一种活性和立体选择性提高的烯键还原酶突变体及其编码基因以及应用
阅读说明：本技术 一种活性和立体选择性提高的烯键还原酶突变体及其编码基因以及应用 (Ethylenic bond reductase mutant with improved activity and stereoselectivity as well as encoding gene and application thereof ) 是由 林金萍 魏东芝 张宝琪 杜涵 于 2021-06-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种活性和立体选择性提高的烯键还原酶突变体及其编码基因以及应用,该烯键还原酶突变体包括以SEQ ID NO.1所示野生型的烯键还原酶OYE2p为模板,第84位氨基酸残基发生突变形成的烯键还原酶突变体Y84A,Y84V,Y84L,Y84I,Y84T,Y84C,氨基酸序列如SEQ ID NO.3～8所示。根据本发明提供的烯键还原酶的突变体可高活性、高立体选择性催化柠檬醛制备(R)-香茅醛,具有经济环保、手性选择性高的特点,为(R)-香茅醛的工业化生产提供一个潜在的生物催化剂。(The invention discloses an olefinic bond reductase mutant with improved activity and stereoselectivity, a coding gene and application thereof, wherein the olefinic bond reductase mutant comprises an olefinic bond reductase mutant Y84A, Y84V, Y84L, Y84I, Y84T and Y84C which are formed by mutating 84 th amino acid residue by using a wild type olefinic bond reductase OYE2p shown in SEQ ID NO.1 as a template, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO. 3-8. The mutant of the olefinic bond reductase provided by the invention can catalyze citral to prepare (R) -citronellal with high activity and high stereoselectivity, has the characteristics of economy, environmental protection and high chiral selectivity, and provides a potential biocatalyst for industrial production of (R) -citronellal.)
技术领域
本发明属于生物工程
技术领域
，更具体地涉及一种活性和立体选择性提高的烯键还原酶突变体及其编码基因以及应用。背景技术
(R)-香茅醛((R)-(+)-Citronellal)，化学名为(3R)-3,7-二甲基-6-辛烯醛，化学结构式如(I)，是一种重要的香料及医药中间体，其可用于食品、日用品等调香，还可作为合成L-薄荷醇和维生素E的原料。目前，(R)-香茅醛主要由天然精油分离提取获得，也可由柠檬醛经金属催化剂催化加氢制得。
利用烯键还原酶催化柠檬醛不对称还原合成(R)-香茅醛与其它方法相比具有环境友好、反应条件温和、产物立体选择性高等优点。目前已报道的能够催化柠檬醛生成(R)-香茅醛的烯键还原酶极少，且催化活力普片偏低。Stewart等人获得一株源自Pichiastipitis的烯键还原酶OYE2.6，其可以在5.75h内催化150mM E-柠檬醛生成(R)-香茅醛，产物ee值达到98％【Chemical Communications,2010,46(45):8558-8560.】；但底物E-柠檬醛需由柠檬醛(E，Z-柠檬醛的混合物)分离获得。Hauer等人通过蛋白质工程手段对源自Zymomonas mobilis的烯键还原酶NCR进行改造，最终突变株W66A对E-柠檬醛的对映体选择性由99％(S)反转为46％(R)，但对Z-柠檬醛的对映体选择性仍仅为88％(S)，因此难以满足生产(R)-香茅醛的需要。因此，开发能够高活性、高选择性催化柠檬醛生成(R)-香茅醛的烯键还原酶具有重要的工业应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种活性和立体选择性提高的烯键还原酶突变体及其编码基因以及应用，从而解决现有烯键还原酶催化合成(R)-香茅醛的技术存在立体催化活性偏低以及立体选择性不高的问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
根据本发明的第一方面，提供一种活性和立体选择性均提高的烯键还原酶突变体，包括以烯键还原酶突变体OYE2p作为模板，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，将第84位氨基酸发生如下突变后的烯键还原酶突变体：第84位的酪氨酸Y突变为丙氨酸A的烯键还原酶突变体Y84A(SEQ ID NO.3)；第84位的酪氨酸Y突变为缬氨酸V的烯键还原酶突变体Y84V(SEQ ID NO.4)；第84位的酪氨酸Y突变为亮氨酸L的烯键还原酶突变体Y84L(SEQ ID NO.5)；第84位的酪氨酸Y突变为异亮氨酸I的烯键还原酶突变体Y84I(SEQ ID NO.6)；第84位的酪氨酸Y突变为苏氨酸T的烯键还原酶突变体Y84T(SEQ IDNO.7)；第84位的酪氨酸Y突变为半胱氨酸C的烯键还原酶突变体Y84C(SEQ ID NO.8)。
本发明以实验室前期构建保藏的烯键还原酶OYE2p(来源于Saccharomycescerevisiae YJM1341，参见文献Bioresour.Bioprocess.(2018)5:9)作为模板，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，对其进行定点突变，从而得到在催化活力和立体选择性等方面显著改善的烯键还原酶突变体。
根据本发明的第二方面，提供一种如上所述的酶活及立体选择性提高的烯键还原酶突变体的编码基因，所述编码基因编码如上面所述烯键还原酶突变体所示的氨基酸序列。
特别优选的，本发明提供一种酶活和立体选择性均提高的烯键还原酶突变体Y84V，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
根据本发明的第三方面，还提供了一种包含上述酶活及立体选择性均提高的烯键还原酶突变体的编码基因的重组基因工程菌。所述宿主细胞可以为本领域的各种常规宿主细胞，作为优选，宿主细胞为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。
根据本发明的第四方面，还提供一种所述烯键还原酶突变体在催化柠檬醛制备(R)-香茅醛中的应用。
所述的应用以含有烯键还原酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养后离心获得的菌体、菌体固定化细胞、菌体超声破碎后提取的酶、固定化酶或者纯酶为催化剂，以柠檬醛为底物，以pH为7-9的缓冲液为反应介质，在20-40℃，150-300rpm条件下反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得(R)-香茅醛。
应当理解的是，本发明所述的烯键还原酶突变体可以以工程菌全细胞形式使用，也可以是未经纯化的粗酶形式使用，也可以是部分纯化的或完全纯化的酶的形式使用。还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明的烯键还原酶突变体制成固定化酶或固定化细胞形式的生物催化剂。
作为优选，底物浓度为50-200mM，葡萄糖浓度为55-220mM，烯键还原酶粗酶粉用量以酶活计量为2U/mL，葡萄糖脱氢酶粗酶粉以酶活计量为3U/mL。
作为优选，所述反应介质为pH值为8.5的PBS缓冲液，催化反应温度为30℃。
作为优选，所述的烯键还原酶粗酶粉为经冻干后的烯键还原酶突变体Y84V。
重组表达转化体所用的培养基可以是本领域可使转化体生长并产生本发明的烯键还原酶的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母膏5g/L，pH 7.0。
培养方法和培养条件没有特别要求，只要使转化体能够生长并表达烯键还原酶即可。具体包括以下步骤：
(1)平板培养：将本发明涉及的重组工程菌划线到含有筛选抗生素的LB固体平板培养基上，37℃过夜培养；
(2)种子培养：在超净台挑取步骤(1)所得平板上的单菌落，接种到含有筛选抗生素的LB液体培养基中，37℃培养8h；
(3)诱导培养：在超净台将步骤(2)所得种子培养液接种到含有筛选抗生素的LB液体培养基中，37℃培养，待菌液OD600数值达到0.6，加入终浓度为0.2mM的IPTG，20℃诱导培养12h；
(4)收集菌体：将步骤(3)所得的诱导培养所得菌液于转速为8000rpm的条件下离心10min，分离得到菌体沉淀；将所得菌体用生理盐水洗涤2次；
(5)蛋白纯化：将步骤(4)所得菌体溶解于20mM PBS缓冲液(pH7.4)中，获得细胞悬液，经超声破碎，于转速为10000rpm的条件下离心30min，分离得到上清粗酶液，经镍柱纯化后，获得完全纯化的烯键还原酶突变体，即为催化剂。
作为优选，步骤(5)所述细胞悬液浓度为50g/L。
作为优选，步骤(5)所述超声破碎功率为200-300W，超声5s，暂停5s，累计99次。
根据本发明的研究发现，该野生型烯键还原酶的第84号位点对活性及立体选择性的提高都起关键作用。其中特别优选地，根据本发明提供的烯键还原酶突变体Y84V可高活性、高立体选择性催化柠檬醛制备(R)-香茅醛，具有经济环保、手性选择性高的特点，为(R)-香茅醛的工业化生产提供一个潜在的生物催化剂。
本发明具相对现有技术的有益效果如下：
(1)本发明提供的烯键还原酶突变体Y84V能够催化高浓度柠檬醛(200mM)生成(R)-香茅醛，转化率大于95％，产物(R)-香茅醛ee值大于95％；
(2)本发明通过蛋白质工程提升烯键还原酶活性及立体选择性，在(R)-香茅醛的工业化生产中具有良好的应用前景。
附图说明
图1是野生型烯键还原酶OYE2p及其突变体Y84V的SDS-PAGE蛋白凝胶电泳图，其中，M为蛋白质标准分子量，T为全细胞组分，S为细胞破碎液上清，P为细胞破碎液沉淀，E为纯酶；
图2是野生型烯键还原酶OYE2p催化柠檬醛的反应过程曲线；
图3是烯键还原酶OYE2p突变体Y84V催化柠檬醛的反应过程曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。如为特殊说明，实施例中所用的技术手段为本领域常规操作。
具体实施例中采用的亲本烯键还原酶为本课题组前期构建的烯键还原酶OYE2p，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例1含有突变体的重组大肠杆菌的构建
为了将亲本烯键还原酶氨基酸序列中的第84位点酪氨酸(Tyr)进行定点突变，将突变位点Y84A、Y84V、Y84L、Y84I、Y84T和Y84C设计在引物上，以含有目的基因片段的重组质粒pET21a-OYE2p作为模板，通过PCR扩增出碱基序列发生突变的质粒，所用引物序列见表1。
表1：引物设计表
PCR扩增体系为(50μL)：模板DNA 1-5ng，PrimeSTAR Max Premix(2×)25μL，突变引物上游和下游各1.5μL，用灭菌蒸馏水补充至50μL。
PCR反应参数：(1)98℃预变性2分钟；(2)95℃变性10秒；(3)55℃退火5秒；(4)72℃延伸2分钟，步骤(2)-(4)循环30次；(5)72℃彻底延伸5分钟，16℃保存。
PCR产物经过1.0％琼脂糖凝胶电泳观察到目标条带后，将剩余PCR产物纯化，获得纯化的线性化质粒，取纯化后的线性化质粒50ng进行无缝克隆。
无缝克隆体系为(20μL)：线性化质粒50ng，Seamless Cloning Mix(2×)5μL，用灭菌蒸馏水补充至10μL。
无缝克隆反应置于50℃水浴反应15分钟。
取无缝克隆产物5μL热击转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，复苏后涂布于含氨苄青霉素的LB平板上培养过夜。
随后挑取5-10个克隆子至LB培养基，37℃培养8h后取菌液测序验证，以获得烯键还原酶突变体重组工程菌E.coli BL21(DE3)/pET21a-OYE2p/Y84A、E.coli BL21(DE3)/pET21a-OYE2p/Y84V、E.coli BL21(DE3)/pET21a-OYE2p/Y84L、E.coli BL21(DE3)/pET21a-OYE2p/Y84I、E.coli BL21(DE3)/pET21a-OYE2p/Y84T和E.coli BL21(DE3)/pET21a-OYE2p/Y84C，烯键还原酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.3-8所示。
实施例2野生型OYE2p及各突变体的表达与纯化
步骤1：将实施例1中所得的烯键还原酶OYE2p及突变体重组工程菌划线到含有筛选抗生素的LB固体平板培养基上，37℃过夜培养，挑取单平板上的单菌落，接种到含有筛选抗生素的LB液体培养基中，37℃培养8h。将种子培养液接种到含有筛选抗生素的200mL LB液体培养基中，37℃培养，待菌液OD600数值达到0.6，加入终浓度为0.2mM的IPTG，20℃诱导培养12h。
步骤2：采用固定化金属离子亲和的方法纯化野生型OYE2p及其6个突变体，纯化用镍柱为GE公司的HisTrapTM HP(5mL)。所得菌液于转速为8000rpm的条件下离心10min，分离得到菌体沉淀，将所得菌体溶解于20mM PBS缓冲液(pH7.4)中，获得细胞悬液，经超声破碎，于转速为10000rpm的条件下离心30min，取上清液过0.22μm水系滤膜，即分离得到粗酶液。
步骤3：镍柱经平衡缓冲液平衡后，取步骤2所得粗酶液进行上样，然后用低浓度的洗脱缓冲液去除杂蛋白，目的蛋白采用高浓度洗脱缓冲液洗脱并收集，经透析后获得纯酶。蛋白浓度采用Bradford蛋白浓度检测试剂盒进行定量。蛋白纯度经SDS-PAGE检测，检测结果如图1所示，可见野生型及突变体经纯化后均获得较为单一的蛋白条带。
实施例3野生型OYE2p及各突变体对柠檬醛的活力及立体选择性
将实施例2步骤2中所得OYE2p及各突变体表达菌株粗酶液经冷冻干燥即可制得冻干的粗酶粉。
在统一投酶量的情况下，利用野生型OYE2p及各突变体催化柠檬醛的还原，以确定对柠檬醛的活力及产物ee值。
酶催化还原反应体系包括：100mM磷酸盐缓冲液(pH8.5)、15g/L冻干的野生型OYE2p及各突变体粗酶粉、5g/L冻干的葡萄糖脱氢酶粗酶粉、20mM柠檬醛、0.2mM NAD+和100mM葡萄糖。将各物质依次加入离心管内，置于200rpm、30℃下震荡反应6h，待反应结束后加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，合并有机相用于气相检测。
结果显示，突变体Y84A、Y84V、Y84L、Y84I、Y84T和Y84C的催化活力分别较野生型提高了25.2％、40.0％、25.5％、34.5％、24.7％和33.75％。且野生型OYE2p及各突变体催化柠檬醛的产物均以(R)-香茅醛为主，其中，突变体Y84V、Y84L、Y84I和Y84T的立体选择性分别提高到98.0％、92.1％、95.5％和90.1％。
因此，本发明得到的突变体的催化性能相对于野生型烯键还原酶OYE2p具有较大提升，其中突变体Y84V具有最佳的催化活力和最高的立体选择性。
实施例4野生型OYE2p及其突变体Y84V的动力学参数
测定烯键还原酶OYE2p及其突变型对柠檬醛的动力学参数过程是在标准状况下固定NADH的浓度为0.2mM，使E-柠檬醛或Z-柠檬醛的浓度在0.01-10mM之间变化。标准检测方法如下：反应总体积为200μL，先加入2-20μg实施例2所得纯酶，10mM底物，加入100mM PBS缓冲液稀(pH 7.4)补足至196μL，在30℃下振荡保温5min后加入4μL NADH溶液(10mM)，立即置于酶标仪中测定340nm下吸光值的变化情况。为保证实验的准确性，每个样品的测定均重复三次。
结果显示，对于E-柠檬醛，野生型和Y84V突变体的kcat/Km值分别为1.78S-1/mM-1和3.05S-1/mM-1。对于Z-柠檬醛，野生型和Y84V突变体的kcat/Km值分别为0.42S-1/mM-1和0.50S-1/mM-1。
突变体Y84V对E-柠檬醛和Z-柠檬醛的催化效率(kcat/Km值)较野生型分别提高了约71％和19％，即当对该位点氨基酸残基发生突变时，突变株对E-柠檬醛和Z-柠檬醛有不同程度地提高，说明上述这个氨基酸残基对于烯键还原酶的催化活性具有重要作用。
实施例5野生型OYE2p及其突变体Y84V在催化柠檬醛生产(R)-香茅醛上的应用
将实施例2步骤2中所得OYE2p及各突变体表达菌株粗酶液经冷冻干燥即制得冻干的粗酶粉。野生型OYE2p及其突变体Y84V催化柠檬醛反应体系如下：200mM柠檬醛(溶于DMSO)、0.2mM NAD+、250mM葡萄糖、100mM磷酸盐缓冲液(pH 8.5)、0.15g冻干的OYE2p或其突变体Y84V粗酶粉和0.05g冻干的葡萄糖脱氢酶(GDH)粗酶粉，总体积为5mL。反应在25mL锥形瓶中进行，反应条件为30℃、200rpm振荡。反应过程中通过加入Na2CO3溶液调节体系pH值维持在8.5。
如图2所示，野生型OYE2p催化200mM柠檬醛10h后，转化率达到91.6％，但生成的产物(R)-香茅醛的ee值仅为87.6％。如图3所示，本发明得到的突变体Y84V在催化200mM柠檬醛10h后，转化率达到100％，且产物ee值大于95％。因此，本发明所得突变体的催化性能较野生型烯键还原酶OYE2p具有较大提升。
以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东理工大学
<120> 一种活性和立体选择性提高的烯键还原酶突变体及其编码基因以及应用
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 401
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae YJM1341
<400> 1
Met Val Pro Phe Val Lys Asp Phe Lys Pro Gln Ala Leu Gly Asp Thr
1 5 10 15
Asn Leu Phe Lys Pro Ile Lys Ile Gly Asn Asn Glu Leu Leu His Arg
20 25 30
Ala Val Ile Pro Pro Leu Thr Arg Met Arg Ala Gln His Pro Gly Asn
35 40 45
Ile Pro Asn Arg Asp Trp Ala Val Glu Tyr Tyr Ala Gln Arg Ala Gln
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Arg Pro Gly Thr Leu Ile Ile Thr Glu Gly Thr Phe Pro Ser Pro Gln
65 70 75 80
Ser Gly Gly Tyr Asp Asn Ala Pro Gly Ile Trp Ser Glu Glu Gln Ile
85 90 95
Lys Glu Trp Thr Lys Ile Phe Lys Ala Ile His Glu Lys Lys Ser Phe
100 105 110
Ala Trp Val Gln Leu Trp Val Leu Gly Trp Ala Ala Phe Pro Asp Thr
115 120 125
Leu Ala Arg Asp Gly Leu Arg Tyr Asp Ser Ala Ser Asp Asn Val Tyr
130 135 140
Met Asn Ala Glu Gln Glu Glu Lys Ala Lys Lys Ala Asn Asn Pro Gln
145 150 155 160
His Ser Ile Thr Lys Asp Glu Ile Lys Gln Tyr Val Lys Glu Tyr Val
165 170 175
Gln Ala Ala Lys Asn Ser Ile Ala Ala Gly Ala Asp Gly Val Glu Ile
180 185 190
His Ser Ala Asn Gly Tyr Leu Leu Asn Gln Phe Leu Asp Pro His Ser
195 200 205
Asn Asn Arg Thr Asp Glu Tyr Gly Gly Ser Ile Glu Asn Arg Ala Arg
210 215 220
Phe Thr Leu Glu Val Val Asp Ala Val Val Asp Ala Ile Gly Pro Glu
225 230 235 240
Lys Val Gly Leu Arg Leu Ser Pro Tyr Gly Val Phe Asn Ser Met Ser
245 250 255
Gly Gly Ala Glu Thr Gly Ile Val Ala Gln Tyr Ala Tyr Val Leu Gly
260 265 270
Glu Leu Glu Arg Arg Ala Lys Ala Gly Lys Arg Leu Ala Phe Val His
275 280 285
Leu Ile Glu Pro Arg Val Thr Asn Pro Phe Leu Thr Glu Gly Glu Gly
290 295 300
Glu Tyr Asn Gly Gly Ser Asn Glu Phe Ala Tyr Ser Ile Trp Lys Gly
305 310 315 320
Pro Ile Ile Arg Ala Gly Asn Phe Ala Leu His Pro Glu Val Val Arg
325 330 335
Glu Glu Val Lys Asp Pro Arg Thr Leu Ile Gly Tyr Gly Arg Phe Phe
340 345 350
Ile Ser Asn Pro Asp Leu Val Asp Arg Leu Glu Lys Gly Leu Pro Leu
355 360 365
Asn Lys Tyr Asp Arg Asp Thr Phe Tyr Lys Met Ser Ala Glu Gly Tyr
370 375 380
Ile Asp Tyr Pro Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Lys Leu Gly Trp Asp Lys
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Asn
<210> 2
<211> 1203
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae YJM1341
<400> 2
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ccaatcaaaa ttggtaacaa tgaacttcta caccgtgctg tcattcctcc attgactaga 120
atgagagccc aacatccagg taatattcca aacagagact gggccgttga atactacgct 180
caacgtgctc aaagaccagg aaccttgatt atcactgaag gtacctttcc ctctccacaa 240
tctgggggtt acgacaatgc tccaggtatc tggtccgaag aacaaattaa agaatggacc 300
aagattttca aggctattca tgagaagaaa tcgttcgcat gggtccaatt atgggttcta 360
ggttgggctg ctttcccaga cacccttgct agggatggtt tgcgttacga ctccgcttct 420
gacaacgtgt atatgaatgc agaacaagaa gaaaaggcta agaaggctaa caacccacaa 480
cacagtataa caaaggatga aattaagcaa tacgtcaaag aatacgtcca agctgccaaa 540
aactccattg ctgctggtgc cgatggtgtt gaaatccaca gcgctaacgg ttacttgttg 600
aaccagttct tggacccaca ctccaataac agaaccgatg agtatggtgg atccatcgaa 660
aacagagccc gtttcacctt ggaagtggtt gatgcagttg tcgatgctat tggccctgaa 720
aaagtcggtt tgagattgtc tccatatggt gtcttcaaca gtatgtctgg tggtgctgaa 780
accggtattg ttgctcaata tgcttatgtc ttaggtgaac tagaaagaag agctaaagct 840
ggcaagcgtt tggctttcgt ccatctaatt gaacctcgtg tcaccaaccc atttttaact 900
gaaggtgaag gtgaatacaa tggaggtagc aacgaatttg cttattctat ctggaagggc 960
ccaattatta gagctggtaa ctttgctctg cacccagaag ttgtcagaga agaggtgaag 1020
gatcctagaa cattgatcgg ttacggtaga ttttttatct ctaatccaga tttggttgat 1080
cgtttggaaa aagggttacc attaaacaaa tatgacagag acactttcta caaaatgtca 1140
gctgagggat acattgacta ccctacgtac gaagaagctc taaaactcgg ttgggacaaa 1200
aat 1203
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<211> 401
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
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115 120 125
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130 135 140
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His Ser Ile Thr Lys Asp Glu Ile Lys Gln Tyr Val Lys Glu Tyr Val
165 170 175
Gln Ala Ala Lys Asn Ser Ile Ala Ala Gly Ala Asp Gly Val Glu Ile
180 185 190
His Ser Ala Asn Gly Tyr Leu Leu Asn Gln Phe Leu Asp Pro His Ser
195 200 205
Asn Asn Arg Thr Asp Glu Tyr Gly Gly Ser Ile Glu Asn Arg Ala Arg
210 215 220
Phe Thr Leu Glu Val Val Asp Ala Val Val Asp Ala Ile Gly Pro Glu
225 230 235 240
Lys Val Gly Leu Arg Leu Ser Pro Tyr Gly Val Phe Asn Ser Met Ser
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260 265 270
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275 280 285
Leu Ile Glu Pro Arg Val Thr Asn Pro Phe Leu Thr Glu Gly Glu Gly
290 295 300
Glu Tyr Asn Gly Gly Ser Asn Glu Phe Ala Tyr Ser Ile Trp Lys Gly
305 310 315 320
Pro Ile Ile Arg Ala Gly Asn Phe Ala Leu His Pro Glu Val Val Arg
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Asn Ala Glu Gln Glu Glu Lys Ala Lys Lys Ala Asn Asn Pro Gln His
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Ser Ile Thr Lys Asp Glu Ile Lys Gln Tyr Val Lys Glu Tyr Val Gln
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Ala Ala Lys Asn Ser Ile Ala Ala Gly Ala Asp Gly Val Glu Ile His
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Ser Ala Asn Gly Tyr Leu Leu Asn Gln Phe Leu Asp Pro His Ser Asn
195 200 205
Asn Arg Thr Asp Glu Tyr Gly Gly Ser Ile Glu Asn Arg Ala Arg Phe
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Thr Leu Glu Val Val Asp Ala Val Val Asp Ala Ile Gly Pro Glu Lys
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Val Gly Leu Arg Leu Ser Pro Tyr Gly Val Phe Asn Ser Met Ser Gly
245 250 255
Gly Ala Glu Thr Gly Ile Val Ala Gln Tyr Ala Tyr Val Leu Gly Glu
260 265 270
Leu Glu Arg Arg Ala Lys Ala Gly Lys Arg Leu Ala Phe Val His Leu
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atgagagccc aacatccagg taatattcca aacagagact gggccgttga atactacgct 180
caacgtgctc aaagaccagg aaccttgatt atcactgaag gtacctttcc ctctccacaa 240
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ggttgggctg ctttcccaga cacccttgct agggatggtt tgcgttacga ctccgcttct 420
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aat 1203
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cctctccaca atctgggggt tgtgacaatg ctccaggtat ctg 43
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