阅读说明：本技术 玉红霉素类似物、制备方法及其应用 (Rubicin analogue, preparation method and application thereof ) 是由 段燕文 朱湘成 易理伟 于 2020-11-05 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医药技术领域,具体涉及新型玉红霉素类似物及制备方法和应用。本发明提供了四种新的结构的玉红霉素类似物,其结构式如式(I)所示：本发明制备的化合物3、8具有较好的肿瘤抑制活性,可以用于制备抗肿瘤药物。尤其是化合物3,其活性远远优于相似化合物1,同时也远优于阳性抗肿瘤西药对照组的活性,证明其在未来的抗肿瘤药物中的应用有非常好的前景。(The invention belongs to the technical field of biological medicines, and particularly relates to a novel rubicin analogue, and a preparation method and application thereof. The invention provides four new structural rubicin analogues, the structural formula of which is shown as the formula (I):)

玉红霉素类似物、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及新型玉红霉素类似物及制备方法和应用。

背景技术

肿瘤作为危害人类健康的严重疾病，已经成为新世纪人类的第一杀手，更是全球最大的公共卫生威胁。因此抗癌药物的研发一直都是社会发展和民生迫切需求的重点。根据目前已经检测出的肿瘤组织标本的统计学分析，恶性肿瘤组织端粒酶活性的阳性率达到85％—95％，而良性肿瘤和正常组织的端粒酶活性检出率仅为4％左右。端粒及端粒酶作为人类抗肿瘤药物研究的新“靶点”，而端粒酶抑制剂的开发也成为抗肿瘤药物发展的热点。

玉红霉素(rubromycins，Rubs)类天然产物具有一个5,6螺环缩酮的核心骨架。已报道的20个玉红霉素类似物中，萘醌结构可分为两种类型：一种是萘醌的醌环和5,6螺环缩酮相连，如β-玉红霉素；另一种是萘醌的苯环和5,6螺环缩酮相连，如γ-玉红霉素。玉红霉素类天然产物中绝大部分都是γ-玉红霉素型的骨架，只有3个β-玉红霉素型的结构。玉红霉素类天然产物具有广泛的生物活性，如抗菌活性，细胞毒性和逆转录酶抑制活性等，尤其是部分化合物表现出良好的对人类端粒酶的抑制活性。在以报道的20个玉红霉素类天然产物中，5种表现出对端粒酶的良好抑制活性，其中以具有独特萘醌结构的β-玉红霉素最佳。这一类天然产物的在大多数溶剂中溶解性不好，极大限制了玉红霉素类天然产物作为以端粒酶为靶点的新一代抗肿瘤药物的开发。因此，新的结构的玉红霉素的发现就显得尤为重要。

发明内容

本发明提供了四种新的结构的玉红霉素类似物及其制备方法和应用。

本发明的技术方案如下：

玉红霉素类似物，其结构式如式(I)所示：

本发明还提供了上述玉红霉素类似物的制备方法，所述制备方法是用链霉菌Streptomyces sp.CB00271菌株、基因工程菌株Streptomyces sp.ZX02或基因工程菌株Streptomyces sp.ZX06发酵制备，所述基因工程菌株Streptomyces sp.ZX02是将链霉菌Streptomyces sp.CB00271的基因组中的orf9基因基因敲除后获得的基因工程菌株，所述基因工程菌株Streptomyces sp.ZX06是将链霉菌Streptomyces sp.CB00271的基因组中的orf4基因基因敲除后获得的基因工程菌株；所述的orf9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的orf4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，上述玉红霉素类似物中，化合物3是用链霉菌Streptomyces sp.CB00271菌株发酵制备，具体过程为：

S1、发酵：取链霉菌Streptomyces sp.CB00271孢子接种到含有50mL胰蛋白大豆肉汤(TSB)的培养基中培养1-2天，后将其按照4％的接种量接种到mR2A培养基中继续培养7天，调整发酵液pH调至10-11，继续反应12h，然后调整反应后的发酵液pH 至3-4后，析出红色沉淀，离心收集沉淀和菌体，将沉淀和菌体用混合溶剂超声提取，将提取液旋干，得到粗提物；

S2、分离：将粗提物溶解，第一次过硅胶色谱柱，洗脱，得到四个组分(Fr.1-Fr.4)；对Fr.3第二次过硅胶色谱柱，得到5个组分(Fr.3.1-Fr.3.5)；将Fr.3.2采用半制备型HPLC分离，得到化合物3。

优选的，用饱和NaOH溶液调整发酵液pH调至10-11。

优选的，用饱和NaOH溶液调整发酵液pH调至11。

经过试验探索，发现mR2A培养基中发酵7天后上清产物只有化合物1和少量3，随着发酵天数增加，化合物3逐渐增加，这是因为在碱性条件下，化合物1可以在12 小时内完全转化为化合物3。

本发明中所有化合物的结构式如式(Ⅱ)所示：

优选的，所述S1中混合溶剂为二氯甲烷和甲醇混合溶剂，所述混合溶剂中二氯甲烷和甲醇以1:1混合。

所述混合溶剂对沉淀的溶解性明显比其他纯溶剂或者其他比例的混合溶剂的溶解性要好。

优选的，粗提物溶解的溶剂为二氯甲烷。

优选的，所述S2中第一次过硅胶色谱柱的目数为300-400目。

优选的，所述S2中洗脱为梯度洗脱，依次采用二氯甲烷与甲醇质量比为100:0、99:1、 98:2、97:3、96:4、95:5、94:6、93:7、92:8、91:9、90:10的混合溶液梯度洗脱。

根据不同梯度洗脱下来的成分不一样，依次10个比例的混合溶剂依次洗脱，最大程度的洗掉杂质，富集目标化合物。

优选的，所述S2中第二次过硅胶色谱柱的目数为200目。

两次过硅胶色谱柱的目数不一致，第一次是粗分，第二次是细分。

优选的，mR2A培养基组成为：0.5g/L葡萄糖、0.5g/L蛋白胨、0.5g/L酵母提取物、0.5g/L酸水解酪蛋白、0.3g/L丙酮酸钠、0.025g/L MgSO₄·7H₂O、0.5g/L K₂HPO₄， pH 7.0。

优选的，上述玉红霉素类似物中，化合物4是用基因工程菌株Streptomycessp.ZX02 发酵制备，具体过程为：

A、发酵：将基因工程菌株Streptomyces sp.ZX02接种到含有硫链丝菌的R2A平板上7-9 天后，取孢子接种到TSB培养基中培养1-2天，后按照4％的接种量接种到mR2A 培养基中继续培养7天，将发酵液pH调至3-4，析出红褐色沉淀，离心收集沉淀和菌体，用混合溶剂超声提取，将提取液旋干，得到粗提物；

B、分离：将粗提物溶解，过硅胶色谱柱，洗脱，得到五个组分(Fr.1-Fr.5)；将Fr.2和 Fr.3合并再过硅胶色谱柱，得到5个组分(Fr.2.1-Fr.2.5)；进一步分离Fr.2.4，使用半制备型HPLC，最终分离得到化合物4。

优选的，进一步分离Fr.2.4，使用半制备型HPLC，同时可分离得到化合物5。

化合物4的保留时间为12.002min，其m/z 511.0875[M+H]+，HRESIMS确定其分子式为C₂₅H₁₈O₁₂，化合物5的保留时间为14.331min，其(m/z 495.0923[M+H]+)， HRESIMS确定其分子式为C₂₅H₁₈O₁₁。根据分子量和特征紫外吸收，可以确定化合物5为7,8-dideoxygriseorhodin C，而化合物4比化合物5多了一个羟基，进一步通过C谱和H谱分析及与以前的化合物进行对比，确化合物4的结构如图1，是一个新的玉红霉素类似物。

优选的，上述玉红霉素类似物中，化合物8和11是用基因工程菌株Streptomycessp.ZX06发酵制备，具体过程为：

C、发酵：将基因工程菌株Streptomyces sp.ZX06接种到含有硫链丝菌的R2A平板上7-9 天后，取孢子接种到TSB培养基中培养1-2天，后按照4％的接种量接种到mR2A 培养基中继续培养7天，将发酵液pH调至3-4，析出红褐色沉淀，离心收集沉淀和菌体，用混合溶剂超声提取，将提取液旋干，得到粗提物；

D、分离：将粗提物溶解，过硅胶色谱柱，洗脱，得到8个组分(Fr.1-Fr.8)；将Fr.2和Fr.3合并再过硅胶色谱柱，得到5个组分(Fr.2.1-Fr.2.5)；合并Fr.2.2和Fr.2.3进行进一步分离，使用半制备型HPLC，最终分离得到化合物10以及化合物11；合并 Fr.4和Fr.5进行进一步分离，使用半制备型HPLC，最终分离得到化合物8和化合物9。

本发明还提供了所述的化合物3，4，8和11在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明通过对原始菌株链霉菌Streptomyces sp.CB00271用mR2A培养基进行发酵，经过UPLC-MS的分析其次级代谢产物。以UPLC程序进行分析，分析结果显示，在原始菌株中可以生产多个玉红霉素类似物。经HRLCMS分析，在保留时间在13.342min 处并有特征紫外吸收值(λmax 238nm,309nm和508nm)的峰3，其m/z 523.0876[M+H]+，在保留时间为14.051min处并有特征紫外吸收值(λmax 236nm,316nm和496nm)的峰6，其(m/z 555.31[M+H]+)，在保留时间为14.431min处并有特征紫外吸收值(λmax 231nm, 312nm和512nm)的峰9，其(m/z 553.0982[M+H]⁺)，在保留时间为15.590min处并有特征紫外吸收值(λmax239nm,313nm和513nm)的峰1，其(m/z 537.1035[M+H]+)，在保留时间为15.98min处并有特征紫外吸收值(λmax 239nm,313nm和513nm)的峰7，其(m/z 509.0714[M+H]+)，在保留时间为16.976min处并有特征紫外吸收值(λmax 230 nm,312nm和504nm)的峰2，其(m/z523.0792[M+H]⁺)。根据分子量和特征紫外吸收，可以确定化合物1为β-玉红霉素，化合物2为γ玉红霉素，化合物6为heliquinomycin，化合物7为玉红霉素CA1，化合物10为3'-羟基-β-玉红霉素。化合物3的分子量和化合物2一样，与化合物1相差1个亚甲基，可能为一个新的玉红霉素衍生物。通过对不同发酵天数取样进行HPLC分析，如图4所示，可以看到，发酵第2天，上清产物只有化合物1和少量化合物2，随着发酵天数增加，化合物3逐渐增加，我们也观察到发酵液的pH也是逐渐变大的。当我们收集7天的发酵液进行高速离心后，取上清，用1MNaOH 将上清pH调至11，室温放置12小时，不同时间点取样进行HPLC检测，结果如图5 所示，在碱性条件下，化合物1可以在12小时内完全转化为化合物3，再结合二者之间的分子量分析，可以推测化合物1在碱性条件下，可以脱去一个亚甲基形成化合物3。为了确定这另外一个化合物3的结构式，故采用8L的规模发酵及后续体外转化，富集化合物3，利用氯仿甲醇系统进行过硅胶柱分离及HPLC-UV制备得到化合物3的纯品；经核磁共振分析和体外转化分析，我们确定化合物3的结构如图1所示，化合物3为β- 玉红霉素酸是新的玉红霉素类似物。

本发明的原始菌株链霉菌Streptomyces sp.CB00271在添加20mM的Mg²⁺的MS平板上能够生长良好，并且产生较多的孢子。在测试该菌株对不同抗生素的敏感性时发现，该菌株在添加20mM的Mg²⁺及含有50μg/mL的阿普拉霉素或20μg/mL的硫链丝菌素的MS上并不生长，该菌株在含有40μg/mL萘啶酮酸的培养基上生长良好；而E.coli S17-1萘啶酮酸极为敏感，这样我们就可以利用阿普拉霉素和硫链丝菌素作为筛选标志，用于突变株的筛选。利用大肠杆菌和链霉菌穿梭质粒pSET152，进行大肠杆菌和链霉菌的种间接合转移，用阿普拉霉素和萘啶酮酸对接合后的链霉菌和大肠杆菌进行药物覆盖，大约4天后，平板上会长出较多的接合子，说明Streptomyces sp.CB00271具有较好的接合转移性。该遗传操作体系的建立为该菌株的基因工程改造奠定了坚实的基础。

本发明通过对原始菌株链霉菌Streptomyces sp.CB00271进行全基因测序和次级代谢产物生物合成基因簇分析，及后续的基因敲除实验，确定了CB00271中玉红霉素的生物合成基因簇。通过和已报道的玉红霉素类基因簇的比较分析，我们发现CB00271中玉红霉素基因簇和已知的基因簇有所不同，相比于已报道的玉红霉素基因簇rub^DSM2012 (GenBankaccession no.AF293355),rub^CB00271基因簇多了数个基因，其中包括一个蒽醌氧化还原酶基因orf9；相比于已报道的灰绿霉素基因簇grh(GenBank accession no. AF509565),rub^CB00271基因簇中有几个独特的修饰酶基因，其中包括一个酯环化酶基因 orf4，详细内容见表1。后期我们对这两个特殊基因orf9和orf4进行敲除得到了2株能定向生产玉红霉素类似物的工程菌株Streptomyces sp.ZX02和Streptomyces sp.ZX06。用 mR2A培养基发酵菌株，经过UPLC-MS的分析其次级代谢产物。以UPLC程序进行分析，分析结果显示，在Streptomyces sp.ZX02突变株中可以定向生产两个玉红霉素类似物4和5。经HRLCMS分析，在保留时间在12.002min处并有特征紫外吸收值(λmax 239 nm,313nm和510nm)的峰4，其m/z 511.0875[M+H]⁺，在保留时间为14.331min处并有特征紫外吸收值(λmax 232nm,315nm和502nm)的峰5，其(m/z 495.0923[M+H]⁺)。根据分子量和特征紫外吸收，可以确定化合物5为7,8-dideoxygriseorhodin C。为了确定这另外一个化合物的结构式，故采用6L的规模发酵，利用氯仿甲醇系统进行过硅胶柱分离及HPLC-UV制备得到化合物4的纯品；经核磁共振分析，我们确定化合物4为新的玉红霉素类似物(图1)。

利用上述同样的UPLC程序对Streptomyces sp.ZX06突变株进行分析，分析结果显示，该突变株可以生产4个玉红霉素类似物8/9/10/11，经过进一步的HRLCMS分析，在保留时间在12.869min处并有特征紫外吸收值(λmax 231nm,308nm和516nm)的峰8，其m/z539.0822[M+H]⁺，在保留时间为13.979min处并有特征紫外吸收值(λmax 231nm, 312nm和495nm)的峰9，其(m/z 525.0663[M+H]⁺)，在保留时间为14.431min处并有特征紫外吸收值(λmax 231nm,312nm和512nm)的峰10，其(m/z 553.0982[M+H]⁺)，在保留时间为15.421min处并有特征紫外吸收值(λmax 230nm,312nm和494nm)的峰11，其(m/z 539.0822[M+H]⁺)。化合物8和10之间相差一个亚甲基，化合物9和11之间也相差一个亚甲基。在发酵过程中，发现四个类似物存在一定的联系，ZX06发酵2天时，产物只有化合物10和11，随着发酵天数增加，并且发酵液pH变大，化合物8和9逐渐增加，如图2。当我们收集2天的发酵液进行高速离心后，取上清，用1M NaOH将上清pH调至11，室温放置24小时，可以观察到在碱性条件下化合物10和11可以在 24小时内完全转化为化合物8和9如图3，再结合4者之间的分子量分析，可以推测化合物10和11在碱性条件下，分别脱去一个亚甲基形成化合物8和9。根据分子量和特征紫外吸收，可以确定化合物9为玉红霉素CA2，化合物10为3'-羟基-β-玉红霉素，其中化合物8和11应为新化合物。为了确定这两个峰对应的化合物的结构，故采用8L 的规模发酵处理，过氯仿甲醇系统进行过硅胶柱分离及HPLC-UV制备分别得到化合物 8和11的纯品；经核磁共振分析以及体外转化分析，确定化合物8和11的结构如图1 所示，化合物8为3'-羟基-β-玉红霉素酸，化合物11为3'-羟基-γ-玉红霉素，两个都是新的玉红霉素类似物。

本发明涉及到玉红霉素生物合成基因簇中蒽醌氧化还原酶负责氧化后修饰作用的基因orf9(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)和酯环化酶基因orf4(其核苷酸序列如SEQID NO.2所示)，分别将其进行置换单独突变后可得到定向生产玉红霉素类似物的工程菌株。在玉红霉素的生物合成基因簇中，orf9编码一个有325个氨基酸的多肽，该多肽被定义为蒽醌氧化还原酶。orf4编码一个288个氨基酸的多肽，定义为酯环化酶。为了确定orf9和orf4基因编码的蛋白质Orf9和Orf4在玉红霉素的生物合成中的具体作用，用一个具有硫链丝菌素抗性的DNA片段分别进行阅读框内取代，使得orf9(图6)和orf4 (图7)失活。将敲除载体转入到E.coli S17-1菌株中，与野生型CB00271菌株进行种间接合转移，得到一些接合子，选取抗性表型(硫链丝菌素耐受，阿普拉霉素敏感)和基因型均正确ZX02，ZX06与野生型CB00271菌株同时同条件发酵，野生型菌株作为阳性对照。通过HPLC分析突变菌株ZX02的发酵液提取物，结果表明突变株生产2个玉红霉素类似物(图8)，ZX06突变株生产4个玉红霉素的类似物(图8)。这些数据证明了Orf9 和Orf4蛋白在玉红霉素的生物合成中具有重要作用。

本发明所提供的核苷酸列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法或包含本发明SEQ ID NO.1所示序列的第1～978位的DNA或SEQ ID NO.2所示序列的第1～867位的DNA作为探针以Southern杂交等方法从其他生物体中得到与orf9和 orf4相似的基因。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被体内体外修饰或进行突变，包括插入、置换或缺失，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变，不同序列的重新连接，序列的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化，或通过紫外线或化学试剂诱变等。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通过合适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其他更高的生物活性物质或产量。这些外源宿主包括大肠杆菌、链霉菌、小单孢菌、假单孢菌、芽孢杆菌、酵母、植物和动物等。

包含本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其他致力于得到的性质。

包含DNA片段或基因可以用来构建定向生产玉红霉素或其衍生物的突变株，本发明提供了在基因工程微生物中定向使用的途径。

本发明还提供了利用玉红霉素生物合成基因簇中的蒽醌氧化还原酶Orf9在定向生产玉红霉素类似物中的应用。

天然产物的生物合成基因簇的发现以及基因敲除技术的发展，为菌株的基因工程改造提供了可能和手段。已经有许多研究通过生物合成手段成功完成了较多结构复杂的天然产物的结构修饰、改造或某些目标成分的定向积累，构建了一系列活性相当或活性较强的衍生物或高产突变株，为链霉菌的基因工程改造提供了很好的案例，也为解决日益严重的肿瘤疾病的治疗带来了新希望。

通过对原始菌株的发酵发现新的玉红霉素类似物或通过基因敲除的手段对玉红霉素进行结构修饰或改造，获取更多的玉红霉素结构类似物，从而加快这一类天然产物的抗癌活性分析和作用机理等临床前期研究，以及抗肿瘤新药的应用开发。

本发明还提供了如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列在制备化合物玉红霉素类似物中的应用。

所述的应用是将如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列缺失后，可以定向生产玉红霉素类似物中的四个化合物。

总之，本发明所提供的包含玉红霉素生物合成相关的后修饰基因和蛋白信息，可以帮助人们理解蒽醌类天然产物生物合成机制，为进一步利用遗传改造的方式得到工程菌株提供了可能。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

本发明的所述链霉菌为Streptomyces sp.CB00271，已于2020年6月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为CCTCC M 2020176。

有益效果：

本发明制备的化合物3、8具有较好的肿瘤抑制活性，可以用于制备抗肿瘤药物。尤其是化合物3，其活性远远优于相似化合物1，同时也远优于阳性抗肿瘤西药对照组的活性，证明其在未来的抗肿瘤药物中的应用有非常好的前景。为加快这一类天然产物的抗癌活性分析和作用机理等临床前期研究，以及抗肿瘤新药的应用开发提供了更大的可能性。

附图说明

图1是玉红霉素类化学结构式。

图2是双交换突变株ZX06发酵时间HPLC分析。

图3是双交换突变株ZX06发酵第二天上清产物在碱性条件下反应HPLC分析。

图4是野生型CB00271发酵时间HPLC分析。

图5是野生型CB00271发酵第7天上清产物在碱性条件下反应HPLC分析。

图6是ZX02双交换突变株的构建及PCR验证图，其中1为野生型，2为双交换突变株ZX02，M为Marker。

图7是ZX06双交换突变株的构建及PCR验证图，其中1为野生型，2为双交换突变株ZX02，M为Marker。

图8是双交换突变株ZX02/ZX06和野生型发酵后HPLC分析

具体实施方式

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具体实施方式

以下将结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。以下所有百分含量均指质量百分含量。以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1Streptomyces sp.CB00271的培养和遗传操作体系的建立及基因簇分析

1.1CB00271的固体培养：

链霉菌Streptomyces sp.CB00271是从云南森林土壤中分离得到，该菌种保存于R2A 培养基斜面，R2A培养基组成为：0.5g/L葡萄糖、0.5g/L蛋白胨、0.5g/L酵母提取物、0.5g/L酸水解酪蛋白、0.3g/L丙酮酸钠、0.025g/L MgSO₄·7H₂O、0.5g/L K₂HPO₄和20 g/L琼脂，pH7.0，灭菌备用。

1.2Streptomyces sp.CB00271遗传操作体系的建立

我们研究了Streptomyces sp.CB00271在不同培养基上的生长和产孢情况，发现其在含有20mM的Mg²⁺的MS培养基上产孢良好。同时，研究了Streptomyces sp.CB00271 对多种抗菌药物的敏感性情况，被测试的抗菌药物包括：阿普拉霉素(Apramycin，Am)、萘啶酮酸、硫链丝菌素(Thiostrepton,Tsr)等的敏感性，发现Streptomyces sp.CB00271对阿普拉霉素(50μg/mL)和硫链丝菌素(20μg/mL)敏感。萘啶酮酸(40μg/mL)对Streptomycessp.CB00271无毒性。E.coli S17-1菌株对萘啶酮酸(40μg/mL)非常敏感。此项工作说明，我们可以在基因置换突变时引入硫链丝菌素抗性基因，在接合转移时，可以用硫链丝菌素和萘啶酮酸来筛选获得接合子。利用含有整合型质粒pSET152的S17-1的大肠杆菌与Streptomyces sp.CB00271进行接合转移，通过用阿普拉霉素和萘啶酮酸覆盖接合平板，4天左右发现有较多的接合子出现，证明该遗传操作的可行性。为后续实验的开展奠定了良好的基础。

1.3CB00271的基因簇分析

通过对原始菌株链霉菌Streptomyces sp.CB00271进行全基因测序和次级代谢产物生物合成基因簇分析，及后续的基因敲除实验，确定了CB00271中玉红霉素的生物合成基因簇。通过和已报道的玉红霉素类基因簇的比较分析，我们发现CB00271中玉红霉素基因簇和已知的基因簇有所不同，相比于已报道的玉红霉素基因簇rub^DSM2012 (GenBankaccession no.AF293355),rub^CB00271基因簇多了数个基因，其中包括一个蒽醌氧化还原酶基因orf9；相比于已报道的灰绿霉素基因簇grh(GenBank accession no. AF509565),rub^CB00271基因簇中有几个独特的修饰酶基因，其中包括一个酯环化酶基因 orf4，详细内容见表1。

表1 CB00271玉红霉素生物合成基因簇分析比较

实施例2Streptomyces sp.CB00271发酵分析和后续规模化发酵及玉红霉素类似物的分离纯化及结构鉴定

CB00271产生多个玉红霉素类似物，在保留时间在13.342min处并有特征紫外吸收值(λmax 238nm,309nm和508nm)的峰3，其m/z 523.0876[M+H]+，分子式为C₂₆H₁₈O₁₂；在保留时间为14.051min处并有特征紫外吸收值(λmax 236nm,316nm和496nm)的峰6，其m/z555.31[M+H]+，分子式为C₂₆H₁₈O₁₄；在保留时间为14.431min处并有特征紫外吸收值(λmax231nm,312nm和512nm)的峰10，其(m/z 553.0982[M+H]⁺)，分子式为 C₂₇H₂₀O₁₃；在保留时间为15.590min处并有特征紫外吸收值(λmax 239nm,313nm和513 nm)的峰1，其(m/z537.1035[M+H]+)，分子式为C₂₇H₂₀O₁₂；在保留时间为16.076min 处并有特征紫外吸收值(λmax 230nm,312nm和504nm)的峰2，其(m/z 523.0792 [M+H]+)，分子式为C₂₆H₁₈O₁₂。根据分子量和特征紫外吸收以及保留时间，可以确定化合物1为β-玉红霉素，2为γ玉红霉素，化合物6为heliquinomycin，化合物10为3'- 羟基-β-玉红霉素，化合物3分子量和2一样，与化合物1相差1个亚甲基，可能为一个新的玉红霉素衍生物。通过对不同发酵天数取样进行HPLC分析，如图6所示，可以看到，发酵第2天，上清产物只有化合物1和少量化合物2，随着发酵天数增加，化合物 3逐渐增加，我们也观察到发酵液的pH也是逐渐变大的。当我们收集7天的发酵液进行高速离心后，取上清，用1M NaOH将上清pH调至11，室温放置12小时，不同时间点取样进行HPLC检测，结果如图7所示，在碱性条件下，化合物1可以在12小时内完全转化为化合物3，再结合二者之间的分子量分析，可以推测化合物1在碱性条件下，可以脱去一个亚甲基形成化合物3。

为了鉴定化合物3的结构，我们进行8L的大规模发酵及后续的体外转化来富集化合物3，具体过程如下：取部分CB00271孢子接种到含有50mL TSB的培养基中于30 度摇床培养1-2天，按照4％的接种量接种到mR2A培养基中，放在转速为220rpm的 30℃摇床继续培养7天。将CB00271发酵7天后，用饱和NaOH溶液将发酵液pH调至 11，继续放置于摇床混匀过夜。然后用1M盐酸调节反应后的发酵液pH至3-4后析出红色沉淀，高速离心，弃上清收集沉淀和菌体。通过离心收集的沉淀和菌体分别用二氯甲烷和甲醇混合溶剂进行多次溶解提取至提取液无颜色，离心后合并可溶部分并在真空下浓缩，得到粗提物。将粗提物溶解在少量二氯甲烷中，并进行300-400目的硅胶柱色谱，用二氯甲烷和甲醇梯度洗脱，得到四个组分(Fr.1-Fr.4)。通过200目的硅胶柱色谱法依次进一步纯化Fr.3，得到5个组分(Fr.3.1-Fr.3.3)。进一步分离Fr.3.2，使用半制备型HPLC，得到化合物3。进一步通过C谱和H谱分析及与以前的化合物进行对比，确化合物3的结构如图1，是一个新的玉红霉素类似物，可以通过β-玉红霉素在碱性条件下水解生成，因此命名化合物3为β-玉红霉素酸。

实施例3Streptomyces sp.CB00271中orf9和orf4基因敲除质粒的构建

3.1Streptomyces sp.CB00271中orf9敲除质粒的构建

以S sp.CB00271总DNA为模板，分别设计了2对引物

pD9F：5′-AATGTGAACACGCCTCCTCGACCCGCAG-3′(SEQ ID NO.3)；

pD9R：5′-GCGGCCGCGGATCCTCTAGAGGCAAGACCACCTTGTCGCG-3′(SEQ ID NO.4)；和

pD10F：5′-ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGGCGAAGACCGAGATGC-3′(SEQ ID NO.5)；

pD10R：5′-CAACCGATAAAAGGCGCACGAGCTGATG-3′(SEQ ID NO.6)；用于PCR 扩增左右同源臂，纯化回收长度均为1.5kb的特异产物，同时设计一对引物：

p9TF：5′-CGTGCGCCTTTTATCGGTTGGCCGCGAG-3′(SEQ ID NO.7)；

p9TR：5′-CGAGGAGGCGTGTTCACATTCGAACGGTCTCTG-3′(SEQ ID NO.8)；用来扩增硫链丝菌素抗性基因盒，纯化回收长度均为0.9kb的特异产物。采用无缝克隆的策略，构建方法参照(TSV-S1)Trelief SoSoo Cloning Kit操作手册进行。将左右同源臂和抗性基因以及用HindIII和XbaI酶切线性化的pOJ260载体，按照3:3:3:1的浓度进行无缝连接，链接产物转化到感受态E.coli DH5α中，挑选单克隆进行菌落验证，阳性克隆提取质粒进行酶切验证和测序验证，测序正确的质粒即为orf9/10基因敲除质粒pYLW003，用于后续基因敲除。

3.2Streptomyces sp.CB00271中orf4敲除质粒的构建

以S sp.CB00271总DNA为模板，分别设计了2对引物：

pD4UPF：5′-AATGTGAACAGGCGTCGTGGAACAGC-3′(SEQ ID NO.9)；

pD4UPR：5′-GCGGCCGCGGATCCTCTAGAGGATGTCGCGGCCCGA-3′(SEQ ID NO.10)；和

pD4DNF：5′-ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGGACTGGCCCATGGTGAC-3′(SEQ ID NO.11)；

pD4DNR(5′-GCCAACCGATAAAAGGTCTCCGAGCACTGG-3′(SEQ ID NO.12)；用于PCR扩增左右同源臂，纯化回收长度均为1.3kb的特异产物，同时设计一对引物：

p4TF：5′-CTCGGAGACCTTTTATCGGTTGGCCGCGAG-3′(SEQ ID NO.13)；

p4TR ：5′-CACGACGCCTGTTCACATTCGAACGGTCTCTG-3′(SEQ ID NO.14)；用来扩增硫链丝菌素抗性基因盒，纯化回收长度均为0.9kb的特异产物。采用无缝克隆的策略，构建方法参照(TSV-S1)Trelief SoSoo Cloning Kit操作手册进行。将左右同源臂和抗性基因以及用HindIII和XbaI酶切线性化的pOJ260载体，按照3:3:3:1的浓度进行无缝连接，链接产物转化到感受态E.coli DH5α中，挑选单克隆进行菌落验证，阳性克隆提取质粒进行酶切验证和测序验证，测序正确的质粒即为orf9基因敲除质粒pYLW010，用于后续基因敲除。

实施例4orf9基因缺失突变菌株Streptomyces sp.ZX02的构建

将构建好的敲除质粒pYLW003转入E.coli S17-1中得到转入了敲除质粒pYLW003的E.coli S17-1，命名为E.coli S17-1/pJu2014/pYLW003，与野生型菌株进行接合转移。接合转移过程如下：取冻存于-80℃冰箱的S sp.CB00271孢子2管(约10⁹孢子)，用LB 洗涤2遍，重悬于1mL LB培养基中，50℃水浴热激10min后，静置至室温，用作接合转移受体菌。将构建好的重组质粒转化E.coli S17-1，从含有两种抗生素(Am、Km) 的LB平板上挑取单克隆接种至3mL LB培养基(含相应抗生素)，37℃、230rpm振荡培养12-15h，吸取500μl菌液接种至50mL LB培养基(含相应抗生素)，37℃、230rpm 摇床培养4-8小时至OD₆₀₀达到0.3-0.4。将菌液倒入50mL灭菌离心管中，4000rpm离心10min收集菌体。菌体用25mL LB培养基洗涤两次，重悬于2mL LB培养基用作接合转移供体菌。将热激好的S sp.CB00271孢子和E.coliS17-1(含重组质粒)菌液按照 1：1体积混合均匀，离心去掉部分上清后，重悬吸取涂布于MS培养基(含20mM MgCl₂)，同时做阴性对照和阳性对照。用作阳性对照和阴性对照的M S培养基上只涂布20μl S sp. CB00271孢子。将涂好菌液的M S培养基置于30℃恒温培养箱培养18-20h后，用无菌水洗去表面大肠杆菌，再向接合转移培养基和阴性对照覆盖50mg/L的Am(或20mg/L Tsr)和40mg/L的萘啶酮酸，向阳性对照覆盖40μg/mL的萘啶酮酸，置于超净台吹扫 2-3h至表面干燥。培养基置于30℃培养箱倒置培养，4-7天后长出白色的接合子单菌落。双交换突变菌株ZX02通过其对抗生素的抗性表型(Am^S&Tsr^R)及基因型而被筛选及鉴定出来，其中orf9基因缺失的PCR验证分别利用引物：

pYZ9F：5′-CCCGCGCTTCCATCAGC-3′(SEQ ID NO.15)；

pYZ9R：5′-ACGTCCTGCGGGTCGAG-3′(SEQ ID NO.16)；进行PCR扩增反应得到证实，由此得到orf9基因缺失突变的S sp.CB00271，将其命名为双交换敲除菌株Streptomycessp.ZX02。

orf4基因缺失突变菌株的构建过程同Streptomyces sp.ZX02，验证引物：

pYZ4F：5′-TCATGGCGTGGGCAGTCC-3′(SEQ ID NO.17)；

pYZ4R：5′-CCGGAACGGAGGGACTC-3′(SEQ ID NO.18)，由此得到orf4基因缺失突变的S sp.CB00271，将其命名为双交换敲除菌株Streptomyces sp.ZX06。

实施例5野生型菌株与双交换突变菌株Streptomyces sp.ZX02和Streptomycessp. ZX06的发酵及其HPLC分析

野生型菌株和双交换突变菌株都在R2A固体培养基平板上30℃培养7-9天，其中双交换突变株的平板同时含有终浓度为20μg/mL的硫链丝菌；挑取适量孢子接种于装有50mLTSB培养基的三角瓶中，在30℃和220rpm转速的摇床上培养1-2天；再以 4％的接种量接种于发酵培养基mR2A，发酵的培养基mR2A的组成包括：5份可溶性淀粉，5份葡萄糖，2.5份蛋白胨，2.5份酵母粉，0.5份酸水解酪蛋白，0.3份丙酮酸钠，0.25份MgSO₄·7H₂O，0.5份K₂HPO₄，pH 7.0。在30℃和220rpm转速的摇床上培养7天。50mL发酵液用1M HCl将发酵液pH调至3-4，混匀后，析出红褐色沉淀，将发酵液进行离心收集沉淀和菌体，用二氯甲烷和甲醇混合溶剂对离心沉淀和菌体进行多次超声提取，直至提取液无颜色，合并提取液，得到混合液，浓缩干燥后再重新定容至50mL，12000rpm离心5min后，取上清液进行HPLC分析。HPLC分析条件及程序如下：流动相A为99.9％去离子水和0.1％甲酸；流动相B为100％乙腈，流速为1.0 mL/min，紫外检测器波长为310nm，线性梯度分析程序为：0-1分钟，95％A；1-18分钟，95％A至5％A；18-20分钟，5％A；20-20.5分钟，5％A至95％A；20.5-25分钟， 95％A。HPLC分析结果见图4和图5。由图可以发现ZX02突变株仅产生2个玉红霉素类似物(图4)；ZX06产生4个玉红霉素类似物(图5)。

实施例6Streptomyces sp.ZX02突变株规模化发酵及玉红霉素类似物的分离纯化及结构鉴定

首先，将突变株ZX02接种到含有20μg/mL硫链丝菌的R2A平板上，待7-9天孢子生长良好后，取部分孢子接种到含有50mL TSB的培养基中于30度摇床培养1-2天，按照4％的接种量接种到mR2A培养基中，放在转速为220rpm的30℃摇床继续培养7 天，共发酵6L。然后，用1M HCl将发酵液pH调至3-4，混匀后，析出红褐色沉淀，将发酵液进行离心收集沉淀和菌体，用二氯甲烷和甲醇混合溶剂对离心沉淀和菌体进行多次超声提取，直至提取液无颜色，合并提取液，得到混合液进行合并拌样，进行目标化合物的富集和分离。将粗提物溶解在少量二氯甲烷中，并进行300-400目的硅胶柱色谱，用二氯甲烷和甲醇梯度洗脱，得到五个组分(Fr.1-Fr.5)。将Fr.2和Fr.3合并再通过 200目的硅胶柱色谱法依次进一步纯化，得到5个组分(Fr.2.1-Fr.2.5)。进一步分离Fr.2.4，使用半制备型HPLC，最终分离得到4以及5。化合物4的保留时间为12.002min，其 m/z 511.0875[M+H]⁺，HRESIMS确定其分子式为C₂₅H₁₈O₁₂，化合物5的保留时间为 14.331min，其(m/z 495.0923[M+H]⁺)，HRESIMS确定其分子式为C₂₅H₁₈O₁₁。根据分子量和特征紫外吸收，可以确定化合物5为7,8-dideoxygriseorhodin C，而化合物4比化合物5多了一个羟基，进一步通过C谱和H谱分析及与以前的化合物进行对比，确化合物4的结构如图1，是一个新的玉红霉素类似物。

实施例7Streptomyces sp.ZX06突变株发酵分析和后续规模化发酵及玉红霉素类似物的分离纯化及结构鉴定

ZX06产生4个玉红霉素类似物，经过进一步的HRLCMS分析，在保留时间在12.869min处并有特征紫外吸收值(λmax 231nm,308nm和516nm)的峰8，其m/z 539.0822 [M+H]⁺，分子式为C₂₆H₁₈O₁₃；在保留时间为13.979min处并有特征紫外吸收值(λmax 231 nm,312nm和495nm)的峰9，其m/z 525.0663[M+H]⁺，分子式为C₂₅H₁₆O₁₃；在保留时间为14.431min处并有特征紫外吸收值(λmax 231nm,312nm和512nm)的峰10，其m/z 553.0982[M+H]⁺，分子式为C₂₇H₂₀O₁₃；在保留时间为15.421min处并有特征紫外吸收值(λmax 230nm,312nm和494nm)的峰11，其m/z 539.0822[M+H]⁺，分子式为C₂₆H₁₈O₁₃。根据分子量和特征紫外吸收，可以确定化合物9为rubromycin CA2，化合物10为3'-羟基-β-玉红霉素；化合物8和化合物10之间相差一个亚甲基，化合物9和化合物11之间也相差一个亚甲基。在发酵过程中，发现四个类似物存在一定的联系，如图2，ZX06 发酵2天时，产物只有化合物10和化合物11，随着发酵天数增加，并且发酵液pH变大，化合物8和化合物9逐渐增加。当我们收集2天的发酵液进行高速离心后，取上清，用1M NaOH将上清pH调至11，室温放置24小时，不同时间点取样进行HPLC检测，结果如图3所示，在碱性条件下，化合物10和化合物11可以在24小时内完全转化为化合物8和化合物9，再结合4者之间的分子量分析，可以推测化合物10和化合物11 在碱性条件下，分别脱去一个亚甲基形成化合物8和化合物9。

对ZX06突变株的发酵方法和提取方法与ZX04突变株的处理方法相同。ZX06突变株中化合物的分离步骤如下：将粗提物溶解在少量二氯甲烷中，并进行300-400目的硅胶柱色谱，用二氯甲烷和甲醇梯度洗脱，得到8个组分(Fr.1-Fr.8)。将Fr.2和Fr.3合并再通过200目的硅胶柱色谱法依次进一步纯化，得到5个组分(Fr.2.1-Fr.2.5)。合并Fr.2.2 和Fr.2.3进行进一步分离，使用半制备型HPLC，最终分离得到化合物11以及化合物 10；合并Fr.4和Fr.5进行进一步分离，使用半制备型HPLC，最终分离得到化合物9和化合物8。通过C谱和H谱分析及与四者之间相互转化的关系，可以确定化合物9为玉红霉素CA2，化合物10为3'-羟基-β-玉红霉素；其中化合物8和化合物11结构如图2，化合物8为3'-羟基-β-玉红霉素酸，化合物11为3'-羟基-γ-玉红霉素，都是是新的玉红霉素类似物。

表2化合物3/4/11的核磁数据

化合物1-11的结构式分别如图1中的所示。

实施例8化合物1/2/3/4/8/9/10/11的抗肿瘤分析

实验使用肿瘤细胞株为HeLa(人宫颈癌细胞)、A549(人小细胞肺癌细胞)和Caco-2(人结肠腺癌细胞)。

实验方法采用常规的CCK-8法。收集处于对数生长期的细胞，调整细胞悬液的浓度，使待测细胞密度为2×10³～5×10³个/孔(细胞密度依据细胞种类而定)，在96孔板中培养，每孔100μL，放置于37℃和5％CO₂的培养箱中孵育24h后，使用排枪将培养基吸掉，然后加入用培养基配制的不同浓度梯度(100μM，50μM，25μM，10μM，1μM， 0.1μM，0.01μM)的药物，每个浓度平行3个复孔，孵育72h。将培养基吸掉，每孔加入100μL含有10％CCK-8的培养基溶液，培养1-2h，直到培养基颜色变为橙黄色，将培养板取出来并在酶联免疫检测仪450nm处测量各孔的吸光度OD值。该实验需要设置调零孔(空白培养基)和对照孔(含有相同细胞，没有药物的培养基)和阳性对照孔(博来霉素，)，边缘孔添加PBS。细胞存活率％＝(加药组OD值-空白组OD值)/ (对照组OD值-空白组OD值)×100％。每组取3个复孔的平均值，绘制细胞生长抑制曲线，计算IC₅₀值。结果见表3。

表3化合物1/2/3/4/8/9/10/11的抗肿瘤活性测试分析结果

从表2可以看出，化合物3、8具有较好的肿瘤抑制活性，可以用于制备抗肿瘤药物。尤其是化合物3，其活性远远优于相似化合物1，同时也远优于阳性抗肿瘤西药对照组的活性，证明其在未来的抗肿瘤药物中的应用有非常好的前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 长沙天赐生物医药科技有限公司

<120> 玉红霉素类似物、制备方法及其应用

<130> 1

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 978

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atgcgtatcg tccgccacca cgcgttcggg gcccccgacg tcctgcgggt cgaggaggcg 60

ccccgccccg aacccggtgc gggccaggtc ctgatccgga ccgaggccgt cggtgtgaac 120

ttcgccgaat gccagcgccg tcagggcatc ccggtcggcg gccccgccac cctgccgggc 180

tcgccgggcg gcgatgtcgc cggagtcgtc gaggcgctcg gcgagggggt gagcgaggtg 240

agcgtcggcg accgcgtcgt caccggcgca cccttcgacg cctacgccga atacgtcgtc 300

gcgcgggccg actggctctt tccggtcccg gagtccatcg acgcggccca ggccacgtcg 360

atgccgatcc ccgcgcagac ggcgtaccac gtcatcgcga cggcggcccg gctcgccagg 420

ggtgaatcga tgctgatcac ggcagcggcc ggtggtatcg ggcacctgct cgtccaactg 480

ggcaaggcgc tcggcgccgg ccgggtgatc gctgccgcgg gcagcgcggc caagctggac 540

ttcgtccgcg ggctgggcgc cgacgtcgcg atcaactaca ccgacgagga ctgggacgag 600

caggtcaggg cggccaccga cggccgtggc gccgatgtgg tgctggagac cgtgggcggc 660

gacatcctgc ggcggtcggt cggtctgatc gccccgttcg ggcggatggt ggtctacggc 720

acggccggag gggaactgcc tgccgtggag atcgcggaca tcttcgacaa ccggacggtg 780

atgggcttca gcatgtgggg cgtgatggcc catcgcccgc aggagatggc ggacggcgcc 840

aaagccctgc tcgacctggt gggatccggc cgggtgagcc cggtgatcca cgcccggatc 900

ccgctcgacc gggccggtgc ggcgcacgcc ctgatggagg cccggtccca gctcggccgg 960

gtggtgctgg tgccctga 978

<210> 2

<211> 867

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atgacgatcc cgatccccgc ggagagcagg gcgcgcaacg ccgggctggt ccgcggtctg 60

tacgacgtgc tttaccggcg gcaccggccg gacgaggccg ggcggctgtt ccacgacgcc 120

catgtcgacc acgacccgcg ggtggggccc ggcccctccg ggccgttgcg gcactgggag 180

tcgatgcgcg cggcctttcc cgggctgcgc gcccgtatcg gccgtctggt cgcggacgag 240

gaccgggtca tgctgttcgc ggcctggacc ggacggactc cggccggtga cccgttcgag 300

ctgcacacgg ccgagttgta ccggatcgcg gagggccgga tcgccgagca ctggaatgtc 360

accgaccggg acgtgctcgc cgggcatgtc ccggacgtgc cggacgcgct cgtggggccg 420

gagccggccg tgctgcacgg tctccacagc gaggacgagc gggccaacgc ggcggtggtg 480

ctcgacgcgt accgggtggt gttcagcgag caccggctgg atctggccga ccgctactac 540

caccgggact accggcacca caacgcgcgt acggaccggg tgcccgacgg cctggaggcg 600

ttcaccgcgt tcttcgccga caacctggcc gccttccccg atctggccgt caccgtcgag 660

cacgtggtcg ccgccgggga ccgggtgatg gtcttcgtca cctggaccgg aacgctcacc 720

ggcgcctgga gcggtggtgg cccgtccggg ctgccgttgg tgatgcgcac ctgcgaccac 780

ttccggctgg aggacgggaa ggtctccgag cactgggagg tcgtcgacta tctgccggtc 840

cggcgtgccg gactgcccac gccatga 867

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

aatgtgaaca cgcctcctcg acccgcag 28

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gcggccgcgg atcctctaga ggcaagacca ccttgtcgcg 40

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

acgacggcca gtgccaagct tggcgaagac cgagatgc 38

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

caaccgataa aaggcgcacg agctgatg 28

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

cgtgcgcctt ttatcggttg gccgcgag 28

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

cgaggaggcg tgttcacatt cgaacggtct ctg 33

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

aatgtgaaca ggcgtcgtgg aacagc 26

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

gcggccgcgg atcctctaga ggatgtcgcg gcccga 36

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

acgacggcca gtgccaagct tggactggcc catggtgac 39

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

gccaaccgat aaaaggtctc cgagcactgg 30

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

ctcggagacc ttttatcggt tggccgcgag 30

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

cacgacgcct gttcacattc gaacggtctc tg 32

<210> 15

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

cccgcgcttc catcagc 17

<210> 16

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

acgtcctgcg ggtcgag 17

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

tcatggcgtg ggcagtcc 18

<210> 18

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

ccggaacgga gggactc 17