用于治疗癌症的具有修饰的b5r基因的溶瘤痘苗病毒

文档序号：53718 发布日期：2021-09-28 浏览：30次 >En<

阅读说明：本技术 用于治疗癌症的具有修饰的b5r基因的溶瘤痘苗病毒 (Oncolytic vaccinia virus with modified B5R gene for use in treating cancer ) 是由王尧河袁明于 2019-10-10 设计创作，主要内容包括：本发明涉及痘苗病毒载体,其包含编码插入到所述痘苗病毒的TK基因中的SCR1、SCR2、SCR3和SCR4结构域缺失的B5R基因(B5R SCR1～(-)SCR2～(-)SCR3～(-)SCR4～(-))的核酸序列。本发明还涉及包含痘苗病毒载体的组合物、使用该组合物的治疗方法、该组合物的医学用途和包含该痘苗病毒载体的试剂盒。本发明涉及核酸序列,该核酸序列编码痘苗病毒的SCR1、SCR2、SCR3和SCR4结构域缺失的B5R基因(B5R SCR1～(-)SCR2～(-)SCR3～(-)SCR4～(-))。(The present invention relates to vaccinia virus vectors comprising a B5R gene encoding a deletion of SCR1, SCR2, SCR3 and SCR4 domains inserted into the TK gene of the vaccinia virus (B5R SCR 1) ‑ SCR2 ‑ SCR3 ‑ SCR4 ‑ ) The nucleic acid sequence of (1). The invention also relates to compositions comprising vaccinia virus vectors, methods of treatment using the compositions, medical uses of the compositions, and kits comprising the vaccinia virus vectors. The present invention relates to nucleic acid sequences encoding deletions of the SCR1, SCR2, SCR3 and SCR4 domains of vaccinia virusB5R gene (B5R SCR 1) ‑ SCR2 ‑ SCR3 ‑ SCR4 ‑ )。)

具体实施方式

中，核酸序列具有图31中任一个所示的式。

根据本发明的第二方面，提供了一种组合物，其包含本发明的第一方面的痘苗病毒载体。在本发明根据该方面的实施方式中，该组合物可选地包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。因此，本发明包括本文所述的药物组合物。

该组合物可适于通过任何合适的途径给药，例如通过口服(包括颊或舌下)、局部(包括颊、舌下或透皮)或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、动脉内、鞘内、胸膜内、眼内、心脏内、腹膜内或真皮内)途径。

适于肠胃外给药的药物组合物包括：水性和非水性无菌注射溶液，所述无菌注射溶液可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得制剂与预期接受者的血液基本等渗的溶质；水性和非水性无菌悬浮液，所述无菌悬浮液可包含悬浮剂和增稠剂。

可以用于可注射溶液的赋形剂包括例如水、醇、多元醇、甘油和植物油。该组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿瓶和小瓶中，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，从而仅需要在使用之前立即添加所携带的无菌液体，例如注射用水。临时注射溶液和混悬液可以由无菌粉末、颗粒和片剂制备。

药物组合物可以包含防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、气味剂、盐(本发明的物质本身可以以药学上可接受的盐的形式提供)、缓冲剂、包衣剂或抗氧化剂。除了本发明的物质外，它们还可以包含治疗活性剂。

根据本发明的第三方面，提供了一种治疗方法，该方法包括将本发明的第二方面的组合物给药至有需要的对象以治疗癌症。该组合物可以可选地与药学上可接受的佐剂、稀释剂和/或缓冲剂一起配制。因此可以将该组合物配制成药物组合物。

本发明该方面的实施方式扩展到包含用于治疗癌症的如本文定义的痘苗病毒载体的组合物。这样的实施方式包括在制备用于治疗癌症的药物中的如本文定义的核酸序列或痘苗病毒载体。

如本文所用，对象是指动物，包括人。动物可以包括小鼠、大鼠、禽类(例如鸡)、反刍动物(例如牛、山羊、鹿、绵羊)和其他动物(例如猪、猫、狗和灵长类，如人、黑猩猩、大猩猩和猴子)。

治疗有效量是足以诱导溶瘤的剂量。可以基于当前现有方案，使用动物疾病模型或可选地在人类临床试验中凭经验确定用于递送和给药的剂量。初始研究剂量可以基于本文所述的动物研究，例如对小鼠的动物研究。剂量可以变化，并取决于：治疗是预防性的还是治疗性的，治疗所针对疾病的类型、发作、进展、严重程度、频率、持续时间或概率，所期望的临床终点，既往治疗或同时治疗，对象的总体健康、年龄、性别、种族或免疫能力，以及技术人员将理解的其他因素。可以如治疗或疗法的任何不利副作用、并发症或其他危险因素以及对象的状况所指示的，按比例增加或减少剂量、次数、频率或持续时间。技术人员将理解可能影响提供足以用于提供治疗或预防益处的量所需的剂量和时间的因素。

在本发明该方面的实施方式中，该方法进一步包括向对象施用额外的癌症疗法。如本文所用，癌症疗法是指通过任何医学或物理手段治疗癌症。额外的癌症疗法可以是化学疗法、生物疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、抗血管疗法、冷冻疗法、毒素疗法和/或外科手术，也包括其组合。

如本文所公开的本发明的方法和用途可以在对象被鉴定为患有治疗所针对的疾病后立即或数天、数月或数年实践。

这些方法包括按照不同的时间表给药病毒。可以在1、2、5、10、15、20或24小时的时间内向对象或肿瘤给药单剂量的病毒。该病毒可以在1、2、3、4、5、6、7或更多天或几周内给药。注射间隔可以是1、2、3、4、5、6、7天或几周。通常，例如在肿瘤附近或在静脉内给药的情况下在对象的血流或淋巴系统中的特定进入点，将多个剂量给药至相同的一般靶区域。痘苗病毒载体可以给药2、3、4、5或更多次。可以在切除肿瘤之前以不同的时间表和剂量给予痘苗病毒载体。

该方法和用途还可以包括分别、随后或同时给药病毒的一种、两种、三种或四种不同的实施方式。可以分别、随后或同时给药包含编码第一异源蛋白的核酸序列的第一病毒和包含编码第二异源蛋白的核酸序列的第二病毒。病毒的不同实施方式的后续给药之间的间隔可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或24小时。

例如，包含编码免疫检查点抑制剂的核酸序列的第一病毒可以在包含编码细胞因子的核酸序列的第二病毒之后给药。

免疫检查点抑制剂蛋白可以是PD1、PD-L1、TIM-3或CTLA-4，或其任何组合。免疫检查点抑制剂蛋白可以是可溶的。

细胞因子可以是IL-21、GM-CSF、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18和IFN-α，或其任何组合。

在一种实施方式中，在生物活性蛋白为IL-12的痘苗病毒载体之后给药生物活性蛋白为可溶性PD1的痘苗病毒载体。

该方法和用途还可包括分别、随后或同时给药病毒和异源蛋白。后续给药之间的间隔可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或24小时。例如，可以在包含编码细胞因子的核酸序列的病毒之后给药抗体。

分别、随后或同时给药本发明的第一或第二方面或异源蛋白可以通过任何方便的途径实现，借以通过静脉内、腹膜内、肌内、口服、鼻内或皮下方式给药。本发明的第一或第二方面和异源蛋白可以作为组合制剂制备，或者可以作为单独的组分制备。

该方法包括以不同病毒浓度给药病毒。在某些方面，向对象给药至少5×10⁷、1×10⁸、2×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、2×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹、5×10¹¹、1×10¹²或更多的病毒颗粒或噬斑形成单位(pfu)，包括各值和各值之间的范围。可以以0.1mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL或更多的病毒剂量给药，包括所有值和所有值之间的范围。剂量可以随时间或通过分开注射而分布开。

在某些实施方式中，对象是患有癌症和/或肿瘤的人。癌症可以是胃肠道癌、呼吸道癌、泌尿生殖道癌、造血癌、肉瘤、腺癌、鳞状细胞癌或非恶性肿瘤/增生。肿瘤可以在治疗之前是不可切除的，而在治疗之后是可切除的。肿瘤可以是复发性、原发性、转移性和/或多药耐药性肿瘤。在某些方面，肿瘤位于胰腺上或胰腺中。在其他方面，该肿瘤可以是神经内分泌肿瘤、内分泌肿瘤、周围中枢神经系统肿瘤、脑癌肿瘤、头颈癌肿瘤、食道癌肿瘤、皮肤癌肿瘤、肺癌肿瘤、肝肿瘤、胸腺肿瘤、胃癌肿瘤、结肠癌肿瘤、卵巢癌肿瘤、子宫癌肿瘤、膀胱癌肿瘤、睾丸癌肿瘤、膀胱肿瘤、直肠癌肿瘤、黑色素瘤或乳腺癌肿瘤。

本发明中公开的组合物和方法可以用于不同类型的基因疗法中，例如肿瘤抑制基因疗法、自杀基因疗法、病毒载体免疫策略，抗血管生成疗法、促凋亡基因疗法和基因替代疗法。“Oncolytic Viruses for Cancer Therapy:Overcoming the Obstacles”(Wong等人.Viruses 2010,2,78-106)的全部内容通过引用并入本文。

本发明中公开的组合物和方法可以与额外癌症治疗手段或方法联合使用，例如外科手术，化学疗法、放射疗法、分子癌症疗法或可用于给药与本文所述的本发明核酸不同的基因的其他基因疗法。

根据本发明的第四方面，提供了编码痘苗病毒的SCR1、SCR2、SCR3和SCR4结构域缺失的B5R基因(B5R SCR1^- SCR2^-SCR3^- SCR4^-)的核酸序列。

根据本发明的第五方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含如本文定义的痘苗病毒载体和药学上可接受的佐剂、稀释剂和/或缓冲剂。因此，该试剂盒可用于治疗癌症。该试剂盒可进一步包含其他治疗剂(例如化学治疗剂)和/或使用说明。

本发明描述了新型的重组痘苗病毒表达载体及其在癌症治疗和疫苗接种中的应用。本发明的载体(命名为VVL15TK STC)来源自痘苗病毒Lister疫苗菌株，该疫苗菌株已经在数亿人中安全地用于预防天花，该疫苗菌株更特别地包括缺失一个病毒基因(胸苷激酶基因)。这种新型突变体VV产生的感染性EEV是其亲本病毒所产生的10到30倍，而突变体VV的总体复制却没有减弱。

在本发明的一种实施方式中，描述了具有复制能力的痘苗病毒Lister菌株(VV15TK-STC)，该菌株包含在胸苷激酶(TK)区中的一部分B5R基因(STC)和完整的B5R基因，其显示出更好的彗尾形成和EEV产量，并且噬斑大小正常。可以将该部分B5R基因(STC)插入痘苗病毒基因组的任何非关键区域，同时B5R基因完整无损，这样的修饰将使修饰的病毒具有与VV15 TK-STC相同的特征。VV15 TK-STC病毒在体内具有增强的抗肿瘤功效。带有治疗性基因IL-21的VV15 TK-STC病毒可改善抗肿瘤免疫力。VV15TK-STC病毒可以携带任何其他治疗性基因，例如IL-12。VV15 TK-STC病毒可以局部(肿瘤内注射)和全身(静脉内注射)给药。

在本发明的一种实施方式中，描述了一种新型VV载体及其在癌症治疗中的用途，该VV载体来源自Lister菌株VV，具有对病毒基因的特定操控，即在胸苷激酶区中插入部分B5R基因(STC)。

将突变的B5R基因(STC)引入到TK区中的同时保持原始B5R基因在其原始位置创建了体外产生正常噬斑大小的病毒，这对于更好地传播病毒是重要的。这种修饰导致产生较多的EEV，这对病毒进行长距离传播的能力有益。因此，如本发明中所示，这种修饰增强了病毒的抗肿瘤效力并创建了更适合于静脉内递送的病毒。

溶瘤病毒的静脉内递送对于改善体内抗肿瘤功效是可取的，因为除患者体内的原发肿瘤以外，预期静脉内递送的病毒还更容易靶向转移性肿瘤细胞和循环肿瘤细胞。本发明的关键优点是可以更有效地静脉内递送溶瘤病毒。本文所述的突变病毒具有增强的形成EEV的能力，这是进一步有利的，因为EEV形式的痘苗病毒固有地对免疫介导的病毒清除具有更高的抗性。本发明显示，可以通过在修饰的VV中并入病毒B5R基因STC区的第二个拷贝，同时维持原始全长B5R区的表达，来修饰肿瘤趋向性(借助于TK和N1L缺失)VV以增强EEV形成。本发明代表了临床上尚未被证明静脉内递送时的功效的可静脉内递送溶瘤病毒疗法向前迈进了一步。修饰的病毒还可以在原发和转移位点并入更多的转基因以增强针对肿瘤的免疫应答。

本发明的第二方面和后续方面的优选特征在细节上作必要修改后与第一方面相同。

现在将参考附图描述本发明，所述附图仅出于说明的目的而被包括在内，并且不应被解释为对本发明的限制。

图1显示了pGEMT-B5R-STC和pGEMT-B5R S-STC穿梭载体中的表达盒。上图显示了pGEMT-B5RSTC和S-STC穿梭载体中B5R蛋白的结构和表达盒。表达STALK-TM-CT(STC)包含信号肽(SP)和SCR1-STALK-TM-CT(S-STC)包含信号肽(SP)。下图是pGEMT-B5R STC穿梭载体中的表达盒，标记基因RFP和STALK-TM-TC(STC)均由H5启动子驱动。包含信号肽(SP)的表达STALK-TM-CT(STC)由H5启动子驱动，包含信号肽(SP)的SCR1-STALK-TM-CT(S-STC)由天然B5R启动子驱动，标记基因RFP由H5启动子驱动。SP＝B5R基因的信号肽。pGEMT-B5R-STC和pGEMT-B5R S-STC穿梭载体的同源重组部分。TK L臂靶向TK基因的左侧(L089)，TK R臂靶向TK基因的右侧(L091)。表达盒位于TK L臂和TK R臂之间。

图2显示了在体外痘苗病毒的噬斑和彗尾形成的比较。用稀释的对照病毒VVL15、重组VVL15 B5R-STC、重组VVL15 B5R S-STC感染6孔板中的CV-1细胞。如前所述，感染后3天，将感染的细胞用结晶紫染色。对板进行照片扫描。

图3显示了表达盒和TK-STC穿梭载体以及同源重组。上图：第一H5启动子(左起)驱动RFP表达，第二H5启动子驱动STC表达。SP：信号肽(来自B5R)；STC：茎区(S)，TM(T)，CT(C)。TM是B5R蛋白的跨膜结构域，CT是B5R蛋白的胞质尾区。下图：TK-STC穿梭载体的同源重组部分。TK左臂(L臂)靶向TK基因的左侧(L089)，TK右臂(R臂)靶向TK基因的右侧(L091)。表达盒(Loxp-H5-RFP-Loxp-H5-SP+STC)位于TK区的TK L臂和TK-R臂之间。

图4显示了对VVL15 TK-STC病毒的确认。A：VVL15 RFP病毒。B：VVL15 TK-STC病毒。最后一轮VVL15 TK-STC噬斑纯化确认了，CV1细胞孔内的所有克隆均表达RFP。使用了特异性引物对以通过PCR从提取自CV1裂解物的病毒DNA扩增STC基因和部分下游TK基因。VVL15RFP DNA中不存在PCR产物，但VVL15 TK-STC DNA中存在PCR产物，这表明VVL15 TK-STC中的TK基因缺失以及TK区中存在STC。在PCR中使用在B5R基因的SP上的正向引物和在B5R胞质尾区上的反向引物来扩增整个B5R基因和突变B5R STC。如预期的那样，全长B5R存在于VVL15RFP和VVL15 TK-STC中，而突变体SP-STC仅存在于VVL15 TK-STC中。

图5显示了痘苗病毒噬斑的比较。用稀释的对照病毒VVL15 RFP、重组VVL15 TK-STC感染6孔板中的CV-1细胞，并用琼脂糖凝胶覆盖。三天后，除去琼脂糖凝胶，并用结晶紫将细胞染色。板进行照片扫描，如左图所示。使用Image J测量噬斑的大小，如右图所示。

图6显示了痘苗病毒的噬斑和彗尾形成的比较。用对照病毒VVL15 RFP和重组VVL15TK STC感染6孔板中的CV-1细胞。感染后3天，将细胞用结晶紫染色，并对板进行照片扫描。

图7显示了在CV1细胞系中VVL15 RFP和VVL15TK STC病毒的EEV产量。用0.01PFU/细胞的VV感染6孔板中的CV-1细胞。感染后48和72小时将细胞培养基和感染的细胞收集到单独的管中，并分别滴定病毒。通过比较从细胞培养基中回收的病毒总量与从感染细胞中回收的病毒总量，计算出产生的EEV的比例。

图8显示了在胰腺癌细胞系中VVL-DD和VVL-DD STC病毒的EEV产量。用0.01PFU/细胞的VV感染6孔板中的细胞。感染后18、24和48小时，将细胞培养基和感染的细胞收集到单独的试管中，并分别滴定病毒。通过比较从细胞培养基中回收的病毒总量与从感染细胞中回收的病毒总量，计算出产生的EEV的比例。TB11831是小鼠胰腺癌细胞系，STUIT-2和MIAPaCa-2是人胰腺癌细胞系。

图9显示了在肺癌细胞系中VVL-DD和VVL-DD STC病毒的EEV产量。用0.01PFU/细胞的VV感染6孔板中的细胞。感染后18、24和48小时，将细胞培养基和感染的细胞收集到单独的试管中，并分别滴定病毒。通过比较从细胞培养基中回收的病毒总量与从感染细胞中回收的病毒总量，计算出产生的EEV的比例。LLC：小鼠肺癌细胞系。H460、H1299MIA和A549是人肺癌细胞系。

图10显示了在CV1细胞系中复制的VVL15 RFP和VVL15TK STC病毒。通过对感染1PFU/肿瘤细胞后24、48和72小时收集的病毒裂解物进行TCID50分析，确定以PFU/细胞为单位的病毒滴度。每个测定重复进行三次。

图11显示了VVL15 RFP和VVL15TK STC病毒之间溶解效力的比较。进行MTS测定以测量VVL15RFP和VVL15TK STC病毒对细胞系CV1、CT26和DT6606的细胞毒性效力。该图是获得自相应的病毒剂量-响应(细胞死亡百分比)曲线(未示出)的EC50值(用于杀死50％细胞的病毒剂量)的图。

图12显示在结肠癌模型中，VVL15TK STC比VVL15 RFP更有效。在具有免疫能力的Balb/C小鼠中建立了同系CT26皮下胁腹模型。当肿瘤体积达到100mm³的平均值时，IT注射1×10⁸PFU病毒的每日剂量(总共5次)或等体积溶媒缓冲液(50μl PBS)(每组n＝5-7只)。通过每周两次卡尺测量来追踪肿瘤的生长。

图13显示在胰腺癌模型中，VVL15TK STC比VVL15 RFP更有效。在具有免疫能力的C57/B16小鼠中建立了同系DT6606皮下胁腹模型。当肿瘤体积达到100mm³的平均值时，IT注射1×10⁸PFU病毒的每日剂量(总共5次)或等体积溶媒缓冲液(50μl PBS)(每组n＝5-7只)。通过每周两次卡尺测量来追踪肿瘤的生长。

图14显示了表达mIL-21或hIL-21的表达盒和N1L穿梭载体以及同源重组。被Cre重组酶切下的RFP修饰的VV TK-STC用于制备在N1L区表达细胞因子转基因的病毒。N1L穿梭载体中mIL-21或hIL-21和RFP的表达由H5启动子驱动。RFP及其启动子H5位于FRT的侧翼，因此RFP及其启动子H5可以由作用于最终的修饰病毒中的FRT的Flipase切除，从而生成修饰的、无标记病毒。

图15显示了VTK-STC hIL-21病毒中hIL-21表达的确认。在感染野生型VV(VV WT)、TK-STC VV(CTRL)、VVL12 N1L hIL-21(hHIL21)和TK STC hIL-21后3天，通过ELISA测量CV-1细胞中的hIL-21的表达。

图16显示了在TK-STC mIL-21病毒中mIL-21表达的确认。通过ELISA测量感染后指定时间DT6606细胞中mIL-21的表达。所有使用的病毒均是缺失TK和N1L基因的。病毒感染后，mIL21在细胞中表达。d＝缺失。

图17显示了在具有免疫能力的C57/B16小鼠中皮下建立的DT6606肿瘤内的VV存在。一旦可触知，将小鼠通过口服管饲CAL101(10mg/Kg)进行处理，3小时后，用1×10⁸PFU/注射的不含修饰的B5R第二拷贝的VVLΔTKΔN1L、或VVLΔTK-STCΔN1L进行静脉内注射。在第1、3和5天给予处理。最后一次处理后5天，切除肿瘤并使用qPCR分析病毒载量(n＝3只/组)。使用学生未配对T检验比较两组的病毒载量(*p>0.05)。

图18显示了在具有免疫能力的叙利亚仓鼠中腹膜内建立的SHPC6肿瘤。在肿瘤植入后第4、6和8天，用1×10⁷PFU/注射的VVLΔTKΔN1L或VVLΔTK-STCΔN1L处理仓鼠。采用对数秩(Mantel-cox)检验进行Kaplan-Meier存活分析来评估存活率(n＝10只/组)。

图19显示了在具有免疫能力的叙利亚仓鼠中腹膜内建立的SHPC6肿瘤。在肿瘤植入后第4、6和8天，用1×10⁷PFU/注射的VVLΔTK-STCΔN1L或VVLΔTK-STC-ΔN1L-hIL21处理仓鼠。采用对数秩(Mantel-cox)检验进行Kaplan-Meier存活分析来评估存活率(n＝10只/组)。

图20显示了通过Cal101(巨噬细胞瞬时抑制剂)和VV的组合对癌症进行治疗。在静脉内注射痘苗病毒、PBS、TK STC对照病毒(STC ctrl)和TK STC mIL-21(STC VV121)前3小时，通过口服管饲给药Cal 101。每周测量肿瘤大小两次。

图21显示了通过Cal101、抗PD1抗体和VV的组合对癌症进行治疗。在静脉内注射PBS、TK STC对照病毒(STC ctrl)和TK STC mIL-21(STC VV121)前3小时，通过口服管饲给药Cal 101。每周测量肿瘤大小两次。VVL-DD也被命名为VVDTK-DN1L，VVL-DD STC也被命名为VVDTK-STC-DN1L。

图22显示了在TK-STC mIL-12病毒中mIL-12表达的确认。感染TK-STC痘苗病毒(dTK-STC-dN1L)、TK-STC mIL-12(dTK-STC-dN1L-mIL-12)后3天，通过ELISA测量Suit-2细胞中mIL-12的表达。VVL-DD也被命名为VVDTK-DN1L，VVL-DD STC也被命名为VVDTK-STC-DN1L。

图23显示了在TK-STC hIL-12病毒中hIL-12表达的确认。在感染TK-STC痘苗病毒(dTK-STC-dN1L)、TK-STC hIL-12(dTK-STC-dN1L-hIL-12)后三天，通过ELISA测量mIL-12在CF Pac1细胞中的表达。VVL-DD也被命名为VVDTK-DN1L，VVL-DD STC也被命名为VVDTK-STC-DN1L。

图24显示了在具有免疫能力的C57/Bl6小鼠中皮下建立的LLC肺癌肿瘤。一旦可触知，用以下物质对小鼠进行处理：在第1、3、5、7、9、11天用PBS(通过瘤内)；或在第1、4、7天以200μg/注射的αPD-1抗体(腹膜内给药)；或者在第1、3、5天以1×10⁸PFU/注射VVLΔTK-STCΔN1L-mIL12的瘤内注射剂(然后在第7、9、11天用PBS的覆膜内注射剂)；或在第1、3、5天以1×10⁸PFU/注射VVLΔTK-STCΔN1L-mIL12的瘤内注射剂(然后在第7、9、11天用αPD-1抗体的腹膜内注射剂)。监测并显示肿瘤生长直到每组中第一只动物死亡。采用Bonferroni事后检验进行双因素ANOVA来比较每个时间点的显著性。

图25显示了在具有免疫能力的C57/Bl6小鼠中皮下建立的LLC肺癌肿瘤。一旦可触知，用以下物质对小鼠进行处理：在第1、3、5、7、9、11天用PBS(通过瘤内)；或在第1、4、7天以200μg/注射的αPD-1抗体(腹膜内给药)；或者在第1、3、5天以1×10⁸PFU/注射VVLΔTK-STCΔN1L-mIL12的瘤内注射剂(然后在第7、9、11天用PBS的覆膜内注射剂)；或在第1、3、5天以1×10⁸PFU/注射VVLΔTK-STCΔN1L-mIL12的瘤内注射剂(然后在第7、9、11天用αPD-1抗体的腹膜内注射剂)。采用对数秩(Mantel-cox)检验进行Kaplan-Meier存活分析来评估存活率(n＝10只/组)。

图26显示了在具有免疫能力的C57/Bl6小鼠中皮下建立的LLC肺癌肿瘤。一旦可触知，用以下物质对小鼠进行处理：在第1、3、5、7、9、11天用PBS(通过瘤内)；或在第1、4、7天以200μg/注射的αPD-1抗体(腹膜内给药)；或者在第1、3、5天以1×10⁸PFU/注射VVLΔTK-STCΔN1L-mIL12的瘤内注射剂(然后在第7、9、11天用PBS的覆膜内注射剂)；或在第1、3、5天以1×10⁸PFU/注射VVLΔTK-STCΔN1L-mIL12的瘤内注射剂(然后在第7、9、11天用αPD-1抗体的腹膜内注射剂)；或者在第1、3、5天以1×10⁸PFU/注射VVLΔTK-STCΔN1L-mIL12的瘤内注射剂随后在第7、9、11天用VVLΔTKΔN1L-sPD1(其表达可溶性PD1)。监测并显示肿瘤生长直到每组中第一只动物死亡。

图27显示了在具有免疫能力的C57/Bl6小鼠中皮下建立的CMT64肺癌肿瘤。一旦可触知，在第1、3、5、7、9、11天用PBS对小鼠进行瘤内处理，或在第1、3、5天以1×10⁸PFU/注射的VVLΔTK-STCΔN1L-mIL12然后在第7、9、11天用VVLΔTKΔN1L-sPD1对小鼠进行处理，或反之亦然。监测并显示肿瘤生长直到每组中第一只动物死亡。

图28显示了来自图1的构建体B5R-S-STC的核酸序列，包括由该核酸序列编码的相应氨基酸序列。构建体B5R-S-STC包含所示的结构域SP-SCR1-STALK-TM-CT-H5-RFP。(a)信号肽结构域SP由氨基酸残基1-19组成。(b)结构域SCR1由氨基酸残基20-72组成。(c)结构域STALK由氨基酸残基237-275组成。(d)跨膜结构域TM由氨基酸残基276-303组成。(e)C端结构域CT由氨基酸残基304-317组成。相对于由未修饰的B5R基因编码的天然B5R蛋白的氨基酸序列给出了构建体B5R-S-STC中氨基酸残基的编号。(f)H5启动子具有所示的核酸序列。(g)由构建体表达的红色荧光蛋白(RFP)在当存在时由所示的核酸序列编码的氨基酸残基1-225组成。结构域H5-RFP可以被单个H5启动子替换。(h)SP(aa 1-19)-SCR1(aa 20-72)-STALK(aa 237-275)-TM(aa 276-303)-CT(aa 304-317)。

图29显示了来自图1的构建体B5R-STC的核酸序列，包括由该核酸序列编码的相应氨基酸序列。如图所示，构建体B5R-STC包含结构域(H5-RFP-H5)-SP-STALK-TM-CT。可选的结构域H5-RFP-H5由构建体表达的红色荧光蛋白(RFP)(b)(当存在时)以及如编码所述红色荧光蛋白(RFP)的核酸两侧所示的2个拷贝的H5启动子(a)和(c)核酸序列组成，所述红色荧光蛋白(RFP)由所示的核酸序列编码的氨基酸残基1-225组成。结构域H5-RFP-H5可以被单个H5启动子替换。(d)信号肽结构域SP由氨基酸残基1-19组成。(e)结构域STALK由氨基酸残基237-275组成。(f)跨膜结构域TM由氨基酸残基276-303组成。(g)C端结构域CT由氨基酸残基304-317组成。相对于由未修饰的B5R基因编码的天然B5R蛋白的氨基酸序列给出了构建体B5R-STC中氨基酸残基的编号。

图30显示了来自图2和图3的构建体TK-STC的核酸序列，包括由该核酸序列编码的相应氨基酸序列。该构建体包含结构域(Loxp-H5-RFP-Lox-H5)-SP-STALK-TM-CT。结构域(Loxp-H5-RFP-Lox-H5)由两个Loxp元件(a)和(d)、H5启动子(b)和(e)以及编码由构建体表达的红色荧光蛋白(RFP)(c)(当存在时)的可选核酸序列组成，所述红色荧光蛋白(RFP)由氨基酸残基1-225组成。Loxp元件和H5启动子具有所示的核酸序列。(f)信号肽结构域SP由氨基酸残基1-19组成。(g)结构域STALK由氨基酸残基237-275组成。(h)跨膜结构域TM由氨基酸残基276-303组成。(i)C端结构域CT由氨基酸残基304-317组成。相对于由未修饰的B5R基因编码的天然B5R蛋白的氨基酸序列给出了构建体TK-STC中氨基酸残基的编号。

图31显示(a)构建体STC的核酸序列和(b)所编码的相应氨基酸序列。

材料和方法：

细胞系：所有使用的肿瘤细胞系均保存在我们的实验室中，来自ATCC或CancerResearch UK细胞系服务部门，或由合作者提供。通过STR测定对所有人类癌细胞系进行基因分型。在这项研究中使用的鼠类肿瘤细胞系包括：结直肠癌细胞系CT26来自BALB/c品系。DT6606(胰腺癌)源自C57BL/6品系转基因小鼠，其胰腺条件性K-Ras和p53基因发生突变。这由David Tuveson教授(CRUK，剑桥研究所剑桥，英国)馈赠。CV1是从美国VA的ATCC获得的非洲绿猴“正常”肾细胞系，并且被用作原代细胞系，以促进病毒的大量生产以及用于所有病毒滴定分析。

病毒：通过将分别在合成的早期/晚期和p7.5启动子的控制下的lacZ报告基因和萤火虫荧光素酶基因插入痘苗病毒Lister疫苗菌株(VV Lister)的TK区，构建VVL15(Hung,C.F.等人,Gene Ther 14,20-29(2007))-使用先前描述的体外细胞内重组技术。VVL15 TK-RFP是先前构建的(数据未发表)，其中RFP替代了TK基因。

VVL15 B5R-STC穿梭载体的构建：

使用H5-RFP正向引物(5’-AGATCTAAAAATTGAAAATAAATACAAAGGTTCTTGAGGGTTGTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATAGCTACCGGACTCAGATCCA-3’)(BgLII加下划线)和H5RFP反向引物(5’-ACGCGTCCCGGGAAGCTTTATTTATGATTATTTCTCGCTTTCAATTTAACACAACC CTCAAGAACCTTTGTATTTATTTTCAATTTTTCGCCTTAAGATACATTGATGAG-3’)(MlUI、SmaI和HindI II位点加下划线)，通过PCR从DsRed质粒(Clontech)扩增RFP。使用左臂正向引物(5’-AAGCTTAAATAAAAATGAAAACGATTTCC-3’)(HindIII位点加下划线)和右臂反向引物(5’-CCCGGGGAATTCAGATCTTTTTATTTATGAGCGTTAAAAATAGTATA-3’)(SmaI和BgLII位点加下划线)，通过PCR从WR-STC基因组(来自西班牙Rafeal Blasco)扩增SP+STC+B5R右臂。使用正向引物(5’-TATACTGCGTGTATGACCG-3’)和反向引物(5’-CCCGGGGAATTCAGATCTTTTTATTTATGAGCGTTAAAAATAGTATA-3’)(SmaI和BgLII位点加下划线)从VV Lister基因组扩增B5R左臂。按照制造商的说明，将所有PCR产物克隆到pGEMT-easy载体(Promega)中。通过测序验证正确的序列。用BgLII和SmaI限制酶使pGEMT-easy-B5R左臂线性化。用BgLII和HindIII限制酶从pGEMT-easy-H5-RFPH5中释放出H5-RFP-H5。用HindIII和SmaI限制酶从pGEMT-easy-B5R右臂释放B5R右臂。用BgLII和SmaI限制酶将pGEMT-easy-左臂线性化。将H5-RFP-H5(BgLII+HindIII)、STC+B5R右臂(HindIII+SmaI)连接到线性化的pGEMT-easy B5R左臂(BgLII+SmaI)中。通过测序验证得到的穿梭载体pGEMT-easy-B5R左臂+H5-RFP-H5+STC+B5R右臂。下文中将该穿梭载体命名为VVL15 B5R STC穿梭载体。VVL15 B5R STC穿梭载体的表达盒的图示如图1所示。

VVL15 B5R S-STC穿梭载体的构建：

B5R S-STC(信号肽/SP+SCR1+茎区+跨膜结构域+胞质尾区/STC：SP-SCR1-STC)使用B5R左臂正向引物(5’-TATACTGCGTGTATGACCG-3’)和B5R SCR1反向引物(5’-CTCGAGGAATTCAAGCTTGCATGGATTTTCGTATTTC-3’)(XhoI和HindIII位点加下划线)，通过PCR从VV lister基因组扩增左臂和SP+SCR1。使用B5R茎区正向引物(5’-AAGCTTTGTGTACGAACTAACGAAAAA-3’)(HindIII位点加下划线)和胞质尾区反向引物(5’-AGATCTTCACGGTAGCAATTTATGG-3’)(BgLII位点加下划线)，通过PCR扩增STC。使用正向引物(5’-AGATCTAAAAATTGAAAATAAATACAAAGGTTCTTGAGGGTTGTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATAGC-3’)(BgLII位点加下划线)和反向引物(5’-ACGCGTCGCCTTAAGATACATTGATGAG-3’)(M1UI位点加下划线)，通过PCR扩增H5-RFP。使用B5R右臂正向引物(5’-ACGCGTCTACCGTGAATATAAATCCGT-3’)(M1UI位点加下划线)和B5R右臂反向引物(5’-CTCGAGGGATGTATATACCATCGTCGT-3’)(XhoI位点加下划线)，通过PCR扩增B5R右臂。按照制造商的说明，将所有PCR产物克隆到pGEMT-easy载体(Promega)中。通过测序验证正确的序列。用XhoI和HindIII限制酶使pGEMT-easy-B5R左臂+SP+SCR1线性化。用HindIII和BgLII限制酶从pGEMT-easy-STC中释放出STC。用BgLII和M1UI限制酶从pGEMT-easy-H5-RFP中释放出H5-RFP。用M1UI和XhoI限制酶从pGEMT-easy-B5R右臂释放出B5R右臂。将消化的STC(HindIII+BgLII)、H5-RFP(BgLII+M1UI)和B5R右臂(M1UI+XhoI)连接到线性化的pGEMT-easy-B5R左臂+SP+SCR1(HindIII+XhoI)。通过测序验证得到的穿梭载体pGEMT-easy-B5R左臂+SP+SCR1+STC+H5-RFP+B5R右臂。下文中将该穿梭载体命名为VVL15B5R S-STC穿梭载体。VVL15 B5R S-STC穿梭载体表达盒的图示如图1所示。

TK-STC穿梭载体的构建：

先前构建了包含侧翼为LoxP位点的RFP的TK引导穿梭载体(Yuan,M等人,MolTher-Meth Clin D 2(2015))。使用正向引物(5’-TTAATTAAAAATAAAAATGAAAACGATTTCCG-3’)(PacI加下划线)和反向引物(5’-GCTAGCGAATTCAAGCTTTGAATAAACAACAGC-3’)(NheI、EcoRI和HindIII加下划线)，通过PCR扩增B5R基因的信号肽(SP)。使用正向引物(5’-AAGCTTTGTGTACGAACTAACGAAAAA-3’)(HindIII加下划线)和反向引物(5’-GCTAGCTCACGGTAGCAATTTATGGAACT-3’)(NheI加下划线)，通过PCR扩增B5R STC片段(STALK+TM+TC)。将SP片段克隆到pGEMT easy载体中，命名为pEGMT easy-SP。将STC片段克隆到pGEMT easy-SP的HindIII和NheI位点，得到pEGMT easy-SP+STC。使用PacI和NheI限制酶从pEGMT easy-SP+STC中释放出SP+STC，并克隆到包含侧翼为LoxP位点的RFP的TK引导穿梭载体的PacI和NheI位点。将得到的穿梭载体命名为TK STC穿梭载体。TK STC穿梭载体表达盒的图示如图3所示。

细胞因子N1L-mIL-12和N1L-hIL12穿梭载体的构建：

先前产生了包含侧翼为用于同源重组的FRT位点的RFP的N1L引导穿梭载体(Yuan等人,Mol Ther-Meth Clin D 2(2015))，下文中将该穿梭载体命名为N1L穿梭载体。将mIL-12和hIL-12克隆到N1L穿梭载体的PmeI和NheI位点以获得N1L-mIL-12和N1L-hIL12穿梭载体(图22)。

N1L-mIL-21和N1L-hIL21穿梭载体的构建：

将mIL-21和hIL-21克隆到N1L穿梭载体的SalI和BglII位点以获得N1L-mIL-21和N1L-hIL21穿梭载体(图14)。

Cas9介导的同源重组如前所述：

简而言之，在转染前一天将3×10⁵个CV-1细胞接种到6孔板的一个孔中。将gRNA载体(N1LgRNA用于靶向N1L区，TK gRNA用于靶向TK区)与Cas9共转染到6孔板中的CV-1细胞中。第二天，以0.01PFU/细胞的骨架病毒感染转染孔。病毒感染后2小时，将用于同源重组的穿梭载体转染到感染孔中。24小时后收获细胞，并冷冻于-80℃以进行噬斑纯化。

所需病毒的纯化：

解冻收集自Cas9介导的同源重组中的细胞裂解物，并使用1μl该裂解物感染包含生长至80％至90％汇合率的CV1细胞的6孔板的所有6个孔。这种低病毒载量将确保分离良好的PFU的出现。再过48小时后，在绿光下仔细检查每个孔，寻找那些发出红色荧光的病毒PFU。在鉴定出阳性克隆后，用细尖的永久性标记在板的下表面上标记它们的位置。从孔中吸出培养基后，小心地用20μl枪头挑取克隆。然后将枪头浸入含有250μl的5％FCS CM的冷冻管中。在进一步的冻融循环后，如前所述，将5至20μl该病毒溶液添加到含有CV1细胞的新6孔板的每个孔中。重复这个过程，直到每个PFU发出红色荧光，即所有病毒克隆都是由重组病毒引起的。通常需要6-10轮噬斑纯化才能获得一批纯的重组病毒。此时，刮取病毒裂解物并通过基于柱的系统(即来自Qiagen的Blood Mini Kit)提取病毒DNA。通过从提取的病毒DNA中对靶基因进行PCR扩增来确认病毒的纯度。它的存在表明被亲本病毒VVL污染(Wang等人,J Clin Invest 119,1604-1615(2009))。

一旦初步研究证实可能产生了表达STC的纯重组病毒，将50μl病毒裂解物加入含有CV1细胞的T175瓶中，再次在约30ml的5％FCS CM中生长至80％至90％汇合率。48小时后刮取细胞和培养基并作为“初级病毒扩增物”保存。

TK STC VACV的验证：

根据制造商的方案，使用DNeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen)提取VACV DNA。为了验证STC在TK区的插入，正向引物(5’-AAATAAAAATGAAAACGATTTCCG-3’)靶向SP-STC的SP部分，反向引物(5'-GGATGTATATACCATCGTCGT-3')靶向TK基因的右臂侧。使用正向引物(5’-TTGGCTATTAAACAGTATGGA-3’)和反向引物(5’-GGATCCCGATAACAAATG-3’)，通过PCR扩增跨A46R和A47L基因的对照DNA片段。Extensor Long PCR ReddyMix Master Mix用于所有PCR反应。通过1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。

突变型N1L VACV的验证：

用纯化的噬斑感染CV-1细胞。感染2天后收获感染的细胞。根据制造商的方案，使用DNeasy Blood&Tissue Kit提取VACV DNA。为了验证N1L基因的缺失，使用正向引物(5’-TATCTAGCA ATGGACCGT-3’)(在N1L基因内)和反向引物(5’-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3’)(在L026基因内)通过PCR来扩增跨N1L基因和L026基因的DNA片段。使用正向引物(5’-TTGGCTATTAAACAGTATGGA-3’)和反向引物(5’-GGATCCCGATAACAAATG-3’)，通过PCR来扩增跨A46R和A47L基因的对照DNA片段。Extensor Long PCR ReddyMix Master Mix用于所有PCR反应。通过1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。

使用Cre重组酶切除RFP：

将pCAG-Cre(来自Addgene)转染到6孔板的一个孔中的CV-1细胞中。用pCAG-Cre转染24小时后，用100PFU至200PFU的Cre-RFP VACV感染CV-1细胞。两天后，挑取RFP阴性噬斑，并用于感染6孔板中的CV-1细胞以纯化RFP阴性噬斑。然后挑取RFP阴性噬斑并感染CV-1细胞，每2天在荧光显微镜下观察直到看不见RFP阳性斑块。通过进行RFP基因PCR来测试Cre重组酶将RFP从病毒中切除。

使用Flp重组酶切除RFP：

将pCAG-Flpe(来自Addgene)转染到6孔板的一个孔中的CV-1细胞中。用pCAG-Flpe转染24小时后，用100PFU至200PFU的Flp-RFP VACV感染CV-1细胞。两天后，挑取RFP阴性噬斑，并用于感染6孔板中的CV-1细胞以纯化RFP阴性噬斑。然后挑取RFP阴性噬斑并感染CV-1细胞，每2天在荧光显微镜下观察直到看不见RFP阳性斑块。

VVL-DD和VVL-DD STC病毒的产生：

先前描述了没有RFP的VVL-DD病毒的产生(Yuan,M等人,Mol Ther-Meth Clin D 2(2015))。以与VVL-DD病毒相同的方式创建VVL-DD STC，但使用了TK-STC穿梭载体(图3)而非TK穿梭(Yuan,M等人,Mol Ther-Meth Clin D 2(2015))。VVL-DD STC病毒是N1L缺失并且STC插入TK区中的FRP阴性病毒。

酶联免疫吸附测定：

按照制造商的说明，通过酶联免疫吸附测定(eBioscience，英国)检测mIL-12、hIL-12、mIL-21和hIL-21的表达。

大规模病毒生产：

将上文的初级病毒扩增物快速冻融两次，并在感染36至40个包含CV1细胞的T175瓶(80％至90％汇合率)所需的体积的5％FCS CM中稀释。48小时后，刮取感染的CV1细胞，并以2,000rpm的速度反复几轮离心(4℃下)，以单个沉淀收集。在PBS中洗涤沉淀，重悬在12ml的10mM Tris-HCl(pH 9)缓冲液中，并储存于-80℃以备日后纯化。

病毒纯化：

将上文的浓缩病毒裂解物悬液冻融两次并转移至杜恩斯匀浆器(Thermofisher)中且通过60次冲程进行匀浆。然后超声处理30秒。在4℃下以2,000rpm离心5分钟后，收集上清液(含有释放的病毒颗粒)并用10mM Tris-HCl缓冲液稀释至30ml的总体积。将该溶液分为四份；每份在36ml Beckman超速离心管中在17ml的36％葡萄糖溶液上轻轻层铺，并在4℃下以13,500rpm离心80分钟。将所得细胞团在10mM Tris-HCl中重悬至共16ml，再次分成4份并小心地层铺在另外四个葡萄糖梯度上，这时的梯度分级为从靠近表面的25％w/m到每个管底部的40％。进行第二轮超速离心。这对于进一步去除颗粒状细胞碎片是必要的，这些颗粒状细胞碎片在静脉内注射至小鼠时可能是有毒的。将最终的沉淀重悬于1ml至4ml的病毒重悬缓冲液(PBS；10％甘油；138mM NaCl；pH 7.4)中。如下所述通过TCID50测定对纯化病毒的样品进行滴定。

病毒复制

根据生长速度，细胞以每孔2×10⁵至4×10⁵个细胞的数量接种于6孔板的三个孔，在含有10％FCS的培养基中，并在16至18小时后以1PFU/细胞的痘苗病毒感染。以24小时的间隔收集样品，一式三份，直到144小时。如前所述(Wang,Y等人,J.Clin.Invest.119,1604-1615(2009))，通过TCID50(50％组织培养感染剂量)检测病毒复制。

体外病毒细胞毒性的评价

根据生长速度，将细胞以每孔1×10³和1×10⁴个细胞接种在96孔板中，并在16至18小时后用病毒感染。通过MTS测定确定病毒感染后第6天的细胞存活率，如先前所述(Wang,Y.et al.,J.Clin.Invest.119,1604-1615(2009))计算EC50值(杀死50％肿瘤细胞的病毒剂量)。所有测定至少进行3次。

用于比较不同菌株VV的体内功效实验：

通过皮下注射1×10⁶至5×10⁶癌细胞，在每个治疗组10只小鼠中建立胁腹肿瘤，使该肿瘤的直径达到0.4cm至0.5cm，然后将小鼠按肿瘤大小重新分组，并在第1、3和5天或第1、2、3、4、5天接受3次50μl的1.0×10⁷PFU(裸鼠)或1×10⁸PFU(具有免疫能力的小鼠)或PBS的IT注射。每周评估肿瘤体积(体积＝(长×宽²×π)/6)两次，直到当肿瘤体积达到1.00cm³或已存在三个月时处死小鼠。4至5周雄性小鼠品系BALB/c和C57BL/6获自Harlan UK Ltd。

IT注射VVL重组体对胰腺和结直肠胁腹肿瘤模型的功效：

将2×10⁶个CT26细胞或3×10⁶个DT6606细胞皮下植入BALB/c或C57BL/6雄性小鼠的剃毛的右胁腹中。一旦肿瘤体积达到约100mm³，它们被随机分为三组，并按照表3中列出的治疗方案(方案1和2)注射剂量为1×10⁸PFU的病毒(在50μl的PBS中)或50μl的PBS溶媒缓冲液对照。通过每周两次卡尺测量来监测肿瘤体积，并每周对小鼠称重。

IV注射VVL重组体对胰腺肿瘤模型的功效：

将3×10⁶个DT6606细胞皮下植入C57BL/6雄性小鼠的剃毛的右胁腹。将DT6606细胞(3×10⁶个细胞/小鼠)皮下植入八周龄雄性C57/Bl6小鼠的右胁腹。当肿瘤可触及时，将小鼠分成治疗组。小鼠通过口服管饲接受10mg/kg CAL101或溶媒缓冲液，然后在第1、3和5天以1×10⁸PFU/注射进行病毒注射，每周测量肿瘤生长两次。将病毒重悬于PBS中，并通过尾静脉进行静脉内注射。αPD-1抗体以200μg/小鼠的终浓度重悬于PBS中，并在第3、6和8天注射。通过每周两次卡尺测量来监测肿瘤体积，并每周对小鼠称重。

腹膜内(IP)注射VVL重组体对叙利亚仓鼠中的播散性胰腺肿瘤模型的功效：

将1×10⁷个SHPC6细胞接种到叙利亚仓鼠的右下腹腔中。四天后，在第0、2、4天向每组10只仓鼠腹腔注射500μl PBS或2×10⁷PFU病毒。监测仓鼠的存活。

定量聚合酶链反应评估肿瘤病毒载量：

使用DNeasy Blood&Tissue Kit进行病毒DNA提取。使用Applied Biosystems提供的PCR系统实现对病毒基因组拷贝数的定量。对于VV定量，针对痘苗病毒晚期转录因子1(VLTF-1)基因设计了引物和探针：正向；5'-AACCATAGAAGCCAACGAATCC，反向；5'-TGAGACATACAAGGGTGGTGAAGT，探针；序列ATTTTAGAACAGAAATACCC。引物由Sigma-Aldrich提供。标准品为WT VV DNA，每个样品使用40ng DNA作为模板。通过加样的总DNA使病毒基因组拷贝数标准化。

统计分析：

除非另有说明，否则使用Graphpad Prism 5进行比较统计分析。使用未配对学生t检验进行双重条件比较。对于多于一个条件或额外的变量(例如时间)，分别进行了单因素或双因素方差分析(ANOVA)。事后检验(单因素ANOVA为Knewman-Keuls检验，双因素ANOVA为Bonferroni检验)比较了实验中的特定的成对条件。存活数据通过对数秩分析表示为Kaplan-Meier图，以描述组间差异是否是统计学显著的。

实施例1：体外VVL15、VVL15-B5R-STC和VVL15B5R S-STC VV的噬斑和彗尾形成的比较

为了产生比VVL15病毒所产生的EEV更多的病毒，创建了VVL15-B5R-STC和VVL15B5R S-STCVV。VVL15-B5R-STC病毒中的B5R-STC或VVL15 B5R S-STC中的B5R S-STC分别替换了全长B5R基因(图1)。用等量的对照病毒VVL15、VVL15-B5R-STC和VVL15 B5R S-STC VV感染6孔板中的CV-1细胞。如先前所述，感染后三天，使用结晶紫对感染的细胞进行染色。VVL15-B5R-STC和VVL15 B5R S-STC VV形成更小的噬斑和更多的彗尾，表明与VVL15相比，它们产生了更多的EEV(图2)。

实施例2：VVL15 TK-STC病毒的产生

与对照病毒VVL15相比，修饰的VVL15-B5R-STC和VVL15 B5R S-STC VV(图1)形成了更小的噬斑和更多的彗尾(图2)。为了制备与骨架病毒VVL15相比产生正常噬斑大小和更多EEV的修饰的VV，如图3所示产生了VVL TK-STC痘苗病毒，STC替换了TK基因(Stalk、TM和CT)，并且该病毒保留了B5R的完整拷贝。对于VVL TK-STC痘苗病毒的纯化，(在红色荧光灯下)目视检查最后一轮噬斑纯化证实了，感染的CV1细胞的孔内的所有斑块都表达来自STC-TK穿梭载体的RFP(图4)。使用特定的引物对通过PCR从提取自CV1裂解物的病毒DNA中扩增出STC基因和TK下游基因的一部分，以验证病毒。VVL15 RFP DNA中不存在PCR产物，但VVL15TK-STC DNA中存在PCR产物，这表明TK基因在VVL15TK-STC中缺失并且STC在TK区中。在PCR中使用针对B5R基因的SP设计的正向引物和识别B5R胞质尾区的反向引物来扩增整个B5R基因和STC。如预期的那样，全长B5R存在于VVL15 RFP和VVL15TK-STC中，而STC仅存在于VVL15TK-STC中(图4)。

实施例3：体外VVL15 TK-RFP和VVL TK-STC VV噬斑和彗尾形成的比较

VVL15 TK-STC病毒保留其完整B5R基因的拷贝，并在TK基因区中插入了额外的STC，从而使病毒TK失活以实现肿瘤选择性。为了评估VVL15 TK-STC病毒的噬斑和彗尾形成，用等量的对照病毒VVL15TK-RFP和VVL15 TK-STC感染6孔板中的CV-1细胞。如先前所述，感染后三天，将感染的细胞用结晶紫染色，并对板进行照片扫描(图5和6)。与VVL15 TK-RFP相比，VVL15 TK-STC产生正常大小的噬斑(图5)并产生更多的彗尾(图6)。

实施例4：评估重组VVL15 TK-STC中的EEV产量

为了对VVL15 TK-STC病毒及其对照病毒中所产生的EEV进行定量，使用0.01pfu/细胞的痘苗病毒来感染6孔板中的CV-1细胞。感染后48和72小时将细胞培养基和感染的细胞收集到单独的管中，并分别滴定病毒。通过比较细胞培养基中的VV总量与感染细胞产生的VV总量，计算出产生的EEV的量。与其亲本病毒VVL15 RFP相比，VVL15 TK-STC在感染后48小时产生10倍以上的EEV，在72小时时间点产生30倍以上的EEV(图7)。

实施例5：评估重组VVL-DD STC中的EEV产量

创建了重组VVL-DD和VVL-DD STC病毒。VVL-DD是TK和N1L区缺失的病毒(也被命名为VVΔTK-ΔN1L)。VVL-DD STC是TK和N1L区缺失且STC插入TK区的病毒(也被命名为VVΔTK-STC-ΔN1L)。为了对VVL-DD STC病毒及其对照病毒(VVL-DD)中产生的EEV进行定量，将0.01pfu/细胞痘苗病毒用于6孔板中的细胞。感染后48和72小时将细胞培养基和感染的细胞收集到单独的管中，并分别滴定病毒。通过比较细胞培养基中的VV总量与感染细胞产生的VV总量，计算出产生的EEV的量。与其亲本病毒VVL-DD相比，VVL-DD STC病毒在感染后的指定时间点在胰腺癌细胞(图8)和肺癌细胞(图9)中产生更多的EEV。

实施例6：体外VV复制和细胞毒性的比较

比较了VVL15 TK-STC及其亲本VVL15 RFP病毒的复制(图10)。在CT26(小鼠结肠癌细胞系)和DT6606(小鼠胰腺癌细胞系)癌细胞系中，VVL15 TK-STC比VVL15 RFP更有效地复制。

测量了CV1、CT26和DT6606细胞系中的VVL15 TK-STC和VVL15 RFP的细胞毒性(图10)。两种病毒在DT6606细胞中的细胞毒性没有显著差异。在杀死CV-1和CT26细胞方面，VVL15 TK-STC比亲本VVL 15RFP明显更有效(图11)。

实施例7：体内VV抗肿瘤效力的比较

为了测试VVL15 TK-STC病毒的抗肿瘤效力，使用CT26结肠癌CT26(图12)和DT6606胰腺癌模型(图13)的皮下模型。瘤内注射VVL15 RFP和VVL15 TK-STC病毒(图12和13)。对于CT26肿瘤模型，在第1、3和5天使用三剂2×10⁷PFU/注射的病毒。对于DT6606肿瘤模型，在指定时间点使用五剂2×10⁸PFU/注射的病毒(图13)。VVL15 TK-STC始终表现出比对照病毒VVL15 RFP改善的抗肿瘤功效。

实施例8：表达VVL15 TK-STC病毒的人IL-21(hIL-21)和小鼠IL-21(mIL-21)的产生

为了提高抗肿瘤免疫力，VVL15 TK-STC病毒装备有白细胞介素21(IL-21)、NK细胞和T细胞刺激因子。如图14所示，使用VVL15 TK-STC病毒通过RFP缺失，产生表达人IL-21(hIL-21)和小鼠IL-21(mIL-21)的病毒，hIL-21和mIL-21被克隆到N1L区(图14)。证实了病毒在感染细胞中表达hIL-21和mIL-21(图15和16)。

实施例9：与没有mIL-21的对照病毒相比，静脉内注射TK STC mIL-21病毒显示出优越的抗肿瘤能力

为了延长静脉内注射后VV的持续时间，在静脉内注射(i.v)VV前三小时递送巨噬细胞功能瞬时抑制剂Cal101。在皮下DT6606肿瘤模型中测试了TK STC mIL-21的抗肿瘤效力。与未装备的TK STC对照病毒(无mIL-21表达)相比，I.V递送TK STC mIL-21显示出改善的抗肿瘤效力(图16)。在第1、3和5天(1×10⁸PFU/注射)给予3次注射的最后一次后5天，使用qPCR确定注射后痘苗病毒DNA在肿瘤中的累积(图17)。与对照病毒相比，STC病毒积累的水平更高。测试了TK STC mIL-21在叙利亚仓鼠的腹膜播散性SHPC6胰腺癌模型中的抗肿瘤效力。与TK结构域中不存在STC的对照病毒相比，腹膜内递送TK STC N1L缺失病毒显示出改进的功效(图18)。此外，用IL-21装备TK-STC-N1L可以治愈叙利亚仓鼠的腹膜播散性胰腺癌(图19)。

实施例10：检查点抑制剂抗PD-1抗体改善TK STC mIL-21病毒的抗肿瘤作用

在一系列肿瘤类型中，抗PD-1抗体广泛用于增强抗肿瘤免疫，临床证据表明某些癌症患者的存活率显著改善。为了研究抗PD1抗体是否可以增强TK STC mIL-21的抗肿瘤效力，将抗PD1抗体与Cal101和静脉内注射VV联合使用。抗PD1抗体显著改善了TK STC mIL-21病毒的抗肿瘤效力(图21)。当Cal101和抗PD1抗体组合用于治疗肿瘤时，在治疗方案中包含TK STC mIL-21(STC VVI21)显著增强了Cal101和抗PD1抗体组合的抗肿瘤作用(图21)。

实施例11：表达人IL-12(hIL-12)和小鼠IL-12(mIL-12)的TK STC病毒的产生

为了改善抗肿瘤免疫力，VVL15 TK-STC病毒装备有白细胞介素12(IL-12)，白细胞介素12刺激适应性和固有免疫系统的大多数细胞。使用VVL15 TK-STC病毒通过RFP缺失，按照如图14所示的制造表达IL-21的VVL15 TK-STC的相同策略，创建表达人IL-12(hIL-12)和小鼠IL-12(mIL-12)的病毒，hIL-12和mIL-12被克隆到N1L区(图14)。证实了在病毒感染的细胞中表达mIL-12和hIL-12(图22和23)。

实施例12：在瘤内给药后，表达IL-12的TK STC病毒的肺癌模型中有效并增强了检查点抑制剂抗PD1抗体的抗肿瘤功效。

使用路易斯肺癌细胞(LLC)在具有免疫能力的小鼠中建立皮下肺癌模型。在第1、3、5天用STC-mIL12病毒(1×10⁸PFU/注射)对小鼠进行3次瘤内治疗。在适当的情况下，在第7、9、11天(200μg/小鼠)给药α-PD1抗体。在降低肿瘤生长速率方面，STC-mIL12病毒比单独的PBS或α-PD1抗体疗法更有效。将α-PD1抗体添加到病毒治疗中进一步增强了长期疗效(图24和25)。

实施例13依次地使用首先表达IL12的病毒然后使用表达可溶性PD1的病毒与使用表达IL12的病毒然后使用α-PD1抗体一样有效。使用表达可溶性PD1的病毒与使用α-PD1抗体一样有效(图26)。

实施例14以特定顺序给药表达不同免疫调节分子的病毒是重要的(图27)，即，表达mIL-12的病毒必须在表达可溶性PD1(sPD1)的病毒之前被递送，正如以相反方式递送它们则会失去优越的抗肿瘤作用。

序列表

<110> 玛丽女王伦敦大学

<120> 用于治疗癌症的具有修饰的B5R基因的溶瘤痘苗病毒

<130> P118869GB

<160> 69

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 95

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> forward primer

<400> 1

agatctaaaa attgaaaata aatacaaagg ttcttgaggg ttgtgttaaa ttgaaagcga 60

gaaataatca taaatagcta ccggactcag atcca 95

<210> 2

<211> 110

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> reverse primer

<400> 2

acgcgtcccg ggaagcttta tttatgatta tttctcgctt tcaatttaac acaaccctca 60

agaacctttg tatttatttt caatttttcg ccttaagata cattgatgag 110

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> forward primer

<400> 3

aagcttaaat aaaaatgaaa acgatttcc 29

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> reverse primer

<400> 4

cccggggaat tcagatcttt ttatttatga gcgttaaaaa tagtata 47

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> forward primer

<400> 5

tatactgcgt gtatgaccg 19

<210> 6

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> reverse primer

<400> 6

cccggggaat tcagatcttt ttatttatga gcgttaaaaa tagtata 47

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> forward primer

<400> 7

tatactgcgt gtatgaccg 19

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> reverse primer

<400> 8

ctcgaggaat tcaagcttgc atggattttc gtatttc 37

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> forward primer

<400> 9

aagctttgtg tacgaactaa cgaaaaa 27

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> reverse primer

<400> 10

agatcttcac ggtagcaatt tatgg 25

<210> 11

<211> 78

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> forward primer

<400> 11

agatctaaaa attgaaaata aatacaaagg ttcttgaggg ttgtgttaaa ttgaaagcga 60

gaaataatca taaatagc 78

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> reverse primer

<400> 12

acgcgtcgcc ttaagataca ttgatgag 28

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> forward primer

<400> 13

acgcgtctac cgtgaatata aatccgt 27

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> reverse primer

<400> 14

ctcgagggat gtatatacca tcgtcgt 27

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> forward primer

<400> 15

ttaattaaaa ataaaaatga aaacgatttc cg 32

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> reverse primer

<400> 16

gctagcgaat tcaagctttg aataaacaac agc 33

<210> 17

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> forward primer

<400> 17

aagctttgtg tacgaactaa cgaaaaa 27

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> reverse primer

<400> 18

gctagctcac ggtagcaatt tatggaact 29

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> forward primer

<400> 19

aaataaaaat gaaaacgatt tccg 24

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> reverse primer

<400> 20

ggatgtatat accatcgtcg t 21

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> forward primer

<400> 21

ttggctatta aacagtatgg a 21

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> reverse primer

<400> 22

ggatcccgat aacaaatg 18

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> forward primer

<400> 23

tatctagcaa tggaccgt 18

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> reverse primer

<400> 24

ccgaaggtag tagcatgga 19

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> forward primer

<400> 25

ttggctatta aacagtatgg a 21

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> reverse primer

<400> 26

ggatcccgat aacaaatg 18

<210> 27

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> signal peptide of B5R-S-STC (amino acid residues 1-19)

<400> 27

Met Lys Thr Ile Ser Val Val Thr Leu Leu Cys Val Leu Pro Ala Val

1 5 10 15

Val Tyr Ser Thr

<210> 28

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> signal peptide of B5R-S-STC

<400> 28

atgaaaacga tttccgttgt tacgttgtta tgcgtactac ctgctgttgt ttattca 57

<210> 29

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> SCR1 domain of B5R-S-STC (amino acids 20-72)

<400> 29

Thr Cys Thr Val Pro Thr Met Asn Asn Ala Lys Leu Thr Ser Thr Glu

1 5 10 15

Thr Ser Phe Asn Asp Lys Gln Lys Val Thr Phe Thr Cys Asp Gln Gly

20 25 30

Tyr His Ser Ser Asp Pro Asn Ala Val Cys Glu Thr Asp Lys Trp Lys

35 40 45

Tyr Glu Asn Pro

<210> 30

<211> 153

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> SCR1 domain of B5R-S-STC

<400> 30

acaactgtac ccactatgaa taacgctaaa ttaacgtcta ccgaaacatc gtttaatgat 60

aaacagaaag ttacatttac atgtgatcag ggatatcatt cttcggatcc aaatgctgtc 120

tgcgaaacag ataaatggaa atacgaaaat cca 153

<210> 31

<211> 39

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> STALK domain of B5R-S-STC (amino acids 237-275)

<400> 31

Cys Val Arg Thr Asn Glu Lys Phe Asp Pro Val Asp Asp Gly Pro Asp

1 5 10 15

Asp Glu Thr Asp Leu Ser Lys Leu Ser Lys Asp Val Val Gln Tyr Glu

20 25 30

Gln Glu Ile Glu Ser Leu Glu

<210> 32

<211> 117

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> STALK domain of B5R-S-STC

<400> 32

tgtgtacgaa ctaacgaaaa atttgatcca gtggatgatg gtcccgacga tgagacagat 60

ttgagcaaac tctcgaaaga cgttgtacaa tatgaacaag aaatagaatc gttagaa 117

<210> 33

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> transmembrane domain of B5R-S-STC (amino acids 276-303)

<400> 33

Ala Thr Tyr His Ile Ile Ile Val Ala Leu Thr Ile Met Gly Val Ile

1 5 10 15

Phe Leu Ile

<210> 34

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> transmembrane domain of B5R-S-STC

<400> 34

gcaacttatc atataatcat agtggcgttg acaattatgg gcgtcatatt tttaatc 57

<210> 35

<211> 23

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> C terminal domain of B5R-S-STC (amino acids 304-317)

<400> 35

Ser Val Ile Val Leu Val Cys Ser Cys Asp Lys Asn Asn Asp Gln Tyr

1 5 10 15

Lys Phe His Lys Leu Leu Pro

<210> 36

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> C terminal domain of B5R-S-STC

<400> 36

tccgttatag tattagtttg ttcctgtgac aaaaataatg accaatataa gttccataaa 60

ttgctaccgt ga 72

<210> 37

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H5 promoter of B5R-S-STC

<400> 37

aaaaattgaa aataaataca aaggttcttg agggttgtgt taaattgaaa gcgagaaata 60

atcataaata 70

<210> 38

<211> 225

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Red Fluorescent Protein (RFP) of B5R-S-STC (amino acids 1-255)

<400> 38

Met Ala Ser Ser Glu Asn Val Ile Thr Glu Phe Met Arg Phe Lys Val

1 5 10 15

Arg Met Glu Gly Thr Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu

20 25 30

Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly His Asn Thr Val Lys Leu Lys Val

35 40 45

Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln

50 55 60

Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Val Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro

65 70 75 80

Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val

85 90 95

Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Ala Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser

100 105 110

Leu Gln Asp Gly Cys Phe Ile Tyr Lys Val Lys Phe Ile Gly Val Asn

115 120 125

Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu

130 135 140

Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly Glu

145 150 155 160

Thr His Lys Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Leu Val Glu

165 170 175

Phe Lys Ser Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Tyr

180 185 190

Tyr Tyr Val Asp Ala Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr

195 200 205

Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Thr Glu Gly Arg His His Leu Phe

210 215 220

Leu

225

<210> 39

<211> 678

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> nucleic acid sequence of Red Fluorescent Protein (RFP) of

B5R-S-STC

<400> 39

atggcctcct ccgagaacgt catcaccgag ttcatgcgct tcaaggtgcg catggagggc 60

accgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc 120

cacaacaccg tgaagctgaa ggtgaccaag ggcggccccc tgcccttcgc ctgggacatc 180

ctgtcccccc agttccagta cggctccaag gtgtacgtga agcaccccgc cgacatcccc 240

gactacaaga agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag 300

gacggcggcg tggcgaccgt gacccaggac tcctccctgc aggacggctg cttcatctac 360

aaggtgaagt tcatcggcgt gaacttcccc tccgacggcc ccgtgatgca gaagaagacc 420

atgggctggg aggcctccac cgagcgcctg tacccccgcg acggcgtgct gaagggcgag 480

acccacaagg ccctgaagct gaaggacggc ggccactacc tggtggagtt caagtccatc 540

tacatggcca agaagcccgt gcagctgccc ggctactact acgtggacgc caagctggac 600

atcacctccc acaacgagga ctacaccatc gtggagcagt acgagcgcac cgagggccgc 660

caccacctgt tcctgtag 678

<210> 40

<211> 153

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> SP(aa 1-19)-SCR1(aa 20-72)-STALK(aa 237-275)-TM(aa 276-303)-

CT(aa 304-317)

<400> 40

Met Lys Thr Ile Ser Val Val Thr Leu Leu Cys Val Leu Pro Ala Val

1 5 10 15

Val Tyr Ser Thr Thr Cys Thr Val Pro Thr Met Asn Asn Ala Lys Leu

20 25 30

Thr Ser Thr Glu Thr Ser Phe Asn Asp Lys Gln Lys Val Thr Phe Thr

35 40 45

Cys Asp Gln Gly Tyr His Ser Ser Asp Pro Asn Ala Val Cys Glu Thr

50 55 60

Asp Lys Trp Lys Tyr Glu Asn Pro Cys Val Arg Thr Asn Glu Lys Phe

65 70 75 80

Asp Pro Val Asp Asp Gly Pro Asp Asp Glu Thr Asp Leu Ser Lys Leu

85 90 95

Ser Lys Asp Val Val Gln Tyr Glu Gln Glu Ile Glu Ser Leu Glu Ala

100 105 110

Thr Tyr His Ile Ile Ile Val Ala Leu Thr Ile Met Gly Val Ile Phe

115 120 125

Leu Ile Ser Val Ile Val Leu Val Cys Ser Cys Asp Lys Asn Asn Asp

130 135 140

Gln Tyr Lys Phe His Lys Leu Leu Pro

145 150

<210> 41

<211> 456

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> SP(aa 1-19)-SCR1(aa 20-72)-STALK(aa 237-275)-TM(aa 276-303)-

CT(aa 304-317)

<400> 41

atgaaaacga tttccgttgt tacgttgtta tgcgtactac ctgctgttgt ttattcaaca 60

actgtaccca ctatgaataa cgctaaatta acgtctaccg aaacatcgtt taatgataaa 120

cagaaagtta catttacatg tgatcaggga tatcattctt cggatccaaa tgctgtctgc 180

gaaacagata aatggaaata cgaaaatcca tgtgtacgaa ctaacgaaaa atttgatcca 240

gtggatgatg gtcccgacga tgagacagat ttgagcaaac tctcgaaaga cgttgtacaa 300

tatgaacaag aaatagaatc gttagaagca acttatcata taatcatagt ggcgttgaca 360

attatgggcg tcatattttt aatctccgtt atagtattag tttgttcctg tgacaaaaat 420

aatgaccaat ataagttcca taaattgcta ccgtga 456

<210> 42

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H5 promoter of B5R-STC

<400> 42

aaaaattgaa aataaataca aaggttcttg agggttgtgt taaattgaaa gcgagaaata 60

atcataaata 70

<210> 43

<211> 225

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Red Fluorescent Protein (RFP) of B5R-STC (amino acids 1-225)

<400> 43

Met Ala Ser Ser Glu Asn Val Ile Thr Glu Phe Met Arg Phe Lys Val

1 5 10 15

Arg Met Glu Gly Thr Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu

20 25 30

Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly His Asn Thr Val Lys Leu Lys Val

35 40 45

Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln

50 55 60

Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Val Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro

65 70 75 80

Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val

85 90 95

Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Ala Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser

100 105 110

Leu Gln Asp Gly Cys Phe Ile Tyr Lys Val Lys Phe Ile Gly Val Asn

115 120 125

Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu

130 135 140

Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly Glu

145 150 155 160

Thr His Lys Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Leu Val Glu

165 170 175

Phe Lys Ser Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Tyr

180 185 190

Tyr Tyr Val Asp Ala Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr

195 200 205

Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Thr Glu Gly Arg His His Leu Phe

210 215 220

Leu

225

<210> 44

<211> 678

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Red Fluorescent Protein (RFP) of B5R-STC

<400> 44