具体实施方式

在详细解释至少一个实施例之前，应该理解的是，主题在其应用方面不限于以下描述中阐述的或附图中展示的组件的构造和布置的细节。本发明主题能够具有其它实施例或能够以各种方式实践或执行。而且，应理解的是，本文所采用的措辞和术语是出于说明的目的，并且不应该被认为是限制性的。在对下文描述的各个附图的讨论中，相似的数字指代相似的部件。附图通常不是按比例绘制的。

为清楚起见，在一些附图中省略了不必要的元件。

本发明主题提供了一种允许通过被配置成对范围为基本上1,000-10,000个bp以及甚至高达100,000个bp且更多的长核酸片段进行测序的平台，例如纳米孔测序平台，对例如长度为数百个碱基对的短核酸片段进行测序的多聚体。

本发明主题进一步提供了允许对短核酸片段进行测序的多聚体。短核酸片段可以短至基本上20个bp，至多长度为数百个碱基对。多聚体允许通过被配置成对范围为基本上1,000-10,000个bp的长核酸片段或比基本上2,000更长或长度高达基本上100,000个bp且更多的核酸片段进行测序的平台，例如纳米孔测序平台多次对短核酸片段进行测序，从而产生精确的测序结果。

本发明主题进一步提供了一种允许通过被配置成对范围为基本上1,000-10,000个bp以及甚至高达100,000个bp且更多的长核酸片段进行测序的平台，例如纳米孔测序平台，对例如长度为数百个碱基对的来自不同来源的多个不同短核酸片段同时进行测序，同时允许根据获得的序列标识每个片段的来源的多聚体。

本发明主题进一步提供了允许对短核酸片段进行测序的多聚体。短核酸片段可以短至基本上20个bp，至多长度为数百个碱基对。多聚体允许通过被配置成对范围为基本上1,000-10,000个bp的长核酸片段或比基本上2,000更长或长度高达基本上100,000个bp且更多的核酸片段进行测序的平台，例如纳米孔测序平台多次对短核酸片段进行测序，从而产生精确的测序结果。

本发明主题另外提供了一种允许在ROI中的突变与引入到获得的序列中的，例如由测序方法的准确性差而引起的误差和/或在所述ROI扩增期间引入的误差之间进行区分的多聚体。

本发明主题另外提供了一种用于制备允许对短核酸片段进行测序的多聚体的方法。短核酸片段可以短至基本上20个bp，至多长度为数百个碱基对。多聚体允许通过被配置成对范围约为基本上1,000-10,000个bp的长核酸片段或比基本上2,000更长或长度高达基本上100,000个bp且更多的核酸片段进行测序的平台，例如纳米孔测序平台对短核酸片段进行测序。

本发明主题进一步提供了一种用于制备允许对短核酸片段进行测序的多聚体的方法。短核酸片段可以短至基本上20个bp，至多长度为数百个碱基对。多聚体允许通过被配置成对范围为基本上1,000-10,000个bp的长核酸片段或比基本上2,000更长或长度高达基本上100,000个bp且更多的核酸片段进行测序的平台，例如纳米孔测序平台多次对短核酸片段进行测序，从而产生精确的测序结果。

本发明主题另外提供了一种用于制备允许对多个不同短核酸片段同时进行测序的多聚体的方法。短核酸片段可以短至基本上20个bp，至多长度为数百个碱基对。所述多聚体允许通过被配置成对范围约为基本上1,000-10,000个bp的长核酸片段或比基本上2,000更长或长度高达基本上100,000个bp且更多的核酸片段进行测序的平台，例如纳米孔测序平台，对来自不同来源的短核酸片段同行测序，同时允许根据获得的序列标识每个片段的来源。

本发明主题另外提供了一种用于制备允许在ROI中的突变与引入到获得的序列中的，例如由测序方法的准确性差而引起的误差和在所述ROI扩增期间引入的误差之间进行区分的多聚体的方法。

本发明主题进一步提供一种用于分析通过对长核酸片段进行的测序，例如纳米孔测序而获得的核酸序列，同时在ROI中的突变与通过所述方法自身引入到所述ROI中的误差，例如测序中的误差和在所述ROI扩增期间引入的误差之间进行区分的方法。

当对短核酸片段进行测序时，本发明主题的多聚体显著提高了核酸测序读数的准确性。短核酸片段可以短至基本上20个bp，至多长度为数百个碱基对。所述多聚体允许通过被配置成对范围约为基本上1,000-10,000个bp的长核酸片段或比基本上2,000更长或长度高达基本上100,000个bp且更多的核酸片段进行测序的平台，例如纳米孔测序平台对来自不同来源的短核酸片段进行测序。此多聚体然后可以用于例如诊断具有高灵敏度和特异性的遗传变异。

根据一个实施例，所述多聚体包括多个单元。单元的各个示例性实施例在图1A-K中展示。

这里是对单元1的结构和组成的实施例的简要描述，然后是对单元1的各个组成的实施例的详细描述。

根据一个实施例，单元1包括片段12和附接到片段12的端部的至少一个分隔子11。例如，分隔子11可以附接到片段12的5'端，如图1A所展示的；分隔子11可以附接到片段12的3'端，如图1B所展示的；分隔子11可以附接到片段12的5'端，并且分隔子11可以附接到片段12的3'端，如图1C所展示的；多于一个分隔子11可以附接到片段的5'端(未示出)；多于一个分隔子11可以附接到片段12的3'端(未示出)；多于一个分隔子11可以附接到片段12的5'端，并且分隔子11可以附接到片段12的3'端，如图1D所展示的；分隔子11可以附接到片段12的5'端，并且多于一个分隔子11可以附接到片段12的3'端，如图1E所展示的；或者多于一个分隔子11可以附接到片段12的5'端，并且多于一个分隔子可以附接到片段12的3'端，如图1F所展示的。

根据一个实施例，分隔子11可以是索引子14。根据另一个实施例，分隔子11可以是导引子18。根据又另一个实施例，分隔子11可以是封闭子19。根据另外的实施例，片段12与上述三种类型的分隔子11–索引子14、导引子18和封闭子19中的至少一种的任何组合在本发明主题的范围内。根据另外的实施例，分隔子11可以是标识子16。根据又另外的实施例，仅当另一种种类的至少一个分隔子11，即索引子14、导引子18、封闭子19或其任何组合附接到片段12时，标识子16附接到片段12上。图1G和1H展示了单元1的示例性实施例，所述单元包括片段12、索引子14、标识子16、导引子18和封闭子19。

应当注意，由于片段12和单元1中的其它组成的大量任选组合，因此在附图中仅展示了组合的可能组合中的仅一些组合。然而，通过提及书面描述和附图，本领域的技术人员还将理解附图中未精确展示的实施例。

根据一个实施例，片段12是期望进行分析的靶核酸序列。此片段12也可以被称为ROI。本领域已知的任何靶核酸序列在本发明主题的范围内，例如其中出于本领域已知的任何目的，例如诊断基于基因的疾病，如癌症、遗传病症等，或出于研究目的等寻求突变的基因或基因的一部分。片段12可以呈任何期望的长度。根据一个实施例，片段12为基本上10-100个bp长。根据另一个实施例，片段12为几百个碱基对长，高达基本上1,000个bp长。根据一些其它实施例，片段12的长度可以高达基本上100个bp，或者高达基本上200个bp，或者高达基本上300个bp，或者高达基本上400个bp，或者高达基本上500个bp，或者高达基本上600个bp，或者高达基本上700个bp，或者高达基本上800个bp，或者高达基本上900个bp。根据一个优选实施例，片段12的长度可以在基本上100-500个bp的范围内。

如本领域的技术人员可以理解的，在片段12的制备期间，获得了片段12的多个副本。根据一个实施例，在样品中，片段12的副本相同，即具有相同的核酸序列。此实施例的实例是含有相同靶序列的副本的样品。根据另一个实施例，在样品中，片段12的副本相似，即部分相同。此实施例的一个实例是含有相同靶序列的在一些核苷酸方面不同的副本的样品，例如由于在片段的扩增期间引入的点突变。另一个实例是部分重叠，从而导致在样品中在片段的副本之间片段12的序列的一个或多个部分相同，而在片段12的副本之间片段12的其它部分不同的单元12。根据又另一个实施例，样品中片段12的副本彼此不同。此实施例的一个实例是含有片段12的在基因组中具有不同基因座的序列，如不同基因的样品。

片段12可以通过本领域已知的任何方法和机制来获得。根据一个实施例，片段12可通过剪切核酸，例如剪切基因组DNA、总核糖核酸(RNA)、信使核糖核酸(mRNA)等获得。本领域已知的任何类型的核酸都在本发明主题的范围内。根据此实施例，为了制备单元1，通过本领域已知的任何方法，例如通过将其与片段12连接来将前述组成，即索引子14、导引子18和封闭子19的至少一部分附接到片段12，以获得本文所述的单元1的实施例。

根据另一个实施例，片段12可以通过本领域已知的任何核酸扩增方法，例如PCR，使用限定片段12的期望的序列的正向和反向引物等来获得。片段12的扩增阶段在下文中偶尔可以被称为“片段12扩增”或“第一扩增”，因为在下文描述的方法中可以存在第二扩增阶段。因此，在通过使用两个引物，如PCR进行片段12扩增的情况下，用于片段12扩增的正向引物对片段12的5'端处的序列具有特异性，并且用于片段12扩增的反向引物对片段12的3'端处的序列具有特异性；或反之亦然，即用于片段12扩增的正向引物对片段12的3'端处的序列具有特异性，并且用于片段12扩增的反向引物对片段12的5'端处的序列具有特异性。用于片段12扩增的模板可以是本领域已知的可以作为片段12的来源的任何模板，例如基因组DNA、cDNA文库、总RNA、信使RNA(mRNA)等。

根据一个实施例，索引子14是片段12的来源独有的核酸序列。换言之，所有单元1的从相同来源获得的片段12包括具有相同序列的索引子14，而单元1的从不同来源获得的片段12包括具有不同序列的索引子14。来源可以是例如从其获得片段12的个体。因此，索引子14被配置成对片段12的来源加标签。应当注意的是，包括片段12的单元1源自相同来源，并且因此包括相同索引子14，可以包括如以上描述的相同或相似或不同的片段12以及其任何组合。索引子14的长度可以是允许对每个来源唯一加标签的任何长度。例如，索引子14的长度基本上是12个bp。然而应当注意的是，这仅是示例性长度，并且索引子14的任何长度都在本发明主题的范围之内。根据另外的实施例，索引子14可以附接到片段12的5'端，如图1G所展示的，或者索引子14可以附接到片段12的3'端，如图1H所展示的。

根据一个实施例，索引子14可以被分为多个部分索引子14。根据另一个实施例，至少一个部分索引子14可以附接到片段12的一侧，例如，附接到片段12的5'端。根据另一个实施例，至少一个部分索引子14可以附接到片段12的另一侧，例如附接到片段12的3'端。根据又一个实施例，至少一个部分索引子14可以附接到片段12的5'端，并且至少一个部分索引子14可以附接到片段12的3'端。例如，索引子14可以被分为两个部分索引子14，并且每个部分索引子14可以附接到片段12的两个端部中的任何一个端部。例如，12个bp长的索引子14可以被分为长度为6个bp的第一部分索引子14-1和长度为6个bp的第二部分索引子14-2。第一部分索引子14-1可以附接到片段12的一个端部，并且第二部分索引子14-2可以附接到片段12的另一个端部。此实施例在图1I中展示，所述图示出了附接到片段12的3'端的第一部分索引子14-1和附接到片段12的5'端的第二部分索引子14-2。

根据一个实施例，标识子16是片段12的每个副本独有的核酸序列。不同标识子16序列附加到片段12的每个副本。因此，标识子16被配置成对片段12的每个副本加标签。在下文描述的方法中，例如通过PCR扩增单元1，并且在随后阶段中，分析单元1的多个副本的序列。单元1的包括相同标识子16的片段12的序列被视为是从相同来源的片段12或原始靶序列扩增的。因此，如将在下文中讨论的，可以在原始片段12中的突变或原始靶序列与在程序期间引入的误差之间进行区分。标识子16的长度可以是允许对片段12的每个副本唯一加标签的任何长度。例如，标识子16的长度基本上为12个bp。然而应当注意的是，这仅是示例性长度，并且标识子16的任何长度都在本发明主题的范围内。

根据一个实施例，标识子16可以被分为多个部分标识子16。根据一个实施例，至少一个部分标识子16可以附接到片段12的一侧，例如附接到片段12的5'端。根据另一个实施例，至少一个部分标识子16可以附接到片段12的另一侧，例如附接到片段12的3'端。根据又一个实施例，至少一个部分标识子16可以附接到片段12的5'端，并且至少一个部分标识子16可以附接到片段12的3'端。例如，标识子16可以被分为两个部分标识子16，并且每个部分标识子16可以附接到片段12的两个端部中的任何一个端部。例如，12个bp长的标识子16可以被分为长度为6个bp的第一部分标识子16-1和长度为6个bp的第二部分标识子16-2。第一部分标识子16-1可以附接到片段12的一个端部，并且第二部分标识子16-2可以附接到片段12的另一个端部。此实施例在图1J中展示，所述图示出了附接到片段12的3'端的第一部分标识子16-1和附接到片段12的5'端的第二部分标识子16-2。图1K展示了单元1的另一个示例性实施例，所述单元包括如以上描述的附接到片段12的两侧的两个部分索引子14和两个部分标识子16。

根据一个实施例，索引子14附接到片段12的一个端部(未示出)。根据另一个实施例，单元1包括附接到片段12的一侧的索引子14和附接到片段12的相对侧的标识子16两者。如在图1G中可以看到的，根据一个实施例，索引子14附接到片段12的5'端，并且标识子16附接到片段12的3'端。如在图1-H中可以看到的，根据另一个实施例，索引子14附接到片段12的3'端，并且标识子16附接到片段12的5'端。根据另外的实施例，索引子14和标识子16两者附接到片段12的一侧，例如附接到片段12的5'端或片段12的3'端(未示出)。

根据一个实施例，导引子18包括被配置成标记单元1的端部的核酸序列。根据另一个实施例，封闭子19包括被配置成标记单元的端部的核酸序列。导引子18和封闭子19被配置成充当在单元1的扩增过程期间用于粘接引物的靶序列。根据另一个实施例，导引子18和封闭子19被配置成在多聚体100的制备期间参与单元1的任何其它操纵。例如，如在下文中详细描述的，导引子18和封闭子19在滚环扩增(RCA)方案中可以充当分子倒置探针(MIP)，也被称为Padlocks。根据又另一个实施例，可以在分析多聚体100的序列期间使用导引子18和封闭子19来指定单元1的边界，并且此外指定片段12在单元1中的方向，因为根据一些实施例，其相对于片段12的定位是在单元1的制备期间定义的。本领域已知的任何核酸扩增方法都在本发明主题的范围内。在单元1包括导引子18和封闭子19的实施例中，导引子18和封闭子19被配置成在涉及使用两个引物，例如PCR的单元1的扩增过程期间充当用于粘接两个引物的靶序列。例如，在通过PCR扩增的实施例中，在扩增循环期间，导引子18被配置成与正向引物粘接，而封闭子19被配置成与反向引物粘接，或反之亦然。另外，在以下描述的方法中，分析了彼此顺序地附接的单元1的序列。由于在一些实施例中，导引子18定位在单元1的一个端部处，并且在其它实施例中，导引子18和封闭子19定位在单元1的相对端部处，因此导引子18或导引子18和封闭子19还被配置成指示单元1序列的边界。

根据一个实施例，导引子18可以定位在单元1的两个端部中的任何一个端部处–在单元1的5'端处或在单元1的3'端处。根据另一个实施例，封闭子19可以定位在单元1的两个端部中的任何一个端部处–在单元1的5'端处或在单元1的3'端处。根据又另一个实施例，单元1包括导引子18和定位在单元1的相对端部处的封闭子19。根据一个实施例，在图1G-K中所展示的，导引子18定位在单元1的5'端处，并且根据另一个实施例封闭子19定位在单元1的3'端处。

根据一个实施例，在例如通过核酸剪切或通过片段12扩增获得片段12之后，通过当至少一个分隔子11可以是根据本文描述的实施例的索引子14或标识子16或导引子18或封闭子19或其任何组合时，将至少一个分隔子11附接到片段12来制备单元1。将至少一个分隔子11附接到片段12可以通过本领域已知的任何方法，例如通过将至少一个分隔子11连接到片段12以获得本文所述的单元1的实施例。

根据另一个实施例，至少一个分隔子11附接到片段12是在片段12的扩增期间执行的。根据此实施例，用于扩增片段12的一个或多个引物包括具有至少一个分隔子11的序列的尾部，例如根据本文描述的实施例的索引子14或标识子16或导引子18或封闭子19或其任何组合。

图2A-B分别示意性地展示了根据示例性实施例的用于采用两个引物，例如PCR来进行片段12扩增的正向引物和反向引物。图2A中展示的，用于片段12扩增的正向引物20包括对片段12的5'端具有特异性的特异性Fwd 122序列、附接到特异性Fwd 122序列的5'端的索引子14序列尾部以及附接到索引子14序列的5'端的导引子18序列尾部。图2B中展示的，用于片段12扩增反向引物30包括对片段12的3'端具有特异性的特异性Rev 124序列、附接到特异性Rev 124序列的3'端的标识子16序列尾部以及附接到标识子16序列的3'端的封闭子19序列尾部。本领域的技术人员可以认识到，图2A-B中所展示的引物在片段12扩增之后，产生了图1G中展示的单元1的实施例。这是仅示例性实施例。为了获得单元1的其它实施例，例如在图1H-K中展示的那些，用于片段12扩增的引物相应地如本领域的技术人员可以认识到的来布置。

图2A-B中指定，特异性Fwd 122序列和特异性Rev 124序列的长度范围在基本上20-25个bp的范围内。应当注意的是，特异性Fwd 122序列和特异性Rev 124序列的此长度范围是仅示例性的，并且特异性Fwd 122序列和特异性Rev 124序列的任何长度在本发明主题的范围内。类似地，应该注意的是，图2A-B中示出的索引子14、标识子16、导引子18和封闭子19的序列是仅示例性的，并且索引子14、标识子16、导引子18和封闭子19可以具有呈任何长度的任何序列。另外，索引子14、标识子16、导引子18和封闭子19序列在正向引物20和反向引物30中的布置是仅示例性的。这些元素(索引子14、标识子16、导引子18和封闭子19)的任何布置和存在以及索引子14或标识子16或索引子14和标识子16两者到多个部分的任何类型划分在本发明主题的范围内，例如，根据本文中所描述的实施例。

根据一个实施例，关于通过某个序列的扩增产生的片段12，片段12扩增包括少量的扩增循环，以避免由于用于片段12扩增的DNA聚合酶的校对差而引起的片段12中的误突变。产生充足量的扩增子以在一方面用作单元1扩增的模板，同时在另一方面最小化通过DNA聚合酶引入的误突变的量的片段12扩增的任何循环数量在本发明主题的范围内。片段12扩增的示例性循环数量是基本上3-5个循环。但是，应当指出的是，片段12扩增的此循环数量不应被视为限制本发明主题的范围。

根据一个实施例，通过本领域已知的，例如根据上述实施例的任何方法–核酸剪切和连接、片段12扩增和连接以及利用如以上描述的含有尾部的引物进行的片段12扩增制备的单元1被扩增。

根据一个实施例，在单元1的扩增中使用的正向引物对于导引子18具有特异性，并且在单元1的扩增中使用的反向引物对于封闭子19具有特异性。应当注意的是，在此实施例中，单元1扩增的正向引物和反向引物不包括索引子14和标识子16序列。因此，单元1中包含的索引子14和标识子16的序列通过单元1扩增中使用的DNA聚合酶来扩增。因此，单元1扩增被配置成扩增先前制备的单元1。根据另一个实施例，用于单元1扩增的引物，不论是正向引物还是反向引物都可以包括索引子14的至少一部分。根据又另一个实施例，用于单元1扩增的正向引物可以包括索引子14的一部分，并且用于单元1扩增的反向引物可以包括索引子14的一部分。

根据一个实施例，关于在多聚体100的制备期间彼此连接的片段12，经扩增的单元1是双链DNA。根据另一个实施例，单元1的每个链的5'端被磷酸化。用于使单元1的链的5'端磷酸化的任何方法都在本发明主题的范围内。例如，可以用被配置成向DNA链的5'端添加磷酸基的酶将经扩增的单元1的5'端磷酸化。另一个实例是使用单元1扩增的在其5'端被磷酸化的引物。

通过将单元1彼此连接来制备允许通过被配置成对在基本上1,000-10,000个bp的范围内的长核酸片段进行测序的平台，例如，纳米孔测序平台对例如在基本上100-500个bp或200-300个bp等范围内的短核酸片段进行测序的多聚体，从而产生例如在基本上1,000-10,000个bp的范围内的长核酸片段。

图3A-B示意性地展示了根据示例性实施例的允许对短核酸片段进行测序的多聚体。此多聚体在下文被指定为“多聚体100”。根据图3A中展示的一个实施例，当单元1中的至少一些单元在片段12的序列方面有所不同时，多聚体100包括多个单元1。在此实施例中，单元1的至少一个分隔子11可以是相似的或不同的。这些不同单元在图3A中展示为单元1、单元2、单元3等，直到单元N。单元1可以在彼此相对的任何方向上。多聚体100的长度是适于通过被配置成对长核酸序列进行测序的测序方法，例如纳米孔测序进行测序的长度。因此，例如，多聚体100的长度可以在基本上1,000-10,000个bp，甚至高达基本上100,000个bp以及更多的范围内。单元1可以通过本领域已知的任何方法，例如连接，彼此顺序地附接。

用于将单元1彼此顺序地附接的示例性连接程序在下文中被称为“超连接”。如本领域已知的超连接方法使用端部修复酶来将单元1转化为经5'磷酸化的齐平端单元1。然后，例如通过连接酶，如T4 DNA连接酶，连接经5'磷酸化的齐平端单元1。这可能导致包括多个单元1的多聚体100彼此顺序地附接。由于自连接，多聚体100中的一些多聚体可以是线性的，并且多聚体100中的一些多聚体可以是圆形的。另外，多聚体100的长度可以变化，即每个多聚体100可以包括不同数量的单元1。

用于将单元1彼此顺序地附接的另一个示例性连接程序在下文中被称为“金门组装(golden gate assembly)”或GGA，如本领域中已知的。GGA最初被开发以用于使用仅单个IIS型限制酶和DNA连接酶，例如T4 DNA连接酶将多个插入件连接到载体主链。IIS型限制酶的独特之处在于，其在DNA片段的有义链和反义链两者上，在其识别位点下游以已知距离切割，由此生成可以用作特定粘性端的突出端，以用于连接。此程序的优点在于，在消化之后，当粘性端连接时，相邻连接的DNA片段之间的接触点附近的碱基序列不再含有识别位点，并且因此尽管反应混合物中存在限制酶，但片段仍保持连接。

关于本发明主题，GGA可以在没有载体的情况下使用，以顺序地连接单元1并且产生多聚体100。另外，GGA可以用于以预定次序产生具有预定数量的经连接的单元1的多聚体100。这可以通过在单元1中的适当位置处设计IIS型限制酶的对于每个单元1不同的识别位点来实现，由此在不同单元1中产生序列不同的粘性端。换言之，单元1的每种类型包括其粘性端的不同序列。GGA中可以使用的示例性IIS型限制酶是Esp3I，其限制位点远离其识别位点在其有义链和反义链下游分别为1个和5个核苷酸，由此产生4个核苷酸的粘性端。为了实现这一点，使用每个连续单元的独有的并且指示单元1连接的次序的引物。利用GGA程序进行的一些初步实验示出，可以使用GGA以预定次序顺序地连接至多六个不同的单元1。

图3A中展示的先前描述的多聚体100包括其片段12的序列彼此不同的多个单元1。根据图3B中展示的另一个实施例，多聚体100可以包括具有相似序列的单元1，即，包括相同片段12、导引子18、索引子14、标识子16和封闭子19。这些单元1在图3B中展示为单元1，以指定其相似性。然而，在含有多个此类多聚体100的样品中，多聚体100至少在其单元1的组成之一——片段12、导引子18、索引子14、标识子和封闭子19方面可以彼此不同。而且，根据此实施例的含有多聚体100的样品适合于通过纳米孔测序平台，例如MinIon(英国牛津纳米孔技术公司)进行序列分析。

用于产生包括相似单元1的多聚体100的示例性程序是以下中描述的滚环扩增(RCA)方案：例如“Wilson,B.D.、Eisenstein,M.和Soh,H.T.,《超短DNA靶标的超高保真纳米孔测序(High-fidelity Nanopore Sequencing of Ultra-Short DNA Targets)”,《分析化学(Anal.Chem.)》，2019，91，6783-6789，发表于2019年4月30日”，所述文献的整个内容通过引用并入本文。

在此实例中，单元1作为多聚体100的构建块，包括根据本文所述的实施例的导引子18、索引子14、片段12、标识子16和封闭子19。RCA方案产生了呈DNA分子形式的作为单元1的串联重复序列的多聚体100。如本领域已知的，RCA方案包括：分子倒置探针(MIP)的设计，所述MIP为被配置成与单元1的5′端和3′端匹配的单链DNA分子；将MIP粘接到单元1的5′端和3′端；使单元1循环；使互补DNA链聚合，以产生呈圆形双链DNA形式的圆形单元1；去除剩余单链DNA分子，例如，通过使用具有核酸外切酶活性的酶；以及用本领域已知的适合于RCA的任何DNA聚合酶，例如29 DNA聚合酶扩增圆形单元1。此方案的产物是呈线性单链DNA分子的包括相似单元1的多聚体100；并且如果不同单元1的混合物受到此方案的约束，则在多聚体100之间单元1可能存在不同的同时，当每个多聚体100包括相似单元1时，方案的产物是不同多聚体100的混合物。通过RCA方案获得的多聚体100可以呈几千个核苷酸，以及甚高达数以万计的核苷酸的长度。

多聚体100被配置成通过本领域已知的用于对，例如，在基本上1,000-10,000个bp的范围内以及甚至高达基本上100,000个bp和更多的长片段进行测序的任何方法，如纳米孔测序，更具体地Oxford纳米孔技术，进行测序的任何方法进行测序。此测序的结果是整个多聚体100的核苷酸序列。测序方法的直到获得多聚体100的核苷酸序列的任何步骤都在本发明主题的范围之内。这可以包含例如序列的碱基调用，即将原始数据从测序仪器转化到核苷酸序列。这还可以包含数据清除，即修整损坏的序列和与多聚体100的序列无关的序列，例如非常低质量的序列或属于测序程序的元件的序列，例如衔接子和作为纳米孔测序方法的一部分的对照序列。

本发明主题提供了一种用于分析以上描述的多聚体100的序列的方法。用于分析多聚体1的序列的所述方法包括：

将单元1的序列彼此分开。这是通过标识单元1的端部的序列并且将其在端部之间分开完成的。在另一端部中，通过以下将单元1的序列彼此分开：在相邻单元1的端部之间的边界处切割多聚体100；

将具有相同索引子14的单元1分组，以用于获得相同索引子14组。换言之，在此阶段，根据靶序列的来源将单元1分类。例如，一个个体的序列由于其具有相同索引子14而被一起分组，同时另一个体的序列由于其具有另一个索引子14而被单独分组；

在前一步骤所获得的每个组中，将具有相同片段12序列的单元1分组，以获得相同片段12组。在此阶段，每个来源，例如每个个体的单元1被分组在靶核酸的单独组中，例如单独基因。这是通过将具有相同片段12序列的单元1分组在一个组中实现的；

在前一步骤所获得的每个组中，将具有相同标识子16序列的单元1分组，以获得相同标识子16组。在此阶段，将从片段12的相同副本获得的单元1分组在一个组中。另一方面，包括不同片段12，甚至略微不同的片段12的单元1包括不同标识子16，并且因此在此阶段被分组在不同标识子16组中。如以上所描述的，单元1包括某个靶序列，即某个片段12的各个副本。用不同标识子16对每个副本加标签，并且然后在单元1扩增中对加标签的单元1进行扩增。因此，在单元1扩增期间扩增靶序列，即片段12的每个副本，并且可以在扩增期间如本领域已知的将误差引入到片段12中。另外，在测序期间，可以获得读取片段12的序列的误差。因此，将具有相同标识子16序列的单元1分组的此阶段是重要的，因为其允许标识由于程序引起的片段12序列的误差并且消除所述误差，同时标识靶序列的寻求诊断目的的突变。在由于程序引起的片段12序列的误差与靶序列的突变之间进行区分是容易的，因为靶序列的突变在用相同标识子16加标签的所有片段12中检测到，同时由于程序引起的误差可以仅在用相同标识子16加标签的一个或几个片段12中检测到。因此，在将具有相同标识子16序列的单元1分组在每个相同片段12组中之后，下一个步骤是：

将每个相同标识子16组中的多个片段12序列折叠为准确地代表了根据片段12所获得的靶序列的序列的单个序列。在折叠期间，如以上描述的消除了由于程序而引起的序列的误差。

根据一个实施例，根据索引子14、片段12和标识子16对单元1的序列进行的分组的次序是仅示例性的。根据索引子14、片段12和标识子16进行分组的任何可能的次序都在本发明主题的范围之内。

根据一个实施例，用于分析多聚体100的序列的方法进一步包括在每个相同标识子16组中将多个片段12序列折叠成单个序列之后，将通过与靶序列的已知序列折叠获得的序列进行比较，以标识靶序列(片段12)的经折叠的序列相比于靶序列的已知序列的变体。

根据另一个实施例，用于分析多聚体100的序列的方法进一步包括在将通过与靶序列的已知序列折叠获得的序列进行比较之后，报告在变体中发现的突变。

本发明主题提供了一种用于制备单元1，例如上述单元1的方法。以下方法用于制备包括片段12、索引子14和标识子16、导引子18和封闭子19的单元1。所述方法包括：

获得片段12；

将索引子14、标识子16、导引子18和封闭子19附接到片段12，其中导引子18和封闭子19定位在由于附接而获得的片段的端部处；

用对导引子18和封闭子19具有特异性的引物扩增所获得的片段；

产生多个单位1。

根据一个实施例，用于制备单元1的方法进一步包括：将多个单元1的链的5'端磷酸化。

根据一个实施例，本发明主题进一步提供了一种用于制备多聚体100，例如以上描述的多聚体100的方法，所述方法包括：

顺序地附接多个单元1。

本发明主题进一步提供了用于制备多聚体100，例如以上描述的多聚体100的方法的另一个实施例。以下方法基于包括索引子14、标识子16、导引子18和封闭子19的单元1的实施例。所述方法包括：

获得片段12；

将索引子14、标识子16、导引子18和封闭子19附接到片段12，其中导引子18和封闭子19定位在由于附接而获得的片段的端部处；

用对导引子18和封闭子19具有特异性的引物扩增所获得的片段；

产生多个单元1；

将所述多个单元1的链的5'端磷酸化；以及

顺序地附接所述多个单元1。

应当注意，用于制备单元1和多聚体100的前述方法也适用于包括组成索引子14、标识子16、导引子18和封闭子19中的仅至少一个的单元1的实施例。在此类情况下，所述方法可以包括如本领域的技术人员可以理解的必要改变。

根据一个实施例，获得片段12是通过破坏多核酸。本领域已知的用于破坏多核酸的任何方法都在本发明主题的范围内，例如多核酸的剪切和酶促片段化。

根据另一个实施例，多核酸是基因组DNA。

根据另一个实施例，多核酸是总RNA。

根据仍另一个实施例，多核酸是mRNA。

根据一个实施例，获得片段12是通过用对片段12具有特异性的一个或多个引物来扩增片段12。

根据一个实施例，将索引子14、标识子16、导引子18和封闭子19附接到片段12是通过将索引子14、标识子16、导引子18和封闭子19附接到对片段12具有特异性的引物并且扩增片段12，其中索引子14附接到正向或反向片段12特异性引物的5'端，标识子16附接到其余反向或正向片段12特异性引物的5'端，导引子18附接到索引子14或标识子16的5'端，并且封闭子19附接到其余标识子16或索引子14的5'端。此实施例是仅示例性的。基于本文给出的描述，本领域的技术人员应该能够产生单元1的其它实施例。

另外，本发明主题提供了一种装置或系统，所述装置或系统被配置成执行本文所述的方法。

根据一个实施例，提供了一种被配置成执行上述所有方法的装置。通常，所述装置被配置成获得核酸样品并且制备如本文所述的片段12，制备如本文所述的单元1，制备如本文所述的多聚体100，通过本领域已知的任何方法确定多聚体100的核酸序列，并且分析如本文所述的所获得的核酸序列。换言之，所述装置被配置成在执行前述方法的同时获得包括靶核酸序列的至少一个样品，并且提供对核酸序列，包含关于靶序列中的突变的信息的准确分析。本领域已知的如被配置成自动地或半自动地执行前述方法的任何装置在本发明主题的范围内。

根据另一个实施例，本发明主题还提供了一种系统，所述系统包括单独地或组合地被配置成执行本文所述的方法的多个组件，换言之，多于一个组件。通常，所述系统被配置成获得核酸样品并且制备如本文所述的片段12，制备如本文所述的单元1，制备如本文所述的多聚体100，通过本领域已知的任何方法确定多聚体100的核酸序列，并且分析如本文所述的所获得的核酸序列。换言之，所述系统被配置成在执行前述方法的同时获得包括靶核酸序列的至少一个样品，并且提供对核酸序列，包含关于靶序列中的突变的信息的准确分析。本领域已知的如被配置成自动地或半自动地执行前述方法的任何系统在本发明主题的范围内。另外，本领域已知的被配置成执行前述方法中的至少一种方法并且可以作为所述系统的一部分的任何组件都在本发明主题的范围内。此外，系统的组件可以组装在一个地方或者可以彼此分开。

实例

实例1：片段12扩增的引物

对于待测试的每个突变–针对允许某个靶序列，也被称为“片段12”扩增的引物定位特异性序列，而用于片段12扩增的引物具有期望的待所测试位置。扩增子大小为例如基本上200-400个bp长，引物的熔融温度(Tm)为基本上63-65℃，并且引物长度为基本上18-26个bp。氨基酸位置V600处的BRAF突变的特异性引物(正向和反向)的实例：

正向–AGCCTCAATTCTTACCATCCAC

反向–CTTCATAATGCTTGCTCTGATAGG

对于第一阶段引物的每个突变特异性序列，添加以下独特元件。

索引子：正向特异性序列的(12个碱基)5'(例如-CGTGATCGTGAT)。

导引子：在索引子添加24个碱基(正向引物实例-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT)。

导引子的长度和序列可根据外部Fwd引物序列而变化。

标识子：反向特异性引物的5'端处的12个随机碱基(12×N)。

封闭子：在标识子上游添加21个碱基(反向引物-AATGATACGGCGACCACCGAG)。

封闭子的长度和序列本身可以根据Rev引物序列而变化。

实例2：单元1扩增的引物

用于单元1扩增的引物被设计成对每个片段12扩增扩增子起作用。引物包括：

具有导引子的序列的正向引物。正向引物可以包括5'磷酸基。正向引物还可以包括三个3'碱基之间的具有或不具有5'磷酸基的两个硫代磷酸酯(PS)键。

具有封闭子的序列的反向引物。反向引物可以包括5'磷酸基和第1到第2碱基与第2到第3 3'碱基之间的两个硫代临酸酯(PS)键。

实例3：片段12扩增和单元1扩增

程序包括片段12扩增反应和单元1扩增反应，每个扩增反应都具有如上所述的独特引物。片段12扩增旨在制备用于单元1扩增的靶区域。单元1扩增扩增仅在片段12扩增期间产生的扩增子。

实例4：片段12扩增

将以下组分添加到无菌带管中：

将50μl或100μl移液器设置为20μl，并且然后将整个体积上下移液至少10次以彻底混合。执行快速旋转以从管的侧面收集所有液体。

将管放置在热循环仪上，并且使用以下循环条件执行扩增：

扩增程序可以根据所使用的聚合酶进行更改和调整。

实例5：单元1扩增

当片段12扩增程序保持在10℃下，仔细地添加片段12扩增的引物(来自每种引物1μl、5-10μM)，并且使扩增程序继续。

实例6：来自扩增反应的片段12的清除

清洁来自前一步骤的产物，以用于与AMPure XP磁珠(贝克曼库尔特有限公司(BeckmanCoulter))进一步反应。

使用AMPure XP珠时，在使用前允许珠温热到室温至少30分钟，并且牢固地涡旋珠以进行重悬。使用AMPure XP珠以用于最佳实践或制造商方案，以用于>250个bp大小选择：

向扩增反应添加基本上0.4X(对于25μl扩增使用10μl经重悬的珠)。通过上下移液至少10次来充分混合。

在室温下将样品在台上温育至少5分钟。

将管/板放置在适当磁架上，以将珠与上清液分离。

5分钟之后(或当溶液澄清时)，小心去除并丢弃上清液。

当在磁架中时，向管/板添加200μl 80％新鲜制备的乙醇。在室温下温育30秒，并且然后小心去除并丢弃上清液。重复此步骤以进行第二次乙醇洗涤。确保在第二次洗涤之后，去除了所有可见液体。

当管/板处于磁架上，盖打开时，将珠风干至多5分钟。

从磁架去除管/板。将DNA从珠中洗脱到15μl无核酸酶的水中。

在涡旋混合器上或通过上下移液10次来充分混合。在室温下温育至少2分钟。

将管/板放置在磁架上。5分钟之后(或当溶液澄清时)，将13-15μl转移到新管中。

通过使用Qubit NanoDrop(或等效物)测量管中的dsDNA。

组合来自不同面板管的等量扩增子。

实例7：通过连接扩增子(单元1)制备多聚体100

使用T4 DNA连接酶(M0202，NEB公司)。

在冰上在微量离心管中建立以下反应。

*T4 DNA连接酶缓冲液应解冻并在室温下重悬。

**T4 DNA连接酶应最后添加。

通过上下移液来缓慢混合并且短暂微量离心。

在室温下温育2小时。

在65℃下灭活加热10分钟。

在冰上冷却。

实例8：连接反应的清除

清洁来自前一步骤的连接产物，以用于与AMPure XP磁珠(贝克曼库尔特有限公司(Beckman Coulter))进一步反应。

使用AMPure XP珠(贝克曼库尔特有限公司)时，在使用前允许珠温热到室温至少30分钟，并且将珠牢固地涡旋以重悬。使用AMPure XP珠以用于最佳实践或制造商方案，以用于>250个bp大小选择：

向扩增反应添加约0.1X(对于50μl扩增反应，使用5μl经重悬的珠)。通过上下移液至少10次来充分混合。

在室温下将样品在台上温育至少5分钟。

将管/板放置在适当磁架上，以将珠与上清液分离。

5分钟之后(或当溶液澄清时)，小心去除并丢弃上清液。

当在磁架中时，向管/板添加200μl 80％新鲜制备的乙醇。在室温下温育30秒，并且然后小心去除并丢弃上清液。重复此步骤以进行第二次乙醇洗涤。确保在第二次洗涤之后，去除了所有可见液体。

当管/板处于磁架上，盖打开时，将珠风干至多5分钟。

从磁架去除管/板。将DNA从微珠洗脱到20μl的10 mM Tris-HCl或0.1X TE中。

在涡旋混合器上或通过上下移液10次来充分混合。在室温下温育至少2分钟。

将管/板放置在磁架上。5分钟之后(或当溶液澄清时)，将17-20μl转移到新管中。

通过使用Qubit NanoDrop(或等效物)测量管中的dsDNA。

组合来自不同面板管的等量扩增子/片段。

实例9：通过滚环扩增(RCA)制备多聚体100

A.循环反应：

a.分别以3:4比率制备单元1与其互补MIP(200-500 nM)的混合物。所产生的混合物在下文中被称为“MIP-Unit 1混合物”。

b.向MIP-Unit 1混合物添加以下表中列示的试剂：

在95℃下温育3分钟，并且然后进行6个循环，在95℃下持续30秒，60.4℃下持续60秒，并且在37℃下持续120秒。

B.线性DNA的降解：

a.添加0.5μL核酸外切酶I(NEB公司，M0293S)和0.5μL核酸外切酶III(NEB公司，M0206S)。

b.在37℃下温育90分钟，然后在65℃下灭活20分钟。

C.滚环扩增：

a.将以上经核酸外切酶处理的循环产物与和导引子互补的正向引物、与如以下表中详述的聚合酶、dNTP和BSA混合。

b.在30℃下温育3-6小时，然后在60℃下灭活10分钟。

实例9：制备文库并且用Oxford纳米孔技术测序

遵循用于文库制备的方案之一：

快速测序试剂盒SQK-RAD004，试剂盒方案的整个内容通过引用并入本文；或者

连接测序试剂盒1D SSK-LSK109，试剂盒方案的整个内容通过引用并入本文。

应当注意，前述用于制备文库和用Oxford纳米孔技术测序的方法是仅示例性的。可以使用本领域已知的用于制备文库和对长核酸进行测序的任何方法。根据制造商的方案，通过使用牛津纳米孔技术平台(MinION、GridION)对文库进行测序，其整个内容通过引用并入本文。

实例10：数据分析

数据分析优选地通过生物信息技术执行，并且包含以上提及的步骤。

实例11：用于制备单元的替代性方法

先前，当用于片段12扩增的引物包含导引子、索引子、标识子和封闭子序列时，通过片段12扩增和第二扩增制备了用于连接的单元。这里描述了用于制备用于连接的单元的替代性方法。

通过连接缀合至少一个分隔子

通过连接缀合至少一个分隔子

在此阶段，靶基因组处的特定面板在扩增反应中扩增，而经扩增的扩增子未用至少一个分隔子加标签。在片段12的扩增反应之后，通过连接将至少一个分隔子附接到扩增子，并且进行第二扩增反应以扩增单元。

在此阶段，第一反应引物是用于稍后测序的期望的位置/面板的特异性引物，并且在其5'端处不包括任何元件。

此方案使用以下试剂作为推荐，但可以由替代性试剂/化合物代替：

1. Ultra^TM端部修复/dA尾部模块(NEB#E7442)。

2.超连接模块(NEB#E7445)。

3.双索引子UMI衔接子。

通常，程序包括以下：

扩增靶区域；

将衔接子与UMI连接；

用二级引物扩增经连接的片段(引物被设计为与衔接子的5'元件杂交)；

连接片段以制备经缀合的片段的长核酸片段；

制备用于长核酸片段的文库；

数据分析；

突变报告。

片段12扩增–期望的靶序列的扩增

使用高保真聚合酶和有限数量的循环(5-15，根据起始材料的数量)执行扩增反应。使用靶特异性引物。

扩增反应的清除(推荐)

清洁来自片段12扩增的产物，以用于与AMPure XP磁珠(贝克曼库尔特有限公司)或任何其它清除方案进行进一步反应，以消除来自前一阶段的残留元素，如引物和缓冲液。

端部修复/dA尾部

遵循 Ultra^TM端部修复/dA尾部模块(NEB#E7442)方案：

在无菌无核酸酶的管中混合以下组分：

(绿色)端部制备酶混合物-3.0μl；

(绿色)末端修复反应缓冲液(10X)-6.5μl；

来自前一步骤的扩增子-55.5μl；

通过移液混合，然后快速旋转以从管的侧面收集所有液体。

放置在热循环仪中，盖上经加热的盖，并且运行以下程序：

30分钟@20℃；

30分钟@65℃；

保持在4℃下。

直接进行到NEBNext超连接模块(NEB#E7445)：

如果端部修复之前的DNA输入<100ng，则在10mM Tris-HCl pH 7.5–8.0或具有10mMNaCl的10mM Tris-HCl pH 7.5–8.0中以1:10将双索引子UMI衔接子稀释到1.5μM的最终浓度。立即使用。

将以下组分直接添加到端部制备反应混合物并充分混合：

(红色)齐平/TA连接酶主混合物-15μl；

双索引子UMI适配器-2.5μl；

(红色)连接增强剂-1μl。

通过移液混合，然后快速旋转以从管的侧面收集所有液体。

在热循环仪中在20℃下温育15分钟。

DNA现在即可用于大小选择或清除。

扩增反应的清除(推荐)

清洁来自前一步骤的扩增产物，以用于与AMPure XP磁珠(贝克曼库尔特有限公司)或任何其它扩增清除方案进行进一步反应，以消除来自前一阶段的残留元素，如引物和缓冲液。

第二扩增

此阶段利用与单元中的外部元素杂交的引物扩增来自前一阶段的整个单元(如果使用双索引子UMI适配器，则外部元素将是P5和P7区域)。引物将具有5'磷酸基以用于进一步应用。

利用高保真聚合酶和有限数量的循环(5-15，根据起始材料的数量)执行第二扩增。使用一般扩增引物。如果使用双索引子UMI衔接子，则使用以下引物：

/Phos/CAAGCAGAAGACGGCATACGA,以及

/Phos/AATGATACGGCGACCACCGA)。

扩增反应的清除(推荐)

清洁第二扩增的产物，以用于与AMPure XP磁珠(贝克曼库尔特有限公司)或任何其它清除方案进行进一步反应，以消除来自前一阶段的残留元素，如引物和缓冲液。

如以上描述的连接获得的单元。

实例12：用于制备单元1和多聚体100的另一替代性方法

以下方案是从富集的靶扩增子构建多聚体的一个实例。方案的第一阶段是构建代表面板/基因组坐标的扩增子，然后是串联步骤。

方法是基于来自新英格兰生物实验室(New England Biolabs)的商业试剂和试剂盒。然而应当指出的是，本领域已知的产生以下方案的相似结果的任何试剂都在本发明的范围之内。

基于NEBNext Direct(NEB#E6631)程序的扩增子面板

在此阶段，基因组DNA(gDNA)被片段化，并且靶标富集有特定诱饵。此阶段的目的是仅靶向DNA位置的期望的面板(面板可以根据需求和需要定制，例如基因KRAS的外显子组)。

DNA片段化

解冻终止溶液。

在冰上设置以下反应。首先，在无菌无核酸酶的管中混合DNA、缓冲液和水。最后添加酶。

探针杂交

通过添加以下组分以进行适当数量的反应来制备杂交预混液。移液之前，涡旋杂交缓冲液以充分混合。

通过涡旋3-5秒来充分混合主混合物，并且短暂离心。

向来自章节1.1的片段化DNA的每个样品添加72μl的杂交主混合物，最终体积为122μl。通过上下移液10次进行混合。牢固地密封PCR板或帽管，以避免蒸发。

在加热盖设置为105℃的情况下运行以下程序，并在模块温度达到95℃时将样品放入热循环仪中：

在温育样品的同时，制备链霉亲和素珠(参见章节0中的《链霉亲和素珠制备(Streptavidin Bead Preparation)》)。

在60℃下温育之后并且当章节0(《链霉亲和素珠制备》)完成之后，解封管/孔，将样品留在60℃的热循环仪上，盖打开，并且进行到章节0中的《珠制备(Bead Binding)》。

链霉亲和素珠制备：

将抗生蛋白链菌素珠温热到室温(约15分钟)。

涡旋链霉亲和素珠以进行重悬。

对于每个反应，需要75μl的珠(82.5μl，10％过量)。在2ml的Eppendorf管中，添加适当体积的珠以用于执行多个反应。

将一个或多个管放置在磁上并且等待溶液澄清(约1分钟)。去除上清液，并且然后从磁上去除一个或多个管。

向珠添加每反应150μl杂交洗涤液(HW)(165μl，10％过量)，并且通过涡旋或移液重悬。

将一个或多个管放置在磁上并且等待溶液澄清(约1分钟)。去除上清液，并且然后从磁上去除一个或多个管。

重复步骤1.3.5–1.3.6两次，总计3次洗涤。

在每反应30μl的珠制备缓冲液中重悬珠(33μl，10％过量)。

将珠保持在室温下，直到探针杂交(章节0)完成。

珠结合

紧接着使用之前，在珠制备缓冲液中涡旋经洗涤的链霉亲和素珠(来自步骤0)以进行重悬。

当样品在处于60℃的热循环仪上同时，向每个反应添加30μl经重悬的珠(来自步骤0)，并且然后通过上下移液10次缓慢混合。

将热循环仪温度更改为48℃，并且将反应温育10分钟。

从热循环仪去除样品并且放置在磁上。等待溶液澄清(约15秒)，去除上清液，并且然后从磁中去除样品。

向每个样品添加150μl的HW。通过上下移液10次缓慢混合。

将样品放置在处于62℃下的热循环仪(盖打开)上，并且温育5分钟。

从热循环仪去除样品并且放置在磁上。等待溶液澄清(约15秒)，去除上清液，并且然后从磁中去除样品。

重复步骤0–0，在62℃下总计2次洗涤。

向每个样品添加150μl的珠洗涤缓冲液2(BW2)。通过上下移液10次缓慢混合。

DNA的3'齐平化

在将珠悬浮在BW2缓冲液中的同时，通过在无菌无核酸酶管中添加以下组分来制备3'齐平化主混合物，以进行适当数量的反应。移液前，涡旋3'齐平化缓冲液，以充分混合。

通过涡旋3–5秒来充分混合主混合物，并且短暂离心。

将DNA结合的珠放置在磁上并且等待溶液澄清(约15秒)。去除上清液，并且然后从磁上去除样品。

向每个样品添加100μl的3'齐平化主混合物(来自步骤0)。通过上下移液10次缓慢混合。在热循环仪上在37℃下将样品温育10分钟，热循环仪盖打开。

立即进行反应后洗涤(章节0)。

反应后洗涤

将样品放置在磁上并且等待溶液澄清(约15秒)。去除上清液，并且然后从磁上去除样品。

向每个样品添加150μl的珠洗涤缓冲液1(BW1)。通过上下移液10次缓慢混合。将样品放置在磁上并且等待溶液澄清(约15秒)。去除上清液，并且然后从磁上去除样品。

向每个样品添加150μl的BW2。通过上下移液10次缓慢混合。

dA尾部

在将珠悬浮在BW2缓冲液中的同时，通过在无菌无核酸酶管中添加以下组分来制备dA尾部主混合物，以进行适当数量的反应。移液之前，涡旋dA缓冲液以充分混合。

通过涡旋3–5秒来充分混合主混合物，并且短暂离心。

将DNA结合的珠放置在磁上并且等待溶液澄清(约15秒)。去除上清液，并且然后从磁上去除样品。

向每个样品添加100μl的dA尾部缓冲液(来自步骤0)。通过上下移液10次缓慢混合。在热循环仪上在37℃下将反应温育10分钟，热循环仪盖打开。

立即进行反应后洗涤。

反应后洗涤

将样品放置在磁上并且等待溶液澄清(约15秒)。去除上清液，并且然后从磁上去除样品。

向每个反应添加150μl BW1，并且然后通过上下移液10次缓慢混合。将样品放置在磁上并且等待溶液澄清(约15秒)。去除上清液，并且然后从磁上去除反应。

向每个样品添加150μl的BW2。通过上下移液10次缓慢混合。

3'衔接子连接

在将珠悬浮在BW2缓冲液中的同时，通过在无菌无核酸酶管中添加以下组分来制备3'衔接子连接主混合物，以进行适当数量的反应。移液之前，涡旋衔接子连接缓冲液以充分混合。

通过涡旋3–5秒来充分混合主混合物，并且短暂离心。

将DNA结合的珠放置在磁上并且等待溶液澄清(约15秒)。去除上清液，并且然后从磁上去除样品。

向每个样品添加100μl的3'衔接子连接主混合物。通过上下移液10次缓慢混合。

在热循环仪上在20℃下将样品温育15分钟，热循环仪盖打开。

立即进行连接后洗涤。

连接后洗涤

将样品放置在磁上并且等待溶液澄清(约15秒)。去除上清液，并且然后从磁上去除样品。

向每个样品添加150μl的BW1。通过上下移液10次缓慢混合。将样品放置在磁上并且等待溶液澄清(约15秒)。去除上清液，并且然后从磁上去除样品。

重复前一步骤，在BW1中总计2次洗涤。

向每个样品添加150μl的BW2。通过上下移液10次缓慢混合。

DNA的5'齐平化

在将珠悬浮在BW2缓冲液中的同时，通过在无菌无核酸酶管中添加以下组分来制备5'齐平化主混合物，以进行适当数量的反应。移液前，涡旋5'齐平化缓冲液，以充分混合。

通过涡旋3–5秒来充分混合主混合物，并且短暂离心。

将DNA结合的珠放置在磁上并且等待溶液澄清(约15秒)。去除上清液，并且然后从磁上去除样品。

向每个样品添加100μl的5'齐平化主混合物。通过上下移液10次缓慢混合。

在热循环仪上在20℃下将样品温育10分钟，热循环仪盖打开。

立即进行反应后洗涤。

反应后洗涤

将样品放置在磁上并且等待溶液澄清(约15秒)。去除上清液，并且然后从磁上去除样品。

向每个样品添加150μl的BW1。通过上下移液10次缓慢混合。将样品放置在磁上并且等待溶液澄清(约15秒)。去除上清液，并且然后从磁上去除样品。

向每个样品添加150μl的BW2。通过上下移液10次缓慢混合。

5'衔接子连接

在将珠悬浮在BW2缓冲液中的同时，通过在无菌无核酸酶管中添加以下组分来制备5'衔接子连接主混合物，以进行适当数量的反应。移液之前，涡旋衔接子连接缓冲液以充分混合。

通过涡旋3–5秒来充分混合主混合物，并且短暂离心。

将DNA结合的珠放置在磁上并且等待溶液澄清(约15秒)。去除上清液，并且然后从磁上去除样品。

向每个样品添加100μl的5'衔接子连接主混合物。通过上下移液10次缓慢混合。

在热循环仪上在20℃下将样品温育20分钟，热循环仪盖打开。

立即进行连接后洗涤。

连接后洗涤

注意：以下洗涤步骤与反应后洗涤不同。

将样品放置在磁上并且等待溶液澄清(约15秒)。去除上清液，并且然后从磁上去除样品。

向每个样品添加150μl的BW1。通过上下移液10次缓慢混合。将样品放置在磁上并且等待溶液澄清(约15秒)。去除上清液，并且然后从磁上去除样品。

重复前一步骤，在BW1中总计2次洗涤。

向每个样品添加150μl的BW2。通过上下移液10次缓慢混合。

衔接子切割

在将珠悬浮在BW2缓冲液中的同时，通过在无菌无核酸酶管中添加以下组分来制备切割主混合物，以进行适当数量的反应。移液之前，涡旋切割缓冲液以充分混合。

通过涡旋3–5秒来充分混合主混合物，并且短暂离心。

将DNA结合的珠放置在磁上并且等待溶液澄清(约15秒)。去除上清液，并且然后从磁上去除样品。

向每个样品添加100μl的切割主混合物。通过上下移液10次缓慢混合。

在热循环仪上在37℃下将样品温育15分钟，热循环仪盖打开。

立即进行反应后洗涤。

反应后洗涤

将样品放置在磁上并且等待溶液澄清(约15秒)。去除上清液，并且然后从磁上去除样品。

向每个样品添加150μl的BW1。通过上下移液10次缓慢混合。将样品放置在磁上并且等待溶液澄清(约15秒)。去除上清液，并且然后从磁上去除样品。

向每个样品添加150μl的BW2。通过上下移液10次缓慢混合。

文库扩增

将反应放置在磁上，等待溶液澄清(约15秒)，去除上清液，然后从磁上去除反应。

向每个反应添加45μl无核酸酶的分子级水。通过上下移液10次缓慢混合以完全重悬珠。

将45μl经重悬的珠分到3个*无菌PCR管中(每个管中15μl)。

*在此实例中，连接了仅3个不同片段。

向每个管添加以下组分：

*引物混合物将含有将用于下游应用的5'元素。每个管将含有引物的特定/独特混合物，并且每个反应管将用其自身的特定引物混合物制备。

引物混合物0的实例，所述实例用于3个片段的串联：

引物是NEBNext Direct产物的3'端和5'端的特异性引物，并且其存在于所有获得的片段中。注意，引物序列应仔细调整到步骤0的产物的5'端。

管1引物混合物：

正向引物：

5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCGGTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3′

反向引物：

5'-ttgcctggccgttaacgctttcatAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-3'

管2引物混合物：

正向引物：

5'-atgaaagcgttaacggccaggcaaCAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCGGTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3′

反向引物：

5'-acggatgagatcaaacacctcttgAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-3'

管3引物混合物：

正向引物：

5'-caagaggtgtttgatctcatccgtCAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCGGTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3′

反向引物：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-3'

通过上下移液10次缓慢混合。密封PCR板或对管加盖。

在经加热的盖设置为105℃的情况下运行以下程序，并且当块温度达到98℃时将样品放置在热循环仪中(至关重要的是在将样品放置在热循环仪中之前确保块温度已达到98℃)：

纯化经扩增的片段

涡旋样品纯化珠以进行重悬。将管的内容物组合到单个1.5ml管中。

向PCR反应添加0.85倍的样品纯化珠(向100μl的经扩增的片段添加85μl的样品纯化珠)。通过上下移液至少10次来充分混合。

在室温下未加盖温育10分钟。

将管/PCR板放置在磁上。在溶液澄清之后(约2分钟)，小心除去并丢弃上清液。注意不要干扰含有DNA靶标的珠(警告：请勿丢弃珠)。

当管/板处于磁上时，添加200μl新鲜制备的(同一天)80％EtOH。在室温下温育30秒并且然后小心去除并丢弃上清液。

重复上一0一次，在80％EtOH中总计2次洗涤，确保从每个反应中去除了所有上清液。

在热循环仪上在37℃下未封盖(或未密封)温育样品5分钟，热循环仪盖打开，以将珠干燥。

从热循环仪去除管/板，并且将干燥的珠重悬在102μl的水中。在室温下温育2分钟。

将管/板放置在磁上并且允许溶液澄清(约2分钟)。将100μl经洗脱的文库转移到新鲜管/板中，并且添加85μl样品纯化珠。通过上下移液至少10次来充分混合。

在室温下温育10分钟。

将管/板放置在磁上。在溶液澄清之后(约2分钟)，小心除去并丢弃上清液。注意不要干扰含有DNA靶标的珠(警告：请勿丢弃珠)。

当管/板处于磁上时，添加200μl新鲜制备的(同一天)80％EtOH。在室温下温育30秒并且然后小心去除并丢弃上清液。

重复上一步骤一次，在80％EtOH中总计2次洗涤，确保从每个孔中去除了所有上清液。

在热循环仪上在37℃下未封盖(或未密封)温育样品2分钟，热循环仪盖打开，以将珠干燥。

从热循环仪去除管/板，并且通过缓慢移液(或缓慢涡旋加盖的管/密封板，然后快速旋转)将干珠重悬在30μl 1X TE中。在室温下温育2分钟。

将管放置在磁上并且允许溶液澄清(约2分钟)。

将28μl经洗脱的文库转移到新鲜管中并且进行到步骤0。

使用NEBuilder HiFi DNA组装程序的碱性多聚体

在此阶段，将来自阶段0的靶向扩增子串联，以用于长DNA链。扩增子是阶段0的靶富集的结果并且表示富集有诱饵/面板的gDNA的序列。在扩增步骤中，向扩增子添加独特的5'元件。将使用独特的5'元件来利用NEBuilder测定将片段串联成多聚体。

在NEB#E2621方案中指定了试剂和消耗品。

HiFi DNA组装主混合物允许无缝组装多个DNA片段，无论片段长度或末端相容性如何。

在冰上设置以下反应：

*使用的片段的数量可能会显著更高。

**如果组装了更大数量的片段，则增加反应的体积，并且使用另外的NEBuilderHiFi DNA组装主混合物。

将样品在热循环仪中在50℃下温育15分钟(当组装2个或3个片段时)或60分钟(当组装4个–6个片段时)。温育之后，将样品储存在冰上或–20℃下以用于下游应用。

端部修复

在此阶段，对串联体进行最终抛光。

在NEB#E6050方案中指定了试剂和消耗品。

在无菌微量离心管中混合以下组分：

在热循环仪中在20℃下温育30分钟。

在不进行大小选择的情况下对衔接子连接的DNA的清除：

使Vortex SPRIselect或NEBNext样品纯化珠重悬。

向衔接子连接反应添加90μl(0.9X)经重悬的珠。通过上下移液至少10次来充分混合。在最后混合期间，小心地将所有液体排出尖端之外。也可以使用在高处涡旋3-5秒。如果在混合之后对样品离心，则确保在珠开始沉降之前停止离心。

在室温下将样品在台上温育至少5分钟。

将管/板放置在适当磁架上，以将珠与上清液分离。如有需要，在放置在磁架上之前，快速旋转样品以从管或板孔的侧面收集液体。

5分钟之后(或当溶液澄清时)，小心去除并丢弃上清液。注意不要干扰含有DNA靶标的珠(警告：请勿丢弃珠)。

当在磁架中时，向管/板添加200μl 80％新鲜制备的乙醇。在室温下温育30秒，并且然后小心去除并丢弃上清液。注意不要干扰含有DNA靶标的珠。

重复洗涤步骤一次，总共两次洗涤。确保在第二次洗涤之后，去除了所有可见液体。如果需要，短暂旋转管/板，放置回在磁上，并且用p10移液器尖端去除痕量的乙醇。

当管/板处于磁架上，盖打开时，将珠风干至多5分钟。

从磁架去除管/板。通过添加17μl 10mM Tris-HCl或0.1X TE从珠洗脱DNA靶标。

通过上下移液10次或在涡旋混合器上进行充分混合。在室温下温育至少2分钟。如有需要，在放置回在磁架上之前，快速旋转样品以从管或板孔的侧面收集液体。

将管/板放置在所述磁架上。5分钟之后(或当溶液澄清时)，将15μl转移到新PCR管中。

如果需要超长片段，则进行到下一步骤。另外进行到Oxford纳米孔技术文库制备和测序。

串联体连接(任选步骤)

进一步连接清洁的串联体，以制备甚至更长的DNA片段。

基于T4 DNA连接酶试剂盒(NEB#M0202)。

使用T4 DNA连接酶试剂盒(NEB#M0202)。

在离心管中设置来自前一步骤的以下反应：

通过上下移液来缓慢混合并且短暂微量离心。

在室温下温育2小时。

在65℃下灭活加热10分钟。

在冰上冷却。

进行到Oxford纳米孔技术文库制备和测序。

本发明主题的目的之一是在其用于测序的制备程序期间引入到期望的靶序列中的误差与测序本身之间以及在靶序列的出于例如诊断目的而寻求的突变之间进行区分。其可以通过在能够标识相同模板的副本的序列或靶序列的同时，对存在于片段12中的相同靶序列的多个副本进行测序来区分。这是通过将标识子16附接到片段12实现的。如以上所描述的，在第二扩增之前和在对多聚体100进行测序之前，用特定标识子16对片段12的每个副本加标签。因此，对用相同标识子加标签的片段12的序列在原始核酸靶标的序列中被视为相同，而其之间的序列的任何变异被视为源自第二扩增和测序程序的误差。

本发明主题的另一个独特特征是将用标识子16加标签的多个单元顺序地附接，以形成适用于在被配置成用于对非常长的核酸片段测序的方法，如基于纳米孔的测序技术进行测序的长多聚体100。单元1的其它组成辅助分析获得的序列–导引子18和封闭子19辅助找到序列中的单元的边界；索引子允许标识片段12的序列的来源–因此允许同时分析来自多个来源的样品，并且片段12的序列允许标识靶序列–由此允许同时分析多个靶序列。

应当理解的是，为清楚起见，在单独的实施例的上下文中描述的主题的某些特征也可以在单个实施例中组合提供。相反，为简洁起见，在单个实施例的上下文中描述的主题的各种特征也可以单独提供或以任何适当的子组合的方式提供。

尽管已结合主题的具体实施例描述了主题，但是显然，许多变型、修改和变更对于本领域的技术人员而言是显而易见的。因此，意图涵盖落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有此类替代方案、修改以及变化。