一种电子传递介体强化拜氏梭菌发酵制备氢气和丁醇的阴极电发酵方法
阅读说明：本技术 一种电子传递介体强化拜氏梭菌发酵制备氢气和丁醇的阴极电发酵方法 (Cathode electric fermentation method for preparing hydrogen and butanol by using electron transfer mediator to strengthen fermentation of clostridium beijerinckii ) 是由 李建政 张亚非 孟佳 王鑫 于 2020-06-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种电子传递介体强化拜氏梭菌发酵制备氢气和丁醇的阴极电发酵方法,属于微生物发酵生产清洁能源技术领域。本发明解决了现有拜氏梭菌在丁醇发酵过程中,丁醇产量、产率低,产酸相向产溶剂相转变失败、溶剂中丙酮占比较高的问题。本发明在阴极电发酵系统中以拜氏梭菌发酵制备丁醇,通过引入电极和外源电子传递介体中性红(NR)的添加,可以控制和优化发酵环境,改变细胞原有的NAD~+/NADH的平衡,显著优化微生物代谢中不同途径的分流,诱导微生物代谢路径中更多的碳和电子流向丁醇合成路径,提高生物丁醇的产量和产率,同时产生更多的氢气。(The invention discloses a cathode electric fermentation method for preparing hydrogen and butanol by strengthening fermentation of clostridium beijerinckii by an electron transfer mediator, belonging to the technical field of producing clean energy by microbial fermentation. The invention solves the problems that the prior clostridium beijerinckii has low butanol yield and productivity, failed phase transformation from an acid-producing phase to a solvent-producing phase and higher acetone ratio in the solvent in the butanol fermentation process. The invention prepares butanol by fermentation of clostridium beijerinckii in a cathode electric fermentation system, can control and optimize the fermentation environment by introducing electrodes and adding Neutral Red (NR) of an exogenous electron transfer mediator, and changes the original NAD of cells + NADH balance, significantly optimizing different pathways in microbial metabolismShunting, inducing more carbon and electrons in the microbial metabolic pathway to flow to a butanol synthesis pathway, improving the yield and productivity of biological butanol, and simultaneously generating more hydrogen.)
技术领域
本发明涉及一种电子传递介体强化拜氏梭菌发酵制备氢气和丁醇的阴极电发酵方法，属于微生物发酵生产清洁能源技术领域。
背景技术
可再生的生物质，储量巨大，通过不同途径可转化为多种高效能源，如生物乙醇、生物柴油、生物丁醇和沼气等，在应对全球气候变化、能源供需矛盾、保护生态环境等方面具有重要作用。在国家能源战略的推动下，生物乙醇已得到推广应用。与乙醇相比，生物丁醇具有能量高、可混合性好、挥发性低和腐蚀性小等优点，是一种极具潜力的新型生物燃料。且丁醇的能量密度高，具有较低的饱和蒸气压，热值与汽油接近，可以作为燃料添加到其中，甚至完全代替汽油使用。现有丁醇的生产方法主要有合成法和发酵法，近年来随着是有价格的攀升和环境问题的日益严峻，采用廉价的可再生生物质(植物秸秆、农业残余物、农副产品废料等纤维素质原料)为发酵底物生产丁醇。但微生物发酵法制备丁醇由于受限于产量和产率低、相转变调控困难，导致其工业应用进程缓慢。因此，提供一种提高丁醇产量、产率，增加溶剂中丁醇占比，并提高发酵过程中生成氢气的方法是十分必要的。
发明内容
本发明为了解决现有拜氏梭菌在丁醇发酵过程中，丁醇产量、产率低，产酸相向产溶剂相转变失败、溶剂中丙酮占比较高的问题，提供一种电子传递介体强化拜氏梭菌发酵制备氢气和丁醇的阴极电发酵方法。
本发明的技术方案：
一种电子传递介体强化拜氏梭菌发酵制备氢气和丁醇的阴极电发酵方法，该方法包括以下步骤：
(1)将厌氧发酵培养基加入双室H型反应器的阴极室，然后将拜氏梭菌种子液接种至添加了发酵底物和电子传递介体的厌氧发酵培养基中，在37℃下，在120r/min的转速下搅拌培养；
(2)在步骤(1)开始培养的同时，将双室H型反应器的三个电极与恒电位连接，并启动双室H型反应器；
(3)每间隔24h从阴极室取样，测定发酵液悬浊液生物量、pH值和液相产物组分，直至发酵液悬浊液中液相产物组分不再继续变化，发酵过程结束。
进一步地，厌氧发酵培养基的配置过程为：将酵母粉、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、FeSO4·7H2O、NaCl、对氨基苯甲酸、硫胺素和生物素混合后通入氮气曝气除氧，然后在121℃下灭菌处理20min，获得厌氧发酵培养基。
更进一步地，1L所述的厌氧发酵培养基中酵母粉3g，K2HPO4 0.5g，KH2PO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O 0.01g，FeSO4·7H2O 0.01g，NaCl 0.01g，对氨基苯甲酸0.001g，硫胺素0.001g，生物素0.0001g。
进一步地，发酵底物为葡萄糖，1L厌氧发酵培养基中添加发酵底物的质量为20g。
进一步地，电子传递介体为中性红，1L厌氧发酵培养基中添加电子传递介体的物质的量为0.5mmol。
进一步地，拜氏梭菌种子液按照体积比为5％的量接种至添加了发酵底物和电子传递介体的厌氧发酵培养基中。
进一步地，双室H型反应器施加的恒电位为-0.75V。
进一步地，双室H型反应器以钛丝固定石墨毡作为阴极和阳极，Ag/AgCl电极为参比电极；阳极室中加载与阴极室加载物等体积的K4(Fe(CN)6)溶液作为电子供体。
进一步地，K4(Fe(CN)6)溶液浓度为200mmol/L。
进一步地，拜氏梭菌种子液购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC。
本发明具有以下有益效果：本发明在阴极电发酵系统中以拜氏梭菌发酵制备丁醇，通过引入电极和中性红(NR)的添加，可以控制和优化发酵环境，改变细胞原有的NAD+/NADH的平衡，影响微生物的发酵过程，以获得具有更高纯度的产品，并利于微生物细胞的生长和生物量积累实现碳链的延长，实现可持续的丁醇制备。该方法具有如下优点：
(1)阴极电发酵本身的能耗较低，仅需极小的电流刺激或电势施加即可起到显著的效果，可通过外加电势调控生物系统和胞内氧化还原水平，控制发酵微生物的代谢平衡，增加ATP和细胞物质合成，调整代谢通路，提高目标产物的产量和产率。
(2)本发明通过添加外源电子传递介体，一方面可以通过与细胞膜的直接接触来改变细胞的代谢产物的生成，另一方面能够介导发酵微生物与电极之间的电子传递，实现发酵过程中还原力的调控，继而诱导微生物代谢路径中更多的碳和电子流向丁醇合成路径，提高生物丁醇的产量和产率，同时产生更多的氢气。
(3)本发明的发酵系统通过一定电势的施加，并将外部电流引入到发酵体系中，能够显著优化微生物代谢中不同途径的分流，改善发酵产物的组成，有利于还原性产物的合成。最终表现为：以葡萄糖为单一底物的发酵中，该系统产生的丙酮(非目标产物)降低，使得丁醇在溶剂中的百分比提高，进而大幅提升了底物(葡萄糖)利用率、丁醇产量和丁醇产率。
附图说明
图1为本发明的双室H型反应器的结构示意图；
图2为实施例1的发酵指标变化；
图3为对比例1的发酵指标变化。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
实施例1：
在添加外源电子传递介体的阴极电发酵系统(CEF+NR)内进行厌氧混合菌群发酵秸秆产丁酸过程。具体操作过程如下：
(1)以有效容积为100mL双室H型反应器为发酵反应器，其中发酵在阴极室进行，阳极室内盛有等体积的200mmol/L的亚铁氰化钾，作为电发酵系统中的电子供体。以直径为3mm的钛丝固定等体积的石墨毡作阴极和阳极，固定于钛丝上的阴极和阳极穿过极室顶部的橡胶塞完成固定。阳极参比电极为Ag/AgCl(196mV vs SHE)，通过阴极室侧边取样口将其固定并将电极前端置于发酵液面下2cm左右深度，如图1所示。
(2)将配置好的添加了发酵底物和电子传递介体的厌氧发酵培养基加入阴极室，然后按照5％(v/v)的比例将拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii NCIMB 8052)(购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC)接种至新鲜的厌氧发酵培养基中，置于37℃、120r/min的转速下培养。
厌氧发酵培养基中包含3g/L酵母粉，0.5g/L K2HPO4，0.5g/L KH2PO4，0.2g/LMgSO4·7H2O，0.01g/L MnSO4·H2O，0.01g/L FeSO4·7H2O，0.01g/L NaCl，0.001g/L对氨基苯甲酸，0.001g/L硫胺素和0.0001g/L生物素。
1L厌氧发酵培养基中添加发酵底物葡萄糖20g。1L厌氧发酵培养基中添加电子传递介体中性红的物质的量为0.5mmol。
添加了发酵底物和电子传递介体的厌氧发酵培养基配置过程为：将酵母粉、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、FeSO4·7H2O、NaCl、对氨基苯甲酸、硫胺素和生物素混合后通入氮气曝气除氧，然后在121℃下灭菌处理20min，然后冷却至常温的培养基在无菌操作台中投加葡萄糖作为发酵底物，投加NR作为电子传递介体，使用注射器加入NR浓缩液使阴极室内发酵液的NR浓度在0.5mmol左右。
(3)在步骤(2)开始培养的同时，将双室H型反应器的三个电极与恒电位连接，设置工作电极的施加电势为-0.75V(vs Ag/AgCl)后，启动双室H型反应器。
(4)电发酵期间，每24h从系统中取样，测定关键发酵指标，结果如图2所示。
(5)整个发酵过程持续5天后，发酵液中的液相产物组分不再继续变化，发酵结束。
对比例1：
在无施加电势的系统(OC)内进行厌氧混合菌群发酵秸秆产丁酸过程。OC组不额外添加中性红，且无恒电位施加，阴极和阳极之间没有导线连接，其余操作与实施例1相同，关键发酵指标的测试结果如图3所示。
对比实施例1和对比例1的关键发酵指标测试结果，即对比图2和图3可知，OC系统在发酵结束后，仅消耗7.34g/L葡萄糖消耗，累积得到的生物量(OD600)为2.23，同时伴有0.82g/L的丁醇和0.53g/L的丙酮生成及0.59g/L和0.81g/L的乙酸和丁酸生成。此外，OC组发酵结束后得到了0.88L/L的氢气生成。可以看出，在OC组发酵结束时，消耗的葡萄糖除合成生物量之外，仅有小部分用于溶剂和挥发酸的生成。
而在CEF+NR系统中，发酵结束后消耗的葡萄糖量达到18.09g/L，而累积得到的生物量仅为1.73。发酵产生了5.49g/L的丁醇和1.17g/L的丙酮，及1.1g/L的乙酸和1.48g/L的丁酸。同时，还伴随着3.74L/L的氢气生成。发酵中消耗的葡萄糖底物用于生物量累积外，大部分用于溶剂、挥发酸及氢气生成。
对比可知，添加NR后的CEF系统中，CEF和NR的联合作用可以大幅提升Clostridium.beijerinckii NCIMB 8052在发酵中的底物(葡萄糖)利用率、丁醇产量和丁醇产率，分别是OC系统的2.47倍、6.70倍和2.73倍。在氢气生成方面，CEF+NR系统的产量是OC系统的4.25倍，提升效果非常明显。同时，还可显著降低在发酵中产生的丙酮(非目标产物)，使得丁醇在溶剂中的百分比从OC系统的60.74％提高到82.43％，强化效果非常显著。
实施例2：
(1)在添加外源电子传递介体的阴极电发酵系统(CEF+NR)内进行厌氧混合菌群发酵秸秆产丁酸过程。与实施例1不同之处为发酵底物为葡萄糖和丁酸，1L厌氧发酵培养基中添加发酵底物葡萄糖为30g，1L厌氧发酵培养基中添加发酵底物丁酸为3g，其余操作与实施例1相同。
(2)在无施加电势的系统(OC)内进行厌氧混合菌群发酵秸秆产丁酸过程。与对比例1不同之处为发酵底物为葡萄糖和丁酸，1L厌氧发酵培养基中添加发酵底物葡萄糖为30g，1L厌氧发酵培养基中添加发酵底物丁酸为3g，其余操作与对比例1相同。
上述(1)和(2)获得的发酵指标数据，如下表1所示。
表1 葡萄糖与丁酸共底物时OC组与CEF+NR组的丁醇发酵效能
葡萄糖与丁酸共底物时，OC系统发酵结束时消耗的葡萄糖为22.51g/L，累积得到的生物量(OD600)为3.32，同时伴有8.87g/L的丁醇和2.73g/L的丙酮生成，消耗的丁酸为2.37g/L。此外发酵结束后得到了2.34L/L的氢气生成。
葡萄糖与丁酸共底物时，CEF+NR组，发酵结束后消耗的葡萄糖量提高到26.35g/L，而累积得到的生物量(OD600)仅为2.15。发酵产生了10.10g/L的丁醇和2.54g/L的丙酮，消耗的丁酸为1.81g/L。同时，还伴随着4.29L/L的氢气生成。
对比可知，添加NR后的CEF系统中，C.beijerinckii NCIMB 8052生物量的累积更少，底物更多的被用于溶剂、氢气的生成。与OC系统相比，CEF+NR系统的丁醇产量提高了13.87％，同时，丁醇在溶剂中的含量由76.47％提高到了79.91％。在氢气生成方面，CEF+NR系统的产量与OC组相比提高了83.33％。对于丁酸和葡萄糖共底物的丁醇发酵，CEF和NR的联合施加对于C.beijerinckii NCIMB 8052菌株强化效果仍非常显著。
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