一种埃博霉素b的高效提取纯化方法
阅读说明：本技术 一种埃博霉素b的高效提取纯化方法 (Efficient extraction and purification method of epothilone B ) 是由 徐有安 付光明 龚美芳 于 2020-11-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及化学工业领域,特别涉及一种埃博霉素B的高效提取纯化方法,将富含埃博霉素B的发酵液过滤后得到湿树脂,该湿树脂先水洗再用一定质量分数的碳酸氢钠溶液洗涤2次之后再水洗、提取、浓缩至一定体积,再用一定质量分数的碳酸氢钠溶液洗涤2次,以彻底除去绝大部分的蛋白类物质,消除了其对后面两次结晶、溶解和正相制备色谱操作的影响,提高了产品质量同时节约了成本,能得到纯度≥99.0％的埃博霉素B的白色固体。(The invention relates to the field of chemical industry, in particular to a high-efficiency extraction and purification method of epothilone B, which is characterized in that fermentation liquor rich in epothilone B is filtered to obtain wet resin, the wet resin is washed by water firstly, then washed by sodium bicarbonate solution with a certain mass fraction for 2 times, then washed by water, extracted and concentrated to a certain volume, and then washed by sodium bicarbonate solution with a certain mass fraction for 2 times, so that most protein substances are thoroughly removed, the influence of the wet resin on the subsequent crystallization, dissolution and normal-phase preparation chromatographic operation of the two times is eliminated, the product quality is improved, the cost is saved, and white solid of epothilone B with the purity of more than or equal to 99.0% can be obtained.)
技术领域
本发明涉及化学工业领域，特别涉及一种埃博霉素B的高效提取纯化方法。
背景技术
现有技术中对于埃博霉素B发酵液的制备和提取纯化方法例如中国发明专利《一种埃博霉素B的提纯方法》(CN 106905338 B)、《一种生产埃博霉素B的方法》(CN 106834377B)有所公开，但按照该技术方案将富含埃博霉素B的发酵液过滤所得到的湿树脂，经过水洗、减压浓缩、萃取，再经过减压浓缩、结晶、溶解、二次结晶最终得到产物的方法在实际操作时仍存在以下缺陷：因为埃博霉素B发酵后所得的收集液含有较多的蛋白类物质，导致后续浓缩操作时析出大量蛋白类白色固体，影响两次结晶操作，且两次结晶后所得粗品含量较低，使得二氯甲烷溶解粗品时有较多的粘稠状物质产生，导致操作不便，且最终结晶所得产品的含量也稍有降低，更麻烦的是该蛋白类物质还会导致正相制备色谱柱柱效的降低，从而增加成本和影响产品质量。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种埃博霉素B的高效提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.树脂收集和洗涤：将经过水洗后的埃博霉素B的发酵液过滤所得的湿树脂，用碳酸氢钠溶液洗涤，再用水洗涤；
S2.浓缩和提取：将湿树脂滤干，使用洗脱剂EA溶液洗脱树脂，得到乙酸乙酯洗脱收集液，静置所得乙酸乙酯洗脱收集液，分出下层少量的水分，将上层乙酸乙酯相减压浓缩至浓缩前体积的10％～20％，之后所得浓缩液再用碳酸氢钠溶液洗涤，并再次浓缩至浓缩前体积的10％～20％；
S3.所述S2所得溶液经过两次结晶、溶解、正相制备色谱和最终结晶后得到埃博霉素B。
而且，所述S1和S2中用碳酸氢钠溶液洗涤是指用质量分数为6％的碳酸氢钠溶液洗涤两次。
而且，所述S3中两次结晶包括初次结晶和二次结晶，其中初次结晶是在20-30℃条件下，边搅拌边加入等体积的甲苯，加入完毕后保持温度20-30℃条件搅拌30分钟，之后匀速升温至40℃I再匀速降温至0℃并保持0℃搅拌1小时，将过滤所得滤饼用甲苯淋洗，得到第一次粗品；所述二次结晶是将初次结晶所得滤饼用EA溶液转移至容器中，再次重复初次结晶的操作，得到第二次粗品。
而且，所述S3中溶解是指用二氯甲烷溶解。
而且，所述S3中正相制备色谱是填充10微米硅胶，分10次进样，洗脱剂为体积比为2：3的乙酸乙酯和正庚烷的混合液，检测器条件为290nm，之后洗脱收集得到收集液。
而且，所述S3中最终结晶是指浓缩并加入正庚烷，在20～25℃条件下搅拌、过滤、干燥。
与现有技术相比，本技术方案的有益效果在于：在水洗和提取步骤中增加了碳酸氢钠水溶液的洗涤，且提取完成后浓缩并再次用碳酸氢钠溶液洗涤，从而彻底除去了绝大部分的蛋白类物质，消除了其对后面两次结晶、溶解和正相制备色谱操作的影响，提高了产品质量同时节约了成本，能得到纯度≥99.0％的埃博霉素B的白色固体。
附图说明
图1为实施例1中得到的埃博霉素B的HPLC图谱；
图2为实施例2中得到的埃博霉素B的HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行详细具体说明，本发明的内容不局限于以下实施例。
实施例1：
1.树脂收集和水洗：
(1)100L发酵液过滤得到1.7kg湿树脂。
(2)测量树脂效价为：66mg B/L。(80mg A/L)
(3)计算埃博霉素B的大概量：(66mg B/L)*100L＝6.6g。(8g的A)
(4)先用水3L*2洗涤2次，再用质量分数为6％的碳酸氢钠溶液500ml*2洗涤2次，最后再用水3L*3洗涤3次，用布氏漏斗(300mm和10L抽滤瓶)过滤干，再用2L的EA【即乙酸乙酯】装入树脂柱(直径：18cm和高度：10cm)中。
2.提取：
(1)使用6～8L的乙酸乙酯洗脱树脂，得到乙酸乙酯洗脱收集液6～8L。
(2)静置1小时以上，分出下层少量的水分。
(3)上层乙酸乙酯相减压浓缩至1.5L后析出少量固体，过滤。
(4)滤液使用质量分数为6％的碳酸氢钠溶液200ml*2洗涤2次。
(5)继续浓缩至200～300ml。
3.初次结晶：
(1)20-30℃条件下，在磁力搅拌下加入等体积的甲苯，约30分钟加毕(此时，变得浑浊)，加入过程保持温度20-30℃。加入完毕后，保持温度20-30℃搅拌约30分钟。
(2)3小时内匀速升温至40℃，之后2小时内匀速降温至0℃，保持0℃搅拌1小时。
(3)用布氏漏斗过滤。滤饼用50ml的室温甲苯淋洗，得到粗品1：6g。
4.再次结晶：
(1)用200～300ml的乙酸乙酯转移和清洗上述滤饼至单口瓶中。
(2)20-30℃条件下，在磁力搅拌下加入等体积的甲苯，约30分钟加毕(此时，变得浑浊)，加入过程保持温度20-30℃。加入完毕后，保持温度20-30℃搅拌约30分钟。
(3)3小时内匀速升温至40℃，之后2小时内匀速降温至0℃，保持0℃搅拌1小时。
(4)用布氏漏斗过滤。滤饼用50ml的室温甲苯淋洗，得到粗品2：5g。
5.DCM溶解：
(1)用50ml的二氯甲烷溶解。
(2)过滤，得到富含活性成分的二氯甲烷溶解液。
6.正相制备色谱：
(1)填充10微米硅胶，分5次进样，洗脱剂为(体积比)乙酸乙酯：正庚烷＝2：3的混合液，检测器条件为290nm。
(2)洗脱收集得到5L收集液(埃博霉素B的纯度≥99.0％)
7.最终结晶：
(1)浓缩至200～300ml后，室温条件下加入正庚烷600～900ml。
保持20～25℃搅拌2小时后过滤干燥，得到埃博霉素B：4.3g，总收率：65％，纯度99.41％，，批号：202008026-109，其HPLC图谱见图1。
实施例2：
1.树脂收集和水洗：
(1)300L发酵液过滤得到5kg湿树脂。
(2)测量树脂效价为：70mg B/L。(88mg A/L)
(3)计算埃博霉素B的大概量：(70mg B/L)*300L＝21g。(26.4g的A)
(4)先用水8L*2洗涤2次，再用质量分数为6％的碳酸氢钠溶液1L*2洗涤2次，最后再用水8L*3洗涤3次，用布氏漏斗(300mm和10L抽滤瓶)过滤干，再用3L的EA装入树脂柱(直径：18cm和高度：10cm)中。
2.提取：
(1)使用18～24L的乙酸乙酯洗脱树脂，得到乙酸乙酯洗脱收集液18～24L。
(2)静置1小时以上，分出下层少量的水分。
(3)上层乙酸乙酯相减压浓缩至4L后析出少量固体，过滤。
(4)滤液使用质量分数为6％的碳酸氢钠溶液500ml*2洗涤2次。
(5)继续浓缩至600～900ml。
3.初次结晶：
(1)20-30℃条件下，在磁力搅拌下加入等体积的甲苯，约30分钟加毕(此时，变得浑浊)，加入过程保持温度20-30℃。加入完毕后，保持温度20-30℃搅拌约30分钟。
(2)3小时内匀速升温至40℃，之后2小时内匀速降温至0℃，保持0℃搅拌1小时。
(3)用布氏漏斗过滤。滤饼用150ml的室温甲苯淋洗，得到粗品1：20g。
4.再次结晶：
(1)用600～900ml的乙酸乙酯转移和清洗上述滤饼至单口瓶中。
(2)20-30℃条件下，在磁力搅拌下加入等体积的甲苯，约30分钟加毕(此时，变得浑浊)，加入过程保持温度20-30℃。加入完毕后，保持温度20-30℃搅拌约30分钟。
(3)3小时内匀速升温至40℃，之后2小时内匀速降温至0℃，保持0℃搅拌1小时。
(4)用布氏漏斗过滤。滤饼用150ml的室温甲苯淋洗，得到粗品2：18g。
5.DCM溶解：
(1)用150ml的二氯甲烷溶解。
(2)过滤，得到富含活性成分的二氯甲烷溶解液。
6.正相制备色谱：
(1)填充10微米硅胶，分10次进样，洗脱剂为(体积比)乙酸乙酯：正庚烷＝2：3的混合液，检测器条件为290nm。
(2)洗脱收集得到15L收集液(埃博霉素B的纯度≥99.0％)
7.最终结晶：
(1)浓缩至600～900ml后，室温条件下加入正庚烷1800～2700ml。
保持20～25℃搅拌2小时后过滤干燥，得到埃博霉素B：15.6g，总收率：74％，纯度99.55％，批号：202008026-95，其HPLC图谱见图2。