具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的优选实施方案。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方案。相反，提供这些实施方案的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与本发明所属技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所用的术语只是为了描述具体的实施方案的目的，并非旨在限制本发明的范围。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

根据本发明的第一方面，本发明提供了酰基间苯三酚低聚体，包括酰基间苯三酚三聚体myrtucommulone D(1a)、callistemontrimer A(1b)、callistemontrimer B(2a)、callistemontrimer C(2b)、callistenone D(3a)和callistemontrimer D(3b)以及酰基间苯三酚二聚体偶联单萜callistrilone G(4)，其结构式如下所示：

根据本发明的第二方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含作为活性药物成分的酰基间苯三酚低聚体或其药学上可接受的前药、衍生物，以及药学上可接受的载体、佐剂和赋形剂。

在本发明的实施方案中，本发明的酰基间苯三酚低聚体可以以光学纯的形式或消旋体的形式存在。

本领域技术人员应当理解，本发明的酰基间苯三酚低聚体的药学上可接受的衍生物，例如酰基间苯三酚低聚体的盐、酯、溶剂合物或水合物也可以用于本发明的药物组合物中。

合适的药物赋形剂是本领域技术人员众所周知的。药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂，包括但不仅限于填充剂(稀释剂)、润滑剂(助流剂或抗粘着剂)、分散剂、湿润剂、粘合剂、增溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、崩解剂等。粘合剂包括糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄芪胶、纤维素及其衍生物(如微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素或羟丙甲基纤维素等)、明胶浆、糖浆、淀粉浆或聚乙烯吡咯烷酮等；填充剂包括乳糖、糖粉、糊精、淀粉及其衍生物、纤维素及其衍生物、无机钙盐(如硫酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、沉降碳酸钙等)、山梨醇或甘氨酸等；润滑剂包括微粉硅胶、硬脂酸镁、滑石粉、氢氧化铝、硼酸、氢化植物油、聚乙二醇等；崩解剂包含淀粉及其衍生物(如羧甲基淀粉钠、淀粉乙醇酸钠、预胶化淀粉、改良淀粉、羟丙基淀粉、玉米淀粉等)、聚乙烯吡咯烷酮或微晶纤维素等；湿润剂包括十二烷基硫酸钠、水或醇等；抗氧剂包括亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、二丁基苯酸等；抑菌剂包括0.5％苯酚、0.3％甲酚、0.5％三氯叔丁醇等；乳化剂包括聚山梨酯-80、没酸山梨坦、卵磷酯、豆磷脂等；增溶剂包括吐温-80、胆汁、甘油等。

本发明的酰基间苯三酚低聚体或其药学上可接受的前药、衍生物用作药物时，可以直接施用，或者以药物组合物的形式施用。在本发明的药物组合物中，按药物组合物总重量计，药物组合物可以含有0.1–99％，优选为0.5–90％的酰基间苯三酚低聚体或其衍生物。

酰基间苯三酚低聚体或其药学上可接受的前药、衍生物的治疗有效量是指在不对接受者造成明显负面或不利副作用的情况下，其针对以下施用水平或量：(1)延迟或预防靶向病理性状况或病症的发作；(2)减慢或停止靶向病理状况或病症的一种或多种症状的进展、加重或恶化；(3)减轻靶向病理状态或病症的症状；(4)改善靶向病理状况或病症的严重性或发生率；或(5)治愈靶向病理状况或病症。可以在靶向病理状况或病症发作之前施用治疗有效量，用于预防或防御作用。可替代地或另外，可以在靶向病理状况或病症开始之后施用治疗有效量的酰基间苯三酚低聚体，用于治疗作用。应当理解，有效剂量会取决于接受者的年龄、性别、健康状况和体重。通常，有效量由施用治疗的人例如治疗医师来决定。

本发明的药物组合物可以以单位体重服用量的形式施用。所有以酰基间苯三酚低聚体或其药学上可接受的前药、衍生物为有效成分的药物组合物可以采用制药和食品领域公认的方法制备成各种剂型，例如液体制剂(注射剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂等)、固体制剂(片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂等)、喷剂、气雾剂等。本发明的药物组合物可经注射(静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射)、口服、舌下给药、粘膜透析等途径给药，以治疗阿尔兹海默病及其并发症。

根据本发明的第三方面，本发明提供了酰基间苯三酚低聚体或其药学上可接受的前药、衍生物在制备用于治疗阿尔茨海默病及其并发症的药物或药物组合物或功能性食品中的应用。

根据本发明的第四方面，本发明提供了一类新的乙酰胆碱酯酶抑制剂(AChEI)，其能够有效地减轻和阻止乙酰胆碱酯酶对乙酰胆碱的分解，从而促进和维持残存的胆碱能神经元的功能，达到治疗阿尔茨海默病及其并发症的目的，该抑制剂为上述酰基间苯三酚低聚体或其衍生物。

根据本发明的第五方面，本发明提供了制备酰基间苯三酚低聚体的方法，包括以下步骤：

1)将红千层属(Callistemon R.Br.)植物材料任选地干燥并粉碎，采用有机溶剂提取后脱溶，得到红千层属植物提取物；

2)对红千层属提取物依次采用柱层析、结晶、重结晶，得到酰基间苯三酚低聚体。

在本发明的实施方案中，红千层植物是桃金娘科(Myrtaceae)、红千层属(Callistemon R.Br.)中的植物，包括但不限于垂枝红千层(C.viminalis(Soland.)Cheel.)、柳叶红千层(C.salignus)、红千层(C.rigidus)、美花红千层(C.citrinus)、飞凤红千层(C.phoeniceus)、波氏红千层(C.polandii)、多花红千层(C.speciosus)、线叶白树(C.linearifolius)、长蕊红千层(C.pearsonii)、紫光红千层(C.cv.Purple Splendour)、松叶红千层(C.pinifolius)等。在本发明的优选实施方案中，红千层植物为柳叶红千层、红千层或垂枝红千层。在进一步优选的实施方案中，红千层植物为柳叶红千层。

在本发明的具体实施方案中，红千层植物材料可以是红千层植物的枝叶、果实、种子或其混合物。对于新鲜的红千层植物材料或者其水分含量较高，例如水分含量超过15％，可以先进行干燥，然后粉碎或者研磨，从而有利于提取。干燥、粉碎或者研磨可以通过本领域常规技术手段来进行，例如自然日晒干燥、烘箱加热干燥、粉碎机粉碎、研磨粉碎。在进一步优选的实施方案中，红千层植物材料是柳叶红千层的种子。在优选的实施方案中，红千层植物的枝叶、种子是干燥的。

在本发明的实施方案中，步骤1)中所用有机溶剂可以为石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、正丁醇、乙腈和甲酸中的至少一种；优选地，所述有机溶剂为丙酮。

在本发明的实施方案中，提取可以用有机溶剂进行至少1次，例如2、3、4、5次，优选3次，并将提取液合并，每次提取可以进行约60-84小时，例如60、61、62、63、64、65、66、67、68、39、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84小时，优选70-74小时，进一步优选72小时。

在本发明的实施方案中，有机溶剂与红千层属植物材料的体积比可以为1:1到10:1，例如1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1，以及上述任意两个比例之间的比例，例如1.5:1、2.5:1、3.5:1、4.5:1、5.5:1等，优选为5:1。

在本发明的具体实施方案中，步骤2)具体包括：

在步骤2)中，柱层析包括正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、凝胶柱层析、中压色谱分离凝胶、制备或半制备高效液相色谱(HPLC)、手性HPLC；优选地，柱层析包括正相硅胶柱层析、反相RP-18柱层析、半制备高效液相色谱(HPLC)和手性HPLC。

在步骤2)中，柱层析所用洗脱剂包括石油醚、正己烷、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、正丁醇、异丙醇、乙腈、水和甲酸中的至少一种，例如两种或以上的组合，例如上述有机溶剂中任意两种的组合，任意三种的组合、任意四种的组合等；优选地，正相硅胶柱层析采用石油醚和乙酸乙酯按体积比从100:1到1:1梯度洗脱；反相RP-18柱层析采用甲醇和水按体积比从85:15到100:0梯度洗脱；凝胶柱层析采用氯仿和甲醇按体积比1:1洗脱；中压色谱分离凝胶(MCI)采用甲醇和水按体积比从5:5到9:1梯度洗脱；制备或半制备HPLC采用乙腈和水按体积比从88:12到100:0梯度洗脱；手性HPLC采用正己烷和异丙醇按体积比从99:1到92:8梯度洗脱。

在步骤2)中结晶以及重结晶采用的溶剂系统为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷中的至少一种，例如两种或以上的组合，例如上述有机溶剂中的任意一种，或者任意两种的组合、任意三种的组合、任意四种的组合等；优选，采用甲醇/丙酮(3:1,v/v)。结晶是本领域的常规技术手段，例如溶剂缓慢挥发法，将样品加热溶解后放置于4℃冰箱内缓慢挥发溶剂形成晶体。在具体实施方案中，加热的具体温度没有特别限制，只要样品能够溶解即可。

下面结合附图和实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用来限制本发明的保护范围。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换，所有这些修改和替换都落入了本发明权利要求书请求保护的范围内。

下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

下述实施例中，旋光在JASCO P-1020旋光仪上测定；高分辨质谱(HRESIMS)由Agilent 1290 UPLC/6540 Q-TOF质谱仪测定；¹H,¹³C NMR和2D NMR谱选用氘代氯仿为溶剂在Bruker Avance III-600核磁共振仪上测定；ECD在Applied Photophysics仪器上测定；化合物单晶数据在Bruker D8 Quest上测定；柱层析用正相硅胶(200–300目)及薄层层析板均为青岛海洋化工工厂产品；葡聚糖凝胶Saphadex LH-20为GE Healthcare公司产品；反相材料RP-18及RP-18薄层板为德国Merck公司产品；半制备HPLC分别在Agilent 1260或Agilent 1100色谱仪上进行，选用色谱柱分别为Angilent ZORBAX SB-C18(9.4×250mm,5.0μm)或Daicel CHIRALPAK IC(10×250mm,5.0μm)。

实施例1：酰基间苯三酚低聚体的制备方法一

本实施例提供了Myrtucommulone D(1a)、callistemontrimer A(1b)、callistemontrimer B(2a)、callistemontrimer C(2b)、callistenone D(3a)、callistemontrimer D(3b)、酰基间苯三酚二聚体偶联单萜callistrilone G(4)七种化合物的制备。

(1)将柳叶红千层的种子干燥粉碎后得到植物材料；

(2)在室温下，采用丙酮作为有机溶剂对上述植物材料进行提取，有机溶剂和植物材料的体积比为5:1，总共提取3次，每次72h，合并提取液，过滤，滤液进行减压浓缩得到膏状柳叶红千层种子的提取物；

(3)将所述植物提取物采用正相硅胶柱层析(硅胶用量与提取物的质量比为10:1)，以石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱(每个梯度3～5个柱体积)，得到六个部分即：Fr.1(石油醚：乙酸乙酯＝100:1，v/v)、Fr.2(石油醚：乙酸乙酯＝60:1，v/v)、Fr.3(石油醚：乙酸乙酯＝20:1，v/v)、Fr.4(石油醚：乙酸乙酯＝10:1，v/v)、Fr.5(石油醚：乙酸乙酯＝5:1，v/v)；Fr.6(石油醚：乙酸乙酯＝1:1，v/v)；

(4)将收集得到的Fr.5部分采用反相硅胶柱层析(Rp-18)，以甲醇/水为洗脱剂进行梯度洗脱(每个梯度3～5个柱体积)，分段收集得到八个部分：Fr.5-1(甲醇：水＝85:15，v/v)、Fr.5-2(甲醇：水＝87:13，v/v)、Fr.5-3(甲醇：水＝89:11，v/v)、Fr.5-4(甲醇：水＝91:9，v/v)和Fr.5-5(甲醇：水＝93:7，v/v)；Fr.5-6(甲醇：水＝95:5，v/v)；Fr.5-7(甲醇：水＝97:3，v/v)；Fr.5-8(甲醇：水＝100:0，v/v)；

(5)将上述步骤中收集到的Fr.5-3，通过半制备HPLC(色谱柱：Angilent ZORBAXSB-C18；流动相：乙腈-水88:12→100:0；流速：6.0mL/min)得到2a/2b和3a/3b的混合物/消旋体以及酰基间苯三酚二聚体偶联单萜G(4)；将Fr.5-4部分用甲醇-丙酮(3:1，v/v)加热充分溶解，冷却后放置在4℃冰箱进行结晶，待晶体(淡黄色晶体)形成后过滤洗涤并重复上述步骤进行重结晶，即可得到1a/1b的混合物/消旋体。

(6)1a/1b、2a/2b和3a/3b三对混合物/消旋体通过手性HPLC拆分(色谱柱：DaicelCHIRALPAK IC；流动相：正己烷-异丙醇，99:1→92:8；流速：2.5mL/min)分别得到光学纯的Myrtucommulone D(1a)、callistemontrimer A(1b)、callistemontrimer B(2a)、callistemontrimer C(2b)、callistenone D(3a)、callistemontrimer D(3b)六个酰基间苯三酚三聚体。

Myrtucommulone D(1a)和callistemontrimer A(1b)的物理常数和波谱数据：淡黄色晶体(甲醇-丙酮，3:1,v/v)；UV(CH₃OH)λ_max(logε)205(4.58),223(4.48),273(4.40),297(4.46),354(3.64)nm；1a的比旋光度1b的比旋光度 1a的电子圆二色谱ECD(MeOH,Δε)213(-9.44),233(+1.96),261(-9.84),298(+6.59),315(+3.57),333(+4.79)nm；1b的电子圆二色谱ECD(MeOH,Δε)213(+9.49),233(-1.97),261(+9.88),298(-6.62),315(-3.59),333(-4.81)nm；IR(KBr)ν_max3445,2970,1720,1660cm^-1；¹³C(CDCl₃,150MHz)和¹H(CDCl₃,600MHz)NMR数据见表1；(+)-HRESIMS m/z651.3540[M+H]⁺(计算值C₃₈H₅₁O₉,651.3533)。

CallistemontrimersB(2a)和C(2b)的物理常数和波谱数据：淡黄色胶状物；UV(CH₃OH)λ_max(logε)206(4.61),231(4.43),274(4.38),301(4.51),360(3.59)nm；2a的比旋光度2b的比旋光度2a的电子圆二色谱ECD(MeOH,Δε)262(-13.33),291(+7.58)nm；2b的电子圆二色谱ECD(MeOH,Δε)262(+13.32),291(-7.58)nm；IR(KBr)ν_max3448,2969,1718,1659cm^-1；¹³C(CDCl₃,150MHz)和¹H(CDCl₃,600MHz)NMR数据见表1；(+)-HRESIMS m/z651.3533[M+H]⁺(计算值C₃₈H₅₁O₉，651.3528)。

Callistenone D(3a)和callistemontrimer D(3b)的物理常数和波谱数据：淡黄色胶状物；UV(CH₃OH)λ_max(logε)206(4.61)，231(4.43)，274(4.38),301(4.51),360(3.59)nm；3a的比旋光度 3b的比旋光度3a的电子圆二色谱ECD(MeOH,Δε)257(-13.33),290(+7.58)nm；3b的电子圆二色谱ECD(MeOH，Δε)257(+13.32),290(-7.58)nm；IR(KBr)ν_max3448,2969,1718,1659cm^-1；¹³C(CDCl₃,150MHz)和¹H(CDCl₃,600MHz)NMR数据见表1；(+)-HRESIMSm/z 651.3533[M+H]⁺(计算值C₃₈H₅₁O₉,651.3528)。

Callistrilone G(4)的物理常数和波谱数据：无色油状物；UV(CH₃OH)λ_max(logε)206(4.39),238(4.16),280(4.38),356(3.49)nm；4的比旋光度IR(KBr)ν_max3432,2971,2864,1715,1620,1602,1473,1415,1381,1134cm^-1；¹³C(CDCl₃,150MHz)和¹H(CDCl₃，600MHz)NMR数据见表1；(+)-HRESIMSm/z581.3478[M+H]⁺(计算值C₃₅H₄₉O₇，581.3473)。

表1.CallistemontrimersA-D和callistriloneG的¹³C(150MHz)和¹H(600MHz)NMR核磁共振波谱数据(CDCl₃)。

实施例2：酰基间苯三酚低聚体的制备方法二

本实施例提供了Myrtucommulone D(1a)、callistemontrimer A(1b)、callistemontrimer B(2a)、callistemontrimer C(2b)、callistenone D(3a)、callistemontrimer D(3b)、酰基间苯三酚二聚体偶联单萜callistrilone G(4)七种化合物的制备。

(1)将柳叶红千层的枝叶干燥粉碎后得到植物材料；

(2)在室温下，采用石油醚/乙酸乙酯(1:1，v/v)作为有机溶剂对上述植物材料进行提取，有机溶剂和植物材料的体积比为5:1，共提取3次，每次60h，合并提取液，过滤，滤液进行减压浓缩得到膏状柳叶红千层枝叶的提取物；

(3)将所述植物提取物采用正相硅胶柱层析(硅胶用量与提取物的质量比为5:1)，以石油醚/丙酮为洗脱剂进行梯度洗脱(每个梯度3～5个柱体积)，得到六个部分即：Fr.1(石油醚：丙酮＝0:1，v/v)、Fr.2(石油醚：丙酮＝100:1，v/v)、Fr.3(石油醚：丙酮＝50:1，v/v)、Fr.4(石油醚：丙酮＝25:1，v/v)；Fr.5(石油醚：丙酮＝10:1，v/v)、Fr.6(石油醚：丙酮＝5:1，v/v)；

(4)将收集得到的Fr.5部分采用中压色谱分离凝胶MCI，以甲醇/水为洗脱剂进行梯度洗脱(每个梯度3～5个柱体积)，分段收集得到三个部分：Fr.5-1(甲醇：水＝5:5，v/v)、Fr.5-2(甲醇：水＝7:3，v/v)、Fr.5-3(甲醇：水＝9:1，v/v)；

(5)将上述步骤中收集到的Fr.5-2采用反相硅胶柱层析(Rp-18)，以乙腈/水为洗脱剂进行梯度洗脱(每个梯度3～5个柱体积)，分段收集得到五个部分：Fr.5-2-1(乙腈：水＝6:4，v/v)、Fr.5-2-2(乙腈：水＝7:3，v/v)、Fr.5-2-3(乙腈：水＝8:2，v/v)、Fr.5-2-4(乙腈：水＝9:1，v/v)和Fr.5-2-5(乙腈：水＝1:0，v/v)；

(6)将上述步骤中收集到的Fr.5-2-3通过半制备高效液相色谱(HPLC)，以乙腈/水为流动相，采用梯度洗脱的方法(0～30分钟，乙腈浓度从70％～100％，v/v)进行制备可得到1a/1b、2a/2b和3a/3b的混合物/消旋体以及酰基间苯三酚二聚体偶联单萜G(4)；

(7)1a/1b、2a/2b和3a/3b三对混合物/消旋体通过手性HPLC拆分(色谱柱：DaicelCHIRALPAK IC；流动相：正己烷-异丙醇，99:1→92:8；流速：2.5mL/min)分别得到光学纯的Myrtucommulone D(1a)、callistemontrimer A(1b)、callistemontrimer B(2a)、callistemontrimer C(2b)、callistenone D(3a)、callistemontrimer D(3b)六个酰基间苯三酚三聚体。

实施例3：酰基间苯三酚低聚体的制备方法三

本实施例提供了Myrtucommulone D(1a)、callistemontrimer A(1b)、callistemontrimer B(2a)、callistemontrimer C(2b)、callistenone D(3a)、callistemontrimer D(3b)、酰基间苯三酚二聚体偶联单萜callistrilone G(4)七种化合物的制备。

(1)将垂枝红千层的枝叶和果实的混合物进行干燥、粉碎，后得到植物材料；

(2)在室温下，采用甲醇作为有机溶剂对上述植物材料进行提取，有机溶剂和植物材料的体积比为10:1，总共提取3次，每次24h，合并提取液，过滤，滤液进行减压浓缩得到膏状柳叶红千层种子的提取物；

(3)将所述植物提取物采用正相硅胶柱层析(硅胶用量与提取物的质量比为5:1)，以氯仿/甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱(每个梯度3～5个柱体积)，得到五个部分即：Fr.1(氯仿：甲醇＝0:1，v/v)、Fr.2(氯仿：甲醇＝200:1，v/v)、Fr.3(氯仿：甲醇＝100:1，v/v)、Fr.4(氯仿：甲醇＝50:1，v/v)；Fr.5(氯仿：甲醇＝25:1，v/v)；

(4)将收集得到的Fr.4部分采用中压色谱分离凝胶MCI，以甲醇/水为洗脱剂进行梯度洗脱(每个梯度3～5个柱体积)，分段收集得到四个部分：Fr.4-1(甲醇：水＝4:6，v/v)、Fr.4-2(甲醇：水＝6:4，v/v)、Fr.4-3(甲醇：水＝8:2，v/v)和Fr.4-4(甲醇：水＝9:1，v/v)；

(5)将上述步骤中收集到的Fr.4-3部分采用凝胶柱层析(Sephadex LH-20)，以氯仿：甲醇(1:1，v/v)为洗脱剂，分段收集得到四个部分：Fr.4-3-1、Fr.4-3-2、Fr.4-3-3和Fr.4-3-4；

(6)将上述步骤中收集到的Fr.4-3-2通过半制备高效液相色谱(HPLC)，以乙腈/水为流动相，采用梯度洗脱的方法(0～30分钟，乙腈浓度从70％～100％，v/v)进行制备可得到酰基间苯三酚二聚体偶联单萜G(4)；

(7)将上述步骤中收集到的Fr.4-3-4部分用甲醇-丙酮(3:1，v/v)加热充分溶解，冷却后放置在4℃冰箱进行结晶，待晶体(淡黄色晶体)形成后过滤洗涤并重复上述步骤进行重结晶，即可得到1a/1b的混合物/消旋体。过滤结晶后留下的母液，通过半制备HPLC(色谱柱：Angilent ZORBAX SB-C18；流动相：乙腈-水88:12→100:0；流速：6.0mL/min)得到2a/2b和3a/3b的混合物/消旋体。1a/1b、2a/2b和3a/3b三对混合物/消旋体通过手性HPLC拆分(色谱柱：Daicel CHIRALPAK IC；流动相：正己烷-异丙醇，99:1→92:8；流速：2.5mL/min)分别得到光学纯的Myrtucommulone D(1a)、callistemontrimer A(1b)、callistemontrimerB(2a)、callistemontrimer C(2b)、callistenone D(3a)、callistemontrimer D(3b)六个酰基间苯三酚三聚体。

实施例4：酰基间苯三酚低聚体对hAChE的抑制活性

在本实施例中，验证了7种化合物(1a、1b、2a、2b、3a、3b、4)对人源乙酰胆碱酯酶(Human acetylcholinesterase，hAChE)的抑制活性。

乙酰胆碱是一种重要的神经递质，当乙酰胆碱含量降低时，会引发如老年痴呆症等神经退行性疾病。人源乙酰胆碱酯酶是水解乙酰胆碱的特异性胆碱酯酶，因此高效的hAChE抑制剂的筛选是开发治疗神经退行性疾病药物的有效途径之一。

1.实验原理

hAChE能够催化其底物类似物碘化硫代乙酰胆碱降解，生成硫代胆碱和乙酸，反应生成物与显色剂DTNB反应生成黄色物质，在405nm处有特异光吸收。如果化合物对hAChE有抑制作用，那么hAChE催化碘化硫代乙酰胆碱降解的量就会减少，相应的与DTNB反应生成的黄色化合物减少，即在405nm处的光吸收值变小，可以据此来筛选具有抑制活性的化合物。

2.试剂仪器

试剂：

实施例制备的7种化合物；Na₂HPO₄；NaH₂PO₄；人源乙酰胆碱酯酶(hAChE)、碘化硫代乙酰胆碱、DTNB、加兰他敏。

仪器：Thermo公司MultiskanFC。

3.实验方法

3.1.用磷酸盐缓冲液(每100mL磷酸盐缓冲液中含0.1MNa₂HPO₄溶液94.7mL；0.1MNaH₂PO₄溶液5.3mL，将pH调至8.0)将hAChE稀释成0.1U/mL工作液；

3.2.碘化硫代乙酰胆碱和DTNB用磷酸盐缓冲液配成6.25mM的溶液(工作液)；

3.3.测试化合物用DMSO稀释成浓度梯度。阳性对照为加兰他敏，用DMSO稀释成浓度梯度；阴性对照组(NC组)为2％DMSO溶剂对照。

3.4.反应在96孔板中进行，铺板按200μL/体系，每个样品做3个重复；

(a)测试化合物和阳性对照浓度梯度的设定(用1％DMSO稀释)：

(b)铺板：200μL/体系，每孔内DMSO的终浓度均为0.1％，每个样本做3个复孔

5.加入显色剂和底物后1小时内，每30秒钟检测一次405nm吸光值。

6.选择NC组吸光值平均值约为1时的样品吸光值，计算测试化合物吸光值平均值(测试化合物测定值-背景值)，并按照(NC-测试化合物吸光值平均值)/NC×100％来计算测试化合物的hAChE抑制率。

结果表明，所有测试化合物均对hAChE具有明显的抑制作用(表2)，IC₅₀值在1.22-16.76μM之间。进一步的分子对接实验表明，所有测试化合物均能够比较很好地进入hAChE的长条形疏水芳香性口袋，并通过氢键作用，π-π相互作用以及π-σ相互作用于氨基酸残基结合。

表2.7种测试化合物(1a、1b、2a、2b、3a、3b、4)的人源乙酰胆碱酯酶抑制活性