具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1构建gltA基因敲除打靶片段

根据NCBI上发布的肠炎沙门菌基因组序列(CP023436.1)设计引物。以pKD3质粒为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增，获得gltA基因敲除打靶片段，PCR扩增的反应体系为25μL，包括：引物P1、P2各1μL，dNTPs 2.5μL，rTaq酶0.5μL，10×buffer2.5μL，pKD3质粒1μL为模板，其余用水补足；PCR反应程序为：94℃预变性5min，35个循环(94℃45s，54℃30s，72℃90s)，72℃终延伸10min。反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收PCR产物，获得1135bp大小的条带；其中，引物P1和P2为：

P1：5’-CCGACGCAGGAAGAGTATGACGAGTTCAGAACGACAGTCACCCGCCATACGATGATCCATGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；SEQ ID NO：1；

P2：5’-TCACGGTGAACATGGAGGACGGAATGCCCATCGCTTTCAGAATGATGCCGGAGTAGAAGCATATGAATATCCTCCTTAG-3’；SEQ ID NO：2；

引物P1、P2分别由前后两部分组成，5’端加下划线的部分与待敲除基因gltA序列同源，3’端未加下划线部分与质粒pKD3氯霉素抗性基因cat两侧序列互补。

实施例2肠炎沙门菌gltA基因缺失株的构建

利用λ-Red同源重组方法对gltA基因进行敲除，具体步骤如下：将质粒pKD46转入肠炎沙门菌C50336感受态细胞，获得C50336/pKD46阳性菌株；将阳性菌株C50336/pKD46制备成感受态细胞；将实施例1扩增获得的gltA基因敲除打靶片段电转化进入C50336/pKD46感受态细胞，利用氯霉素基因cat替换gltA基因；其中电转化步骤为：将P1、P2扩增纯化的打靶片段1μL与电转化感受态细胞50μL混匀，冰浴时间为5-10min，将混合物转移至预冷的电转杯中，擦去外侧水珠，放入电转仪凹槽内，调节电转仪参数为1.8KV，脉冲25μF，电阻200Ω，电击完毕后立即将转化产物移入37℃预热的LB培养基中，37℃振摇培养1h，产物涂布含有氯霉素的营养琼脂板。经抗性筛选后利用特异性鉴定引物P3、P4进行PCR鉴定，PCR扩增的反应体系为25μL，包括：引物P3、P4各1μL，dNTPs 2.5μL，rTaq酶0.5μL，10×buffer 2.5μL，菌液培养物1μL为模板，其余用水补足；PCR反应程序为：94℃预变性5min，35个循环(94℃45s，54℃30s，72℃90s)，72℃终延伸10min。筛选得到阳性重组子C50336gltA::cat；利用阳性C50336gltA::cat菌株制备感受态细胞，电转化导入pCP20质粒，消除氯霉素抗性标记，得到二次重组菌株即为gltA基因缺失株C50336ΔgltA。利用引物P3、P4对其进行PCR鉴定，PCR扩增的反应体系为25μL，包括：引物P3、P4各1μL，dNTPs 2.5μL，rTaq酶0.5μL，10×buffer2.5μL，菌液培养物1μL为模板，其余用水补足；PCR反应程序为：94℃预变性5min，35个循环(94℃45s，54℃30s，72℃90s)，72℃终延伸10min；得到916bp大小的条带(图1)。进一步通过序列测定确认缺失菌株C50336ΔgltA(KO)构建成功。

其中，引物P3和P4为：

P3：5’-CGCTAAGGAGACCGTAAATGG-3’；SEQ ID NO：3；

P4：5’-CGTACTACCTCGCAAACTCAACAC-3’；SEQ ID NO：4。

实施例3肠炎沙门菌gltA基因回补菌株的构建

以肠炎沙门菌gltA基因为模板，利用P5、P6引物扩增gltA基因片段，PCR扩增的反应体系为25μL，包括：引物P5、P6各1μL，dNTPs 2.5μL，rTaq酶0.5μL，10×buffer2.5μL，菌液培养物1μL为模板，其余用水补足；PCR反应程序为：94℃预变性5min，35个循环(94℃45s，54℃30s，72℃90s)，72℃终延伸10min，得到1584bp大小的条带。将其克隆到pMD-19T质粒上，获得回补质粒pMD-19T-gltA。将回补质粒pMD-19T-gltA转化至C50336ΔgltA突变菌株中，构建回补菌株C50336ΔgltA/pMD-19T-gltA(RS)。利用引物P5、P6对其进行PCR鉴定(图1)，进一步通过序列测定确认回补菌株，结果表明gltA基因回补菌株C50336ΔgltA/pMD-19T-gltA(RS)构建成功。

其中，引物P5和P6为：

P5：5’-ATGATATTGACCCATTCTTTCAGG-3’；SEQ ID NO：5；

P6：5’-TTAACGCTTCAGCGCCGATTTA-3’；SEQ ID NO：6。

实施例4生长速率测定

分别将野生型菌株C50336(WT)、gltA基因缺失株(KO)和回补菌株(RS)接种于LB液体培养基中，37℃培养过夜，次日按1：50转接新鲜LB或Minimal培养基(1L培养基需MgSO₄2mmol/L、CaCl₂0.1 mmol/L、Na₂PO₄·7H₂O 12.8g、KH₂PO₄3.0 g、NaCl 0.5g、NH₄Cl 1.0g、葡萄糖4g)，37℃同步振荡培养；每隔1h吸取菌液样品，测定其吸光度OD₆₀₀，绘制生长曲线。

结果显示，在LB培养基(图2)或Minimal培养基(图3)中，37℃培养条件下，3株菌生长速度无明显差异。上述结果表明，gltA基因的缺失对肠炎沙门菌生长速率没有影响，不影响肠炎沙门菌的基础代谢。

实施例5生化特性测定

利用梅里埃(ATB)自动生化鉴定系统对野生型菌株、gltA基因缺失株和回补菌株进行生化特性分析：将待检菌株于营养琼脂上划线培养，刮取菌落重悬于无菌生理盐水，调整菌体浓度至麦氏浊度为0.5，将菌液滴于ID32E生化鉴定卡检测孔中，50μL/每孔。置于湿盒中37℃培养24h；将测试卡上机进行鉴定。

结果如表1所示，三者生化反应谱一致。表明gltA基因缺失不影响肠炎沙门菌的生化特性。

表1生化鉴定试验结果

实施例6肠炎沙门菌对环境应激抵抗力的测定

分别吸取50μL WT、KO、RS菌液，按照1：100的比例，将其加入5mL LB中，在37℃、180rpm/min培养至对数生长期，以4000rpm/min离心10min收集菌体，灭菌生理盐水洗涤3次后，用灭菌生理盐水重悬菌体，滴板计算原菌数。在酸性应激(pH＝3.5)、碱性应激(pH＝10.5)、高渗应激(2.5mol/LNaCl)、低渗应激(去离子水)和氧化应激(10mmoL/L H₂O₂)条件下按1：100的比例，将菌液添加至培养基中，在37℃、180rpm/min环境下对其进行振荡，培养60min；在热应激条件下取100μL菌液，在42℃静置培养60min，并对各个应激环境下菌落情况进行计数。对于上述操作，重复进行3次。使用Prism8.0软件进行数据分析，并对WT、KO和RS三者之间的差异进行对比。

结果发现，缺失株在热应激环境(42℃，图9)并未对gltA基因缺失株生长造成显著影响，而在酸性应激(pH＝3.5，图4)、碱性应激(pH＝10.5，图5)、高渗应激(2.5mol/LNaCl，图6)、低渗应激(去离子水，图7)和氧化应激(10mmoL/L H₂O₂，图8)处理后的耐受能力显著下降，表明GltA蛋白参与调控肠炎沙门菌对抗环境的应激。

实施例7gltA基因缺失株致病力测定

将55只BALB/C小鼠随机均分为11组，每组5只，其中1-5组为WT菌株攻毒组，6-10组为KO菌株攻毒组，11组为对照组。将37℃，180rpm/min振荡培养过夜的菌株，用等量的无菌PBS洗菌，4100rpm/min离心10min弃上清，然后进行梯度稀释，在攻毒时进行腹腔注射，每只剂量为100μL，在对照组小鼠内，注射等量的无菌PBS；并将倍比稀释后的WT和KO菌液，分别在LB固体平板上滴板计数，计算出各组小鼠的攻菌数，同时记录14d试验组小鼠存活数量，无菌摘除死亡小鼠的肝脏，在SS固体平板划线验证，并利用寇氏法计算WT、KO菌株的半数致死量(LD₅₀)。结果见表2。

表2待检菌株的LD₅₀检测

表2结果表明，利用小鼠模型测定肠炎沙门菌野生型菌株C50336和gltA基因缺失株的LD₅₀，C50336的LD₅₀为3.16×10³CFU，gltA基因缺失株在10⁹CFU攻毒剂量未见感染小鼠死亡，其LD₅₀未测出。与野生型菌株相比，gltA基因缺失株LD₅₀增加了至少10⁶倍。表明gltA基因与肠炎沙门菌毒力关系密切。

实施例8载菌量的测定

将KO菌株以1:100比例接种在5mL LB培养基中，在37℃恒温摇床中180rpm/min振荡培养过夜，次日将摇浑的菌液取出，用等量的无菌PBS重悬洗菌，进行滴板计数。将16只BALB/C小鼠随机均分为4组，每组4只。无菌PBS调整KO菌株至1×10⁴CFU/mL，200μL/只腹腔注射感染。感染时长为21d，在3d、7d、14d、21d时处死小鼠。在无菌环境下解剖小鼠取出其肝脏和脾脏，使用组织匀浆器将脏器破碎，随之十倍比梯度稀释，于LB固体平板上滴板计数，记录不同时间段的肝脏和脾脏载菌量，整理绘图。

将收集的肝脏和脾脏研磨后倍比稀释进行滴板计数，结果见图10、图11。图10、图11结果显示，细菌数量在攻毒后3d和7d处于较高水平，但在攻毒后14d细菌数量明显下降，攻毒后21d时肝脏和脾脏均彻底清除细菌。表明gltA基因缺失后显著影响肠炎沙门菌的毒力。

实施例9脾脏指数的测定

取40只BALB/C小鼠平均分为两大组，分别为KO菌株免疫组(KO)和对照组(control)，将KO菌株以1:100比例接种在5mL LB培养基中，在37℃恒温摇床中180rpm/min振荡培养过夜，次日将摇浑的菌液取出，用等量的无菌PBS重悬洗菌，进行滴板计数。无菌PBS调整KO菌株至1×10⁷CFU/mL。KO菌株免疫组按照100μL/只腹腔注射感染KO菌株，对照组接种等体积灭菌PBS。分别在免疫3d、7d、14d和21d时，各组在每个对应的时间段随机取5只，断水断粮12h后，处死小鼠称量体重；选用75％乙醇对其进行浸泡处理，时长3min，利用超净工作台，对小鼠脾脏进行称重，注意试验过程确保无菌，求解脾脏指数(脾脏指数＝(脾脏重量(g)/小鼠体重(g))×100％)。

将gltA基因缺失株免疫3d、7d、14d和21d的BALB/C小鼠进行脾脏指数测定，结果见图12。图12结果显示，各时期KO免疫组脾脏指数与对照组脾脏指数相比有差异，且在7-14d差异显著，到第21d脾脏指数有所下降。表明免疫初期gltA基因缺失株可增加小鼠脾脏质量，并显著提高了小鼠的脾脏指数，引发机体产生免疫反应。

实施例10淋巴细胞转化增殖试验

将实施例9中gltA基因缺失株免疫3d、7d、14d和21d无菌采取的脾脏放入无菌平皿中，一次性细胞滤网上研磨并过筛，制成细胞悬液，用红细胞裂解液裂解红细胞。进行细胞计数，制备1×10⁶/mL的脾细胞悬液。将制备的细胞悬液加入96孔细胞培养板中，分别设置非处理组、ConA对照组和蛋白处理组，分别向每组细胞孔中添加等体积PBS(Blank)、ConA(终浓度为2μg/mL)和沙门菌gltA基因缺失全菌裂解物上清(KO，终浓度为5μg/mL)，37℃5％CO₂下继续培养72h，利用MTT法测定淋巴细胞转化率。

分离脾脏淋巴细胞，利用淋巴细胞转化实验测定gltA基因缺失菌株免疫小鼠的细胞免疫水平，结果见图13。图13结果显示，在免疫后第3、7、14和21d，gltA基因缺失菌株免疫小鼠刺激指数不断提高，表明gltA基因缺失菌株能够刺激机体产生较高水平的细胞免疫。

实施例11免疫小鼠血清抗体水平的检测

取20只BALB/C小鼠平均分为两大组，分别为KO菌株免疫组(KO)和对照组(control)。将KO菌株以1:100比例接种在5mL LB培养基中，在37℃恒温摇床中180rpm/min振荡培养过夜，次日将摇浑的菌液取出，用等量的无菌PBS重悬洗菌，进行滴板计数。无菌PBS调整KO菌株至1×10⁷CFU/mL。KO菌株免疫组按照100μL/只腹腔注射感染KO菌株，对照组接种等体积灭菌PBS。对免疫组(gltA)和对照组(Ctrl)小鼠进行尾尖采血，在免疫第0、7、14、21、28d时，每组随机取5只。将采好的血样37℃倾斜放置1h，4℃倾斜放置过夜，次日，3000rpm离心5min取上清，于-20℃保存。将KO菌株超声的全菌蛋白作为包被抗原，通过间接ELISA方法检测小鼠血清中抗体效价，绘制小鼠血清特异性抗体水平曲线，结果见图14。

图14结果显示，在免疫后0～28d时，gltA基因缺失株免疫组小鼠抗体水平持续上升。表明gltA基因缺失株能够刺激小鼠产生良好的体液免疫应答，gltA基因缺失株具有较好的免疫原性。

实施例12gltA基因缺失株免疫保护力

将实施例11中的小鼠在免疫后第28d，对免疫组和对照组小鼠腹腔注射5倍的LD₅₀C50336(1.58×10⁴CFU)的剂量，100μL/只，观察小鼠生存状态并记录试验结果，结果见表3。

表3C50336ΔgltA对小鼠的免疫保护力

表3结果显示，在攻毒后2周内，免疫组小鼠存活率为100％；PBS对照组的存活率为0，攻毒后观察到小鼠出现精神萎靡，食欲下降等临床症状，陆续死亡。试验结果说明C50336ΔgltA能为小鼠提供较好的免疫保护。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 河北科技师范学院

<120> 肠炎沙门菌gltA基因缺失的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 81

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ccgacgcagg aagagtatga cgagttcaga acgacagtca cccgccatac gatgatccat 60

gtgtaggctg gagctgcttc g 81

<210> 2

<211> 79

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

tcacggtgaa catggaggac ggaatgccca tcgctttcag aatgatgccg gagtagaagc 60

atatgaatat cctccttag 79

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

cgctaaggag accgtaaatg g 21

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

cgtactacct cgcaaactca acac 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

atgatattga cccattcttt cagg 24

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

ttaacgcttc agcgccgatt ta 22