一种用作抗氧化应激损伤的二氧化锰/丝胶蛋白杂化纳米颗粒及其制备方法
阅读说明：本技术 一种用作抗氧化应激损伤的二氧化锰/丝胶蛋白杂化纳米颗粒及其制备方法 (Manganese dioxide/sericin hybrid nano-particles for resisting oxidative stress damage and preparation method thereof ) 是由 蔡玉荣 王广舒 杨晓刚 王振宇 于 2021-05-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用作抗氧化应激损伤的二氧化锰/丝胶蛋白杂化纳米颗粒及其制备方法。采用的方法是将丝胶蛋白和高锰酸钾反应以连接二氧化锰,之后在锰离子的诱导下在温和的环境中制备出二氧化锰/丝胶蛋白杂化纳米颗粒。该方法的优点在于：工艺过程简单,反应条件温和；制备的杂化纳米颗粒对一定浓度的过氧化氢具有良好的降解能力；具有良好的生物相容性和生物可降解性。有望在治疗由酒精引起的氧化应激损伤领域中得到应用。(The invention discloses manganese dioxide/sericin hybrid nanoparticles used for resisting oxidative stress damage and a preparation method thereof. The adopted method is to react sericin with potassium permanganate to connect manganese dioxide, and then manganese dioxide/sericin hybrid nanoparticles are prepared under the induction of manganese ions in a mild environment. The method has the advantages that: the process is simple, and the reaction conditions are mild; the prepared hybrid nano-particles have good degradation capability on hydrogen peroxide with a certain concentration; has good biocompatibility and biodegradability. Is expected to be applied to the field of treating oxidative stress injury caused by alcohol.)
技术领域
本发明涉及一种用作抗氧化应激损伤的二氧化锰/丝胶蛋白杂化纳米颗粒及其制备方法，属于新材料领域。
背景技术
酒精引起的肝损伤可分为直接损伤和氧化应激损伤。直接损伤是酒精的代谢物乙醛可直接引起细胞凋亡；氧化应激损伤是由活性氧的增加和抗氧化剂的丢失引起的。如果体内存在过量的活性氧，则会氧化核酸和蛋白质等生物大分子；破坏细胞膜，从而加速细胞衰老和分解；从而诱导细胞凋亡。为了减少酒精对肝细胞的损伤，一方面是减少自由基造成的伤害；二是减少活性氧的危害，减少活性氧的来源或通过药物递送系统增加过氧化物酶以降低细胞内过量的活性氧。经过多年的发展，研究者们认为通过药物传递系统是理想的治疗氧化应激损伤的方法。药物传递系统在到达病变部位后，由于氧化应激损伤组织中特殊的微环境，触发药物释放，以达到治疗疾病的目的。
然而目前能够负载药物的载体不可避免地具有工艺复杂，含有有毒的有机溶剂等问题。中国专利(CN 112641762 A)“一种八臂聚乙二醇齐墩果酸药物载体的纳米粒子及制备方法”以齐墩果酸为主体，并搭配八臂聚乙二醇和乳酸羟基乙酸共聚物作为齐墩果酸的载体，同时在载体之中加入水溶性维生素E和纯化水，将八臂聚乙二醇和乳酸羟基乙酸共聚物结合在一起，形成负载药物的载体。中国专利(CN108126199A)“一种可降解双响应智能高分子/硫化钼药物载体的制备方法”将pH敏感载药高分子聚乙二醇-聚乙烯基苯甲醛嵌段聚合物和靶向基因巯基化的转铁蛋白修饰在光热转换材料MoS2纳米点表面，然后通过席夫碱反应将抗肿瘤药物盐酸阿霉素键接在聚合物上，制备出了负载盐酸阿霉素的药物载体。中国专利(CN 108671234A)“一种多功能中空介孔纳米氧化石墨烯与四氧化三铁复合载药材料及其制备方法”FeCl3·6H2O和n GO分散到乙二醇，然后加入聚乙二醇和十六烷基三甲基溴化铵，搅拌均匀后在加入乙酸钠，在反应釜中反应后制备出Fe3O4/n GO纳米粒子。因此制备合成简单且生物相容性好的药物载体成为时下热门课题。截止目前，还未见到将丝胶蛋白和二氧化锰杂化用于制备纳米颗粒这一复合材料的相关工艺技术出现。
丝胶蛋白是一种来源广泛且生物相容性好的生物大分子，是制备药物载体的优良原材料；二氧化锰由于其优异的生物相容性，高比表面积和独特的催化性能在纳米级药物传递系统领域受到越来越多的关注。因此采用以上两种材料制备出的二氧化锰/丝胶蛋白杂化纳米颗粒具有较好的生物相容性和可降解性，由于二氧化锰对一定浓度的H2O2有良好的催化降解能力，有望在治疗由酒精引起的氧化应激损伤领域得到应用。
发明内容
为了克服目前药物载体制备过程复杂且多含有有毒的有机溶剂等问题，同时实现丝胶蛋白资源的资源化利用，以制备有效降低H2O2浓度的新材料，本发明提供一种用作抗氧化应激损伤的二氧化锰/丝胶蛋白杂化纳米颗粒及其制备方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案是采用以下步骤：
1)配置质量浓度为0.2～10％的丝胶蛋白溶液在200～400rpm的转速下搅拌2～6h，并用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，得到备用丝胶蛋白溶液；配置浓度为2～10mM的2-吗啉乙磺酸溶液和2～10mM的高锰酸钾溶液，得到备用2-吗啉乙磺酸溶液和备用高锰酸钾溶液；
2)将步骤1)得到的备用2-吗啉乙磺酸溶液和备用高锰酸钾溶液按照先后顺序加入到步骤1)得到的备用丝胶蛋白溶液中搅拌均匀，超声5min，后在pH＝7.4的PBS缓冲液中透析12-24h，得到透析后的混合溶液；
3)配置浓度为10～500mM的锰离子溶液，搅拌均匀，得到备用锰离子溶液；
4)取步骤3)得到的备用锰离子溶液加入到混合溶液中，得到反应液；
5)将步骤4)得到的反应液的pH值调至6.95～7.05，在温度为37℃，震荡速率为150～300rpm的摇床中震荡24h，得到反应后的产物溶液；
6)将步骤5)得到反应后的产物溶液在8000rpm的转速下离心10分钟，用去离子水洗涤3次，冷冻干燥机中干燥48h，得到二氧化锰/丝胶蛋白杂化纳米颗粒。
7)根据权利要求2所述的一种用作抗氧化应激损伤的二氧化锰/丝胶蛋白杂化纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述丝胶蛋白分子量分布为8～30KDa，来自于家蚕、柞蚕和/或其他野蚕丝的丝胶蛋白；所述的锰离子溶液为氯化锰、硫酸锰和醋酸锰溶液中的一种。
与背景技术相比，本发明具有的有益效果是：
将丝胶蛋白和高锰酸钾反应以连接二氧化锰，之后在锰离子的诱导下在温和的环境中制备出二氧化锰/丝胶蛋白杂化纳米颗粒。该方法的优点在于：工艺过程简单，反应条件温和；制备的杂化纳米颗粒对一定浓度的过氧化氢具有良好的降解能力；具有良好的生物相容性和生物可降解性。有望在治疗由酒精引起的氧化应激损伤领域得到应用。
附图说明
图1中的a、b和c分别是实施例1、实施例3和实施例4制备的二氧化锰/丝胶蛋白杂化纳米颗粒的场发射扫描电镜图片。
图2是不同浓度的H2O2在实施例3制备的二氧化锰/丝胶蛋白杂化纳米颗粒作用下的降解情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：
1)配置质量浓度为0.4％的丝胶蛋白(8KD)溶液100mL在400rpm的转速下搅拌4h，并用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤；配置浓度为5mM的2-吗啉乙磺酸溶液和5mM的高锰酸钾溶液；
2)将步骤1)中的2-吗啉乙磺酸溶液和高锰酸钾按照先后顺序各取10mL加入到丝胶蛋白溶液中并搅拌均匀，然后超声5min，之后在pH＝7.4的PBS缓冲液中透析12h；
3)配置浓度为10mM的锰离子溶液，搅拌均匀；
4)取步骤3)中的氯化锰溶液100mL加入到混合溶液中；
5)将步骤4)中的混合溶液的pH值调至7.00，在温度为37℃，震荡速率为200rpm的摇床中震荡24h；
6)将步骤5)中反应后的溶液在8000rpm的转速下离心10分钟，用去离子水洗涤3次，然后在冷冻干燥机中干燥48h，得到二氧化锰/丝胶蛋白杂化纳米颗粒。
由此实施例得到的是类似花瓣状的聚集体，直径在1μm到2μm不等。
实施例2：
1)配置质量浓度为0.4％的丝胶蛋白(8KD)溶液100mL在400rpm的转速下搅拌4h，并用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤；配置浓度为5mM的2-吗啉乙磺酸溶液和5mM的高锰酸钾溶液；
2)将步骤1)中的2-吗啉乙磺酸溶液和高锰酸钾按照先后顺序各取10mL加入到丝胶蛋白溶液中并搅拌均匀，然后超声5min，之后在pH＝7.4的PBS缓冲液中透析12h；
3)配置浓度为100mM的锰离子溶液，搅拌均匀；
4)取步骤3)中的硫酸锰溶液100mL加入到混合溶液中；
5)将步骤4)中的混合溶液的pH值调至7.00，在温度为37℃，震荡速率为200rpm的摇床中震荡24h；
6)将步骤5)中反应后的溶液在8000rpm的转速下离心10分钟，用去离子水洗涤3次，然后在冷冻干燥机中干燥48h，得到二氧化锰/丝胶蛋白杂化纳米颗粒。
由此实施例得到的杂化纳米颗粒呈胶囊状，长约1μm，宽约500nm，且均一性好。
实施例3：
1)配置质量浓度为10％的丝胶蛋白(20KD)溶液100mL在400rpm的转速下搅拌2h，并用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤；配置浓度为2mM的2-吗啉乙磺酸溶液和2mM的高锰酸钾溶液；
2)将步骤1)中的2-吗啉乙磺酸溶液和高锰酸钾按照先后顺序各取10mL加入到丝胶蛋白溶液中并搅拌均匀，然后超声5min，之后在pH＝7.4的PBS缓冲液中透析12h；
3)配置浓度为300mM的锰离子溶液，搅拌均匀；
4)取步骤3)中的醋酸锰溶液100mL加入到混合溶液中；
5)将步骤4)中的混合溶液的pH值调至7.05，在温度为37℃，震荡速率为300rpm的摇床中震荡24h；
6)将步骤5)中反应后的溶液在8000rpm的转速下离心10分钟，用去离子水洗涤3次，然后在冷冻干燥机中干燥48h，得到二氧化锰/丝胶蛋白杂化纳米颗粒。
由此实施例得到的杂化纳米颗粒呈球状，直径约为500nm，分散均匀且粒径分布窄。
实施例4：
1)配置质量浓度为0.2％的丝胶蛋白(30KD)溶液100mL在200rpm的转速下搅拌6h，并用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤；配置浓度为10mM的2-吗啉乙磺酸溶液和10mM的高锰酸钾溶液；
2)将步骤1)中的2-吗啉乙磺酸溶液和高锰酸钾按照先后顺序各取10mL加入到丝胶蛋白溶液中并搅拌均匀，然后超声5min，之后在pH＝7.4的PBS缓冲液中透析24h；
3)配置浓度为500mM的锰离子溶液，搅拌均匀；
4)取步骤3)中的氯化锰溶液100mL加入到混合溶液中；
5)将步骤4)中的混合溶液的pH值调至6.95，在温度为37℃，震荡速率为150rpm的摇床中震荡24h；
6)将步骤5)中反应后的溶液在8000rpm的转速下离心10分钟，用去离子水洗涤3次，然后在冷冻干燥机中干燥48h，得到二氧化锰/丝胶蛋白杂化纳米颗粒。
由此得到的杂化纳米颗粒也呈球状，但直径在100～500nm不等，且多为聚集状态。
由实施例1、实施例2得到，在丝胶蛋白的分子量(8KD)不变时，随着锰离子浓度的增大，合成的聚集体由花瓣状向颗粒状转变；由实施例2、实施例3和实施例4得到，丝胶蛋白的分子量越大，则形成的颗粒尺寸越小，但在分子量为20KD时形成的颗粒呈均匀分散的球状，且颗粒之间尺寸差别较小。
在不同浓度的H2O2中加入二氧化锰/丝胶蛋白杂化纳米颗粒，通过测定H2O2的浓度在不同时间段的变化来评价杂化纳米颗粒的降解能力。
1)电极的制备：配置1.5mg/mL的科琴黑溶液并超声4h，配置0.2％的壳聚糖乙酸溶液并搅拌均匀。将100μL科琴黑溶液、15μL壳聚糖乙酸溶液和1mg二氧化锰混合均匀后取7.5μL滴加到玻碳电极上，在4℃干燥24h；
2)标准曲线的制作：采取电化学的方法测定H2O2的CV曲线图，其中工作电极为玻碳电极，参比电极为饱和甘汞，辅助电极为铂网，然后配置一系列不同浓度的H2O2溶液，得到H2O2的标准曲线；
3)将实施例3中制备的杂化纳米颗粒用去离子水复溶为2mL，分别取1mL加入到400mL的浓度为50μM(溶液1)和100μM(溶液2)的H2O2中，并在转速为100rpm的条件下进行反应；
4)在加入颗粒后2、3、6、9、20和24h的时间点分别在溶液1和溶液2中取60mL采用电化学的方法测定H2O2的浓度。
根据H2O2的标准曲线得到的在不同时间点H2O2的浓度如附图2所示，可以看到本发明所述的杂化纳米颗粒对浓度为50μM和100μM的H2O2均有良好的降解能力。
以上列举的仅是本发明的具体实施例。本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。