阅读说明：本技术 一种β-咔啉吡啶鎓盐荧光探针及其制备方法与应用 (Beta-carboline pyridinium salt fluorescent probe and preparation method and application thereof ) 是由 凌勇 孟迟 许中原 刘季 刘昕 冉凡胜 张延安 王浩然 蒋玉 于 2020-08-03 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医药领域,公开了一种β-咔啉吡啶鎓盐荧光探针及制备方法与应用。本发明提供的β-咔啉吡啶鎓盐荧光探针具有线粒体靶向和光动力治疗作用,具有通式Ⅰ所示结构：<Image he="308" wi="646" file="DDA0002614533350000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>本发明提供的β-咔啉吡啶鎓盐荧光探针的制备方法为：将9-R<Sub>1</Sub>-1-R<Sub>2</Sub>-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲醛与4-甲基-吡啶鎓盐溶于无水乙醇中,滴加催化量哌啶,回流反应8～12h,通过重结晶或者色谱柱纯化得到通式Ⅰ所示β-咔啉吡啶鎓盐荧光探针。本发明制备方法得到的荧光探针具有稳定性高、低暗毒性等优点,可通过靶向线粒体进行肿瘤细胞检测成像及消融,此外,还可通过激发光照射产生单线态氧,肿瘤杀伤作用较强。(The invention belongs to the field of biomedicine, and discloses a beta-carboline pyridinium salt fluorescent probe as well as a preparation method and application thereof. The beta-carboline pyridinium salt fluorescent probe provided by the invention has the functions of mitochondrion targeting and photodynamic therapy, and has the structure shown in the general formula I: the preparation method of the beta-carboline pyridinium salt fluorescent probe provided by the invention comprises the following steps: reacting 9-R 1 ‑1‑R 2 -9H-pyrido [3,4-b]Indole-3-carbaldehydeDissolving the beta-carboline pyridinium salt and 4-methyl-pyridinium salt in absolute ethyl alcohol, dropwise adding a catalytic amount of piperidine, carrying out reflux reaction for 8-12 h, and purifying by a recrystallization column or a chromatographic column to obtain the beta-carboline pyridinium salt fluorescent probe shown in the general formula I. The fluorescent probe prepared by the preparation method has the advantages of high stability, low dark toxicity and the like, can be used for detecting, imaging and ablating tumor cells through targeted mitochondria, and can also generate singlet oxygen through exciting light irradiation, so that the tumor killing effect is strong.)

一种β-咔啉吡啶鎓盐荧光探针及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种β-咔啉吡啶鎓盐荧光探针及制备方法与应用，特别是涉及一种具有线粒体靶向和光动力治疗作用的β-咔啉吡啶鎓盐荧光探针、其制备方法以及其在体内外肿瘤细胞和组织的荧光成像诊断和/或制备用于光动力肿瘤治疗的药物中的应用。

背景技术

线粒体，通常被认为是细胞的动力室，是一种小的亚细胞细胞器，以三磷酸腺苷(ATP)的形式产生大部分细胞能量。研究表明，线粒体缺陷或功能障碍与癌症、炎症或心血管疾病有关，因此被认为是癌症、心血管和炎症疾病的新型药物设计中最重要的靶标之一。目前，由于线粒体内膜的负电位，带正电化合物根据浓度梯度积聚在线粒体基质中。亲脂性阳离子，它根据能斯特方程积聚在线粒体，最初被用于研究线粒体电子传递和ATP产生之间的耦合原理，并以此作为线粒体膜电位监测的一种工具。因此将药物特异性地传递给线粒体最有效的方法是通过共价将亲脂阳离子(如三苯基膦)连接到感兴趣的药效团。其他亲脂阳离子，如罗丹明、吡啶鎓盐等，也被用于小分子的荧光探针。癌症治疗的新兴研究重点在于利用选择性靶向、靶向线粒体阳离子(MTCs)的积累，还有他们改变癌细胞中ROS介导的氧化还原信号和抗增殖途径的能力。

光动力学疗法(PDT)又称光动力效应或者光动力学治疗，由光敏剂和光源两个要素组成。PDT具有光谱性、可重复性、微创性等优点。由于光敏剂本身无毒，并且其细胞毒性产生具有暂时性和局部性，机体不会对光敏剂产生抗药性，治疗时也无需手术。当用与之匹配的特定波长激光照射光敏剂时，光敏剂被激发，达到激发态的光敏剂又可以传递能量给周围的氧气从而产生高毒性的单态氧，有效消灭肿瘤细胞。利用线粒体靶向，将促进癌细胞对亲脂阳离子荧光探针的摄取和保留增加，为开发新的、更具选择性的肿瘤诊断和/或治疗的分子探针提供理论依据。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了一种β-咔啉吡啶鎓盐荧光探针及其制备方法与应用，该荧光探针具有线粒体靶向和光动力治疗作用，可应用于体内外肿瘤细胞和组织的荧光成像诊断和/或用于光动力肿瘤治疗的药物的制备。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种β-咔啉吡啶鎓盐荧光探针，结构式如通式Ⅰ所示：

其中，R₁代表H、烷基、炔基取代的烷基、卤代烷基和甲氧基烷基中的一种；R₂代表H、烷基和甲氧基取代的芳基中的一种；R₃代表烷基、烷炔基和卤代烃链中的一种；X^-代表卤负离子、六氟磷酸根负离子、磺酸负离子和甲磺酸负离子中的一种。

进一步的，通式Ⅰ中，所述R₁代表H、CH₃和CH₂CH₃中的一种；R₂代表H、CH₃和3,4,5-三甲氧基苯基中的一种；R₃代表CH₃或炔丙基；X^-代表碘负离子、溴负离子和六氟磷酸根负离子中的一种，具体如表1所示。

进一步的，β-咔啉吡啶鎓盐荧光探针的优选选自如表1所示的化合物：

表1通式Ⅰ部分化合物代号及其对应的结构

化合物I₁：(E)-4-(2-(1,9-二甲基-9H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-基)乙烯基)-1-甲基吡啶-1-碘盐；

化合物I₂：(E)-4-(2-(1,9-二甲基-9H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-基)乙烯基)-1-(丙-2-炔-1-基)吡啶-1-溴盐；

化合物I₃：(E)-4-(2-(9-(2-乙基)-1-甲基-9H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-基)乙烯基)-1-甲基吡啶-1-六氟磷酸盐；

化合物I₄：(E)-1-甲基-4-(2-(1-(1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-9H-吡啶基[3,4-b]吲哚-3-基)乙烯基)吡啶-1-六氟磷酸盐。

本发明还提供了上述β-咔啉吡啶鎓盐荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

将9-R₁-1-R₂-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲醛与4-甲基-吡啶鎓盐溶于无水乙醇中，滴加催化量哌啶，回流反应8～12h，通过重结晶或者色谱柱纯化得到通式Ⅰ所示β-咔啉吡啶鎓盐荧光探针。

本发明还提供了上述β-咔啉吡啶鎓盐荧光探针在体内外的肿瘤组织或细胞的荧光成像诊断中的应用。

本发明还提供了上述β-咔啉吡啶鎓盐荧光探针在制备用于光动力治疗的药物中的应用。

本发明还提供了上述β-咔啉吡啶鎓盐荧光探针在制备用于光动力肿瘤治疗的药物中的应用。

进一步的，所述光动力肿瘤治疗是指β-咔啉吡啶鎓盐荧光探针经过激发光照射后产生单线态氧杀伤肿瘤细胞。

进一步的，所述肿瘤细胞为结肠癌、乳腺癌、肝癌和黑色素瘤中的一种。

与现有技术相比，本发明结合天然β-咔啉生物碱刚性平面三环、共轭体系较大的结构特点，采用延长β-咔啉母环共轭体系的策略，引入亲脂性阳离子，获得具有线粒体靶向β-咔啉吡啶鎓盐荧光探针。研究其光学性质、线粒体靶向能力、光动力治疗效果，发现该类化合物具有稳定性高、低暗毒性等优点，可通过靶向线粒体进行肿瘤细胞检测成像及消融，此外，该类化合物还可通过激发光照射产生单线态氧，肿瘤杀伤作用较强。

附图说明

图1为本发明实施例提供的荧光探针(化合物I₁和化合物I₄)在1％DMSO的水溶液的紫外吸收光谱图，横坐标为波长，纵坐标为吸光度值；

图2为本发明实施例提供的荧光探针(化合物I₁和化合物I₄)在1％DMSO的水溶液的荧光发射光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度；

图3为本发明实施例提供的荧光探针(化合物I₁和化合物I₄)单线态氧捕获剂DPBF的紫外吸光谱，横坐标为波长，纵坐标为吸光度值；

图4为本发明实施例提供的荧光探针(化合物I₁、化合物I₂和化合物I₄)在5μM下和1μM MitoTracker red同时共染HT29细胞线粒体定位验证共聚焦荧光成像图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1：(E)-4-(2-(1,9-二甲基-9H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-基)乙烯基)-1-甲基吡啶-1-碘化物(化合物I₁)的制备

将1,9-二甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲醛(2.24g,10mmol)和1,4-二甲基吡啶-1-碘盐(2.35g,10mmol)加入单口瓶中，加入5ml无水乙醇，随后加入1滴哌啶，回流过夜，TLC监测反应至完全，反应液降温抽滤，再次重结晶纯化得红色固体(I₁)3.6g，产率为81.6％。

化合物I₁谱图数据为：ESI-MS(m/z):442[M+H]⁺；¹H NMR(d₆-DMSO,400MHz):δ8.84(d,J＝6.5Hz,2H,Ar-H),8.34(s,1H,Ar-H),8.31–8.26(m,3H,Ar-H,CH),8.14(d,J＝15.7Hz,1H,CH),7.79–7.74(m,2H,Ar-H),7.68–7.64(m,1H,Ar-H),7.37–7.33(m,1H,Ar-H),4.26(s,3H,CH₃),4.22(s,3H,CH₃),3.12(s,3H,CH₃)。

实施例2：(E)-4-(2-(1,9-二甲基-9H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-基)乙烯基)-1-(丙-2-炔-1-基)吡啶-1-溴盐(化合物I₂)的制备

参照实施例1中化合物I₁的合成方法，由4-甲基-1-(丙-2-炔-1-基)吡啶-1-溴盐代替方法中的1,4-二甲基吡啶-1-碘盐，最后得到红棕色固体(I₂)3.4g，产率为83.9％。

化合物I₂谱图数据为：ESI-MS(m/z):418[M+H]⁺；¹H NMR(d₆-DMSO,400MHz):δ8.87–8.82(m,2H,Ar-H),8.36(s,1H,Ar-H),8.31–8.26(m,3H,Ar-H,CH),8.16(d,J＝15.8Hz,1H,CH),7.81–7.77(m,2H,Ar-H),7.69–7.67(m,1H,Ar-H),7.39–7.36(m,1H,Ar-H),4.81(s,2H,CH₂),4.24(s,3H,CH₃),3.15(s,3H,CH₃),2.11(s,1H,CH)。

实施例3：(E)-4-(2-(9-(2-乙基)-1-甲基-9H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-基)乙烯基)-1-甲基吡啶-1-六氟磷酸盐(化合物I₃)的制备

参照实施例1中化合物I₁的合成方法，由9-乙基-1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲醛代替方法中的1,9-二甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲醛，1,4-二甲基吡啶-1-六氟磷酸盐代替方法中的1,4-二甲基吡啶-1-碘盐，最后得到红色固体(化合物I₃)4.5g，产率为80.5％。

化合物I₃谱图数据为：ESI-MS(m/z):406[M+H]⁺；¹H NMR(d₆-DMSO,400MHz):δ8.89–8.85(m,2H,Ar-H),8.36–8.34(m,3H,Ar-H,CH),8.29(s,1H,Ar-H),8.14(d,J＝15.8Hz,1H,CH),7.82(s,2H,Ar-H),7.69–7.66(m,1H,Ar-H),7.37–7.35(m,1H,Ar-H),4.31(s,3H,CH₃),4.24–4.18(m,2H,CH₂),3.13(s,3H,CH₃),2.74–2.61(m,3H,CH₃)。

实施例4：(E)-1-甲基-4-(2-(1-(1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-9H-吡啶基[3,4-b]吲哚-3-基)乙烯基)吡啶-1-六氟磷酸盐(化合物I₄)的制备

参照实施例1中化合物I₁的合成方法，由1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲醛，由1,4-二甲基吡啶-1-六氟磷酸盐代替方法中的1,4-二甲基喹啉-1-碘盐，最后得到红色固体(化合物I₄)5.1g，产率为85.6％。

化合物I₄谱图数据为：ESI-MS(m/z):598[M+H]⁺；¹H NMR(d₆-DMSO,400MHz):δ¹H NMR(400MHz,DMSO)δ11.88(s,1H,NH),8.87(d,J＝6.6Hz,2H,Ar-H),8.47(s,1H,Ar-H),8.38–8.16(m,4H,Ar-H,CH),7.87(d,J＝15.8Hz,1H,CH),7.69(d,J＝8.2Hz,1H,Ar-H),7.64–7.58(m,1H,Ar-H),7.34(m,1H,Ar-H),7.29(s,2H,Ar-H),4.27(s,3H,CH₃),3.96(s,6H,CH₃),3.80(s,3H,CH₃)。

实施例5：本发明实施例提供的荧光探针的紫外吸收光谱测试

将本发明实施例提供的荧光探针(化合物I₁和化合物I₄)分别溶于含1％DMSO的水溶液中，配制成5～20μM的检测液。采用紫外-可见分光光度计测试其紫外吸收光谱数据，结果如图1所示。结果显示本发明荧光探针紫外最大吸收波长在420～470nm范围内。其中化合物I₁紫外最大吸收波长在420nm左右，其峰值随化合物I₁的浓度增加而增加(图1a)；化合物I₄紫外最大吸收波长在425nm左右，其峰值随化合物I₄的浓度增加而增加(图1b)。

实施例6：本发明实施例提供的荧光探针的荧光光谱测试

将本发明实施例提供的荧光探针(化合物I₁和化合物I₄)分别溶于含1％DMSO的水溶液中，配制成5～20μM的检测液。采用荧光光谱仪测试其荧光发射光谱数据，结果显示本发明荧光探针最大发射波长在520～620nm范围内。其中化合物I₁在575nm左右的荧光峰值随化合物I₁的浓度增加而增加(图2a)；其中化合物I₄在570nm左右的荧光峰值随化合物I₄的浓度增加而增加(图2b)。

实施例7：本发明实施例提供的荧光探针的单线态氧产生试验

采用紫外光谱法检测本发明实施例提供的荧光探针产生单线态氧的能力。以1,3-二苯基苯并呋喃(DPBF)作为单线态氧的捕获剂，具体的方法是将本发明实施例提供的荧光探针(化合物I₁和化合物I₄)分别和捕获剂DPBF的溶液混合，然后再用激光照射一定时间。由于捕获剂本身在415nm处具有特征吸收，DPBF与单线态氧的反应极易进行。在光敏剂经光照射后，产生单线态氧可以与捕获剂DPBF发生化学反应，生成无色的产物，捕获剂DPBF在415nm处的紫外吸收强度降低。本发明实施例提供的荧光探针在650nm激光(15mW/cm²)照射0、1、3、5分钟后，检测DPBF在415nm处的吸光度值的变化。其中化合物I₁在415nm左右的吸光值随激光照射增加而降低(图3a)；化合物I₄在415nm左右的吸光值同样也随激光照射增加而降低(图3b)。该实验证明了本发明化合物能有效产生单线态氧，可以用于肿瘤细胞和组织的光动力治疗。

实施例8：本发明实施例提供的荧光探针对细胞的暗毒性试验

采用四甲基氮唑蓝比色法(MTT)体外毒性试验评价了本发明实施例提供的荧光探针对人结肠癌细胞HT29细胞株的光暗毒性。

暗毒性实验：首先取一瓶处于指数生长期状态良好的HT29细胞，加入0.25％胰蛋白酶消化，使贴壁细胞脱落，制成每毫升含2×10⁴～4×10⁴个细胞的悬液。取细胞悬液接种于96孔板上，每孔180μL，置恒温CO₂培养箱中培养24小时。换液，避光下加入受试化合物(化合物用1％DMSO溶解后用PBS稀释，受试化合物浓度为12.5μM)，每孔20μL，继续避光培养48小时后。将MTT加入96孔板中，每孔20μL，培养箱中反应4小时。吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，平板摇床上振摇5分钟。用酶联免疫检测仪在波长为570nm处测定每孔的吸收度，计算细胞存活率，结果如表2所示。实验证明，本发明所述化合物在无光源照射的条件下，细胞的存活率基本维持在95％左右，对肿瘤细胞的暗毒性较小。

实施例9：本发明实施例提供的荧光探针对细胞的光毒性试验

光毒性实验方法与暗毒性实验方法基本相同，不同之处是当加入药物培育48小时之后，采用光照条件，420nm激光(15mW/cm²)照射10分钟后，更换新鲜的完全培养液，于培养箱中继续培养12小时，然后每孔加入20μL MTT溶液，培养4小时后，同样计算细胞存活率，结果如表2所示。实验结果发现，相比无光照条件下，在激光照射后，化合物浓度为12.5μM时细胞死亡率大大增加(表2)，光动力效果显著，可以用于消融癌细胞。

表2本发明部分化合物对人结肠癌细胞HT29的存活率％(12.5μM)

实施例10：采用共聚焦显微镜对本发明实施例提供的荧光探针(化合物I₁、化合物I₂和化合物I₄)进行线粒体定位实验

采用共聚焦显微镜进行线粒体定位实验，成像前一天，HT29细胞由DEME培养液培养，放于激光共聚焦皿中，再向细胞中加入5μM的受试化合物，将其放置置于37℃、含5％CO₂的细胞培养箱中孵育半小时。接着用pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤3次后，再加入1μM的线粒体染色剂MitoTracker red溶液并继续孵育半小时后用pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，将孵育好的细胞置于共聚焦显微镜的载物台上进行共聚焦荧光成像，设置MitoTrackerred：λex＝488nm，λem＝500-600nm；设置受试化合物激发波长：λex＝405nm，λem＝500-650nm，实验结果如图4所示。结果表明本发明所述化合物的荧光图像重叠良好，表明β-咔啉吡啶鎓盐类荧光探针靶向活细胞中线粒体的效果显著。

本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。