菊粉物理混合物(命名为Mix)、实施例2与对比例1-3制备的豌豆蛋白-菊粉复合物按照上述方法分别制备成乳液，并在不同环境条件进行稳定性测定。取3mL乳液置于测量瓶中，将不同的乳液分别于不同温度(40℃、60℃和80℃)的水浴中处理20min或者加入等体积的NaCl溶液(0.2，0.4，0.6M)。处理结束后将乳液于室温下放置，第二天测定乳液的粒径，结果见图7。随着处理温度和盐离子浓度的增加，PPI乳液的粒径显著上升，这可能是由于在不利环境条件下，乳液液滴发生了聚集等现象。物理混合物和四种复合物的粒径也有所上升，但增加幅度降低。这可能是由于菊粉的引入增加了液滴之间的空间斥力，从而抑制了液滴的聚集。复合物C4制备的乳液几乎保持相对稳定，这与其较高的接枝度，即较多的菊粉连接有关。

总之，蛋白质稳定的乳液对环境压力(如离子强度、加热)高度敏感。而复合物制备的乳液可以有效地提高其在不同环境压力下的稳定性。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。