一种多功能仿生纳米药物的制备方法及应用
阅读说明：本技术 一种多功能仿生纳米药物的制备方法及应用 (Preparation method and application of multifunctional bionic nano-drug ) 是由 祁迎秋 王卉 孟小草 刘晨 杜安妮 孙小凡 闵欢 聂广军 于 2021-07-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及多功能仿生纳米药物的制备方法及应用,可有效增强肿瘤的光动力治疗,其解决的技术方案是,该多功能仿生纳米药物为在聚乳酸-羟基乙酸共聚物上包载化疗药藤黄酸,得到载药纳米内核,经超声挤出将类囊体膜-癌细胞膜复合膜包覆在纳米内核的外侧,构成多功能仿生纳米药物,本发明制备的多功能仿生纳米药物TCPG具有良好的生物相容性,通过特异性同源靶向与增强光动力疗法相结合的策略有效地提高纳米药物的抗肿瘤效果,是纳米药物上的创新。(The invention relates to a preparation method and application of a multifunctional bionic nano-drug, which can effectively enhance photodynamic therapy of tumors and adopts the technical scheme that the multifunctional bionic nano-drug is prepared by coating chemotherapeutic gambogic acid on polylactic acid-glycolic acid copolymer to obtain a drug-loaded nano-core, and a thylakoid membrane-cancer cell membrane composite membrane is coated on the outer side of the nano-core through ultrasonic extrusion to form the multifunctional bionic nano-drug.)
技术领域
本发明涉及纳米药物领域，特别是一种多功能仿生纳米药物的制备方法及应用。
背景技术
目前，恶性肿瘤是一种具有高发病率和死亡率的常见疾病，严重威胁人类健康。传统肿瘤临床治疗方法主要有手术切除、放疗和化疗等，但这些治疗方式存在各自的局限性。在众多临床治疗策略中，光动力治疗已经凭借其高选择性、非侵入性以及可重复治疗等特点，成为一种极具潜力的临床替代疗法。然而光动力疗法的应用也受到光敏剂肿瘤靶向性差，肿瘤组织乏氧和细胞内谷胱甘肽水平过高的限制，从而影响其对肿瘤细胞的杀伤力。因此，亟需通过精巧的设计来克服这些困难，从而增强光动力疗法对肿瘤的治疗效果。
仿生膜技术是纳米医药领域近年来快速发展的一种技术，其利用天然膜成分固有的生物相容性、非免疫原性和生物可降解性，将纳米药物伪装成“自我”来避免免疫清除，最大限度地将药物递送到靶向部位。生物膜仿生纳米药物主要由两部分组成：纳米颗粒内核和包裹在外侧的天然生物膜。生物膜的存在能使纳米药物发挥来源细胞的特异作用，不同类型的细胞膜都有其独特的特征，比如红细胞膜的长循环作用，血小板膜对血管损伤部位的趋向性，白细胞膜有助于实现免疫功能等。相比于这些血液来源的生物膜，癌细胞膜由于其肿瘤归巢效应和免疫逃逸能力，能实现靶向药物递送和有效的癌症治疗。此外，有研究还利用植物来源的类囊体(Thylakoid，TK)膜制备了一种用于癌症治疗的仿生纳米药物。含有过氧化氢酶的类囊体膜能将过氧化氢催化分解为氧气。作为光合作用的主要场所，类囊体膜富含叶绿素，具有类卟啉结构的天然光敏剂叶绿素在照射下可产生活性氧，实现肿瘤的光动力治疗。然而，尽管越来越多的生物膜被开发和应用，从单个细胞膜继承的生物学益处仍然有限，单一的膜成分很难同时解决多重的生物学问题。通过工程化的方式将多种膜的功能进行整合，制备具有增强表面功能的复合生物膜，是一种有希望的策略。比如红细胞膜与癌细胞膜融合实现长循环和同源靶向，癌细胞膜与树突状细胞膜融合实现肿瘤特异性靶向和增强的免疫诱导能力等，将多种细胞类型的功能整合到单个纳米颗粒上，实现高效的药物递送和有效的癌症治疗。
纳米内核在仿生纳米药物中起重要的支撑作用，能够提高仿生纳米药物的机械稳定性，是有效运载药物到达目标部位并实现药物释放的关键之一。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)是一种高效载药材料，也是应用最广泛的纳米内核之一，具有优良的生物相容性和生物可降解性。由于肿瘤中高含量的谷胱甘肽不利于光动力治疗，可以通过化疗药藤黄酸(Gambogic Acid，GA)降低肿瘤细胞内谷胱甘肽水平。藤黄酸可以诱导肿瘤细胞凋亡，并且对多种类型的肿瘤具有很强的细胞毒活性。更重要的是，已证实藤黄酸通过与半胱氨酰硫醇的迈克尔加成反应消耗细胞中的谷胱甘肽，破坏细胞内氧化还原稳态，从而增强光动力疗效。
因此，开发一种特异性同源靶向与增强光动力治疗的多功能仿生纳米药物为仿生纳米药物的发展和肿瘤的治疗提供了潜在的新思路。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种多功能仿生纳米药物的制备方法及应用，实现增强肿瘤的光动力治疗，具有高安全性和广阔的应用前景。
本发明解决的技术方案是，该多功能仿生纳米药物为在聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)上包载化疗药藤黄酸(GA)，得到载药纳米内核(PLGA-GA纳米粒)，经超声挤出将类囊体膜-癌细胞膜复合膜(TK-Cancer)包覆在纳米内核的外侧，构成多功能仿生纳米药物[email protected](TCPG)。
所述的多功能仿生纳米药物的粒径为200-300nm。
该多功能仿生纳米药物的制备方法为：将PLGA和藤黄酸溶于有机溶剂丙酮形成有机相，将乳化剂聚乙烯醇(Poly(vinyl alcohol)，PVA)溶于超纯水形成水相，有机相丙酮溶液缓慢滴加到水相中，除去有机溶剂，通过纳米沉淀法制备载药纳米内核；提取类囊体膜和癌细胞膜，并超声处理形成复合膜；然后将复合膜与载药纳米内核混合，通过超声共挤出的方式制备得到多功能仿生纳米药物TCPG。
所述的有机相浓度为5-20mg/mL；PLGA与藤黄酸的质量比为7-100：1；水与乳化剂PVA的质量比为50-200：1；所述的有机相和水相的体积比为1：1-7。
所述的除去有机溶剂的方法为：将有机相缓慢滴加到水相中后进行磁力搅拌，转速300-600rpm/min，时间8h-12h。
所述的类囊体膜并不限于通过机械研磨以及低渗裂解处理从菠菜中提取，也可以从油麦菜、生菜等具有光合作用的绿色蔬菜中提取。
所述的癌细胞膜并不限于从食管鳞癌EC109细胞中提取，也可以从乳腺癌MCF-7细胞、胰腺癌Panc-1细胞等肿瘤细胞中提取。
所述的类囊体膜与癌细胞膜的膜蛋白比例为1：0-2。
所述的超声的功率为120W，超声时间为3-10分钟。
所述的挤出条件为将溶液依次通过800、400和200nm聚碳酸酯多孔膜，每个来回重复挤出10-30次。
本发明制备的多功能仿生纳米药物TCPG具有良好的生物相容性，通过特异性同源靶向与增强光动力疗法相结合的策略有效地提高纳米药物的抗肿瘤效果，是纳米药物上的创新，具有较高的应用价值。
附图说明
图1为本发明显示不同纳米体系的生物透射电镜图像(TK、Cancer、PLGA-GA和TCPG)示意图。
图2为本发明显示藤黄酸的紫外-可见吸收光谱(A)及其标准曲线(B)图。
图3为本发明显示不同制剂的流体力学尺寸和zeta电位测量结果图。
图4为本发明显示TCPG在pH 7.4和pH 6.8条件下的释药曲线图。
图5为本发明显示不同组分膜融合情况的荧光图。
图6为本发明显示不同纳米体系的十二烷基硫酸钠盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白分析(A)和蛋白免疫印迹试验分析(B)图。
图7为本发明显示不同处理条件下过氧化氢溶液中氧气浓度的变化(A)和以SOSG为探针的TCPG在激光照射下的荧光发射光谱(B)图。
图8为本发明显示癌细胞与不同纳米药物孵育24h的细胞活力图。
图9为本发明显示不同纳米药物组的相对瘤体积变化曲线(A)和治疗结束后各组的肿瘤形态学图(B)。
具体实施方式
以下通过具体的实施方式和附图对本发明的技术方案和应用进一步说明。应当指出，本发明所述实施例是为了描述特定的具体实施方案，不应视为对本发明的具体限制。下列实施例中未特殊说明的操作，均为本领域常规技术操作。
实施例1
在具体实施中，该多功能仿生纳米药物的制备方法具体包括以下步骤：
1)PLGA-GA纳米粒的制备
采用纳米沉淀法制备PLGA-GA纳米粒，分别称取3mg GA和30mg PLGA(分子量为13kDa)，加入3mL丙酮使溶解得有机相，然后将3mL有机相缓慢加入到9mL含1％PVA的水溶液中(PVA质量为0.09g)，室温条件下(25℃)搅拌挥发10h挥发去除丙酮，12000rpm离心30分钟并超纯水洗2遍即得到PLGA-GA纳米粒；
2)类囊体膜的提取
将200g菠菜洗净，4℃条件下预冷过夜，然后，使用破壁机将菠菜叶与600mL均质缓冲液(5mM MgCl2，50mM NaCl，0.3M蔗糖和50mM HEPES缓冲液，pH＝7.6)一起匀化，将匀浆通过10层纱布过滤，收集滤液并600g离心5分钟，上清1500g再离心10分钟，然后，在沉淀中加入200mL渗透压缓冲液(10mM HEPES，10mM NaCl和5mM MgCl2，pH＝7.6)并重悬20分钟，最后溶液2500g离心20分钟，沉淀重悬于5mL超纯水中，即得到类囊体膜溶液，4℃储存(整个过程在冰上进行)；
3)癌细胞膜的提取
将食管鳞癌EC109细胞培养后，使用胰蛋白酶消化细胞，离心收集沉淀癌细胞并重悬在适量膜蛋白提取缓冲液中(25mM甘露醇，75mM蔗糖，0.5％(wt/vol)BSA，0.5mM EGTA，30mM Tris-HCl，0.5mM PMSF和1％(vol/vol)磷酸酶抑制剂，pH＝7.4)中，在冰浴中使用超声波细胞破碎仪探超细胞悬液3分钟(超声2s，停1s)，4℃3200g离心5分钟收集上清，上清液12000g离心10分钟，得到的上清再100000g离心2小时，收集细胞膜沉淀并加入适量PBS重悬，-80℃储存以供进一步使用；
4)多功能仿生纳米药物TCPG的制备
使用BCA蛋白试剂盒定量类囊体膜和癌细胞膜蛋白的浓度，以类囊体膜与癌细胞膜的重量比1：1的比例将两者混合，混合物在4℃下超声处理5分钟(功率均为120W)，得到复合膜，然后将PLGA-GA纳米粒溶液(即载药纳米内核)加入到复合膜溶液中，超声处理5分钟以形成复合膜涂层，并分别通过800、400和200nm聚碳酸酯多孔膜反复挤出20次以促进两种膜更好的融合，最后，4℃15000g离心10分钟收集纳米药物，并PBS清洗3次去除未包裹内核的复合膜，沉淀重悬于水中，得到多功能仿生纳米药物TCPG。
实施例2
在具体实施中，该多功能仿生纳米药物的制备方法具体包括以下步骤：
1)PLGA-GA纳米粒的制备
采用纳米沉淀法制备PLGA-GA纳米粒，分别称取5mg GA和50mg PLGA(分子量为13kDa)，加入5mL丙酮使溶解得有机相，然后将5mL有机相缓慢加入到15mL含1％PVA的水溶液中(PVA质量为0.15g)，25℃搅拌挥发10h挥发去除丙酮，12000rpm离心30分钟并超纯水洗2遍即得到PLGA-GA纳米粒；
2)类囊体膜的提取
将300g油麦菜洗净，4℃条件下预冷过夜，然后，使用破壁机将油麦菜与900mL均质缓冲液(5mM MgCl2，50mM NaCl，0.3M蔗糖和50mM HEPES缓冲液，pH＝7.6)一起匀化，将匀浆通过10层纱布过滤，收集滤液并600g离心5分钟，上清1500g再离心10分钟，然后，在沉淀中加入300mL渗透压缓冲液(10mM HEPES，10mM NaCl和5mM MgCl2，pH＝7.6)并重悬20分钟，最后溶液2500g离心20分钟，沉淀重悬于6mL超纯水中，即得到类囊体膜溶液，4℃储存(整个过程在冰上进行)；
3)癌细胞膜的提取
将乳腺癌MCF-7细胞培养后，使用胰蛋白酶消化细胞，离心收集沉淀癌细胞并重悬在适量膜蛋白提取缓冲液中(25mM甘露醇，75mM蔗糖，0.5％(wt/vol)BSA，0.5mM EGTA，30mMTris-HCl，0.5mM PMSF和1％(vol/vol)磷酸酶抑制剂，pH＝7.4)中，在冰浴中使用超声波细胞破碎仪探超细胞悬液3分钟(超声2s，停1s)，4℃3200g离心5分钟收集上清，上清液12000g离心10分钟，得到的上清再100000g离心2小时，收集细胞膜沉淀并加入适量PBS重悬，-80℃储存以供进一步使用；
4)多功能仿生纳米药物TCPG的制备
使用BCA蛋白试剂盒定量类囊体膜和癌细胞膜蛋白的浓度，以类囊体膜与癌细胞膜的蛋白重量比1：2的比例将两者混合，混合物在4℃下超声处理5分钟(功率均为120W)，得到复合膜，然后将PLGA-GA纳米粒溶液(即载药纳米内核)加入到复合膜溶液中，超声处理5分钟以形成复合膜涂层，并分别通过800、400和200nm聚碳酸酯多孔膜反复挤出20次以促进两种膜更好的融合，最后，4℃15000g离心10分钟收集纳米药物，并PBS清洗3次去除未包裹内核的复合膜，沉淀重悬于水中，得到多功能仿生纳米药物TCPG。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，对于本技术领域的普通技术人员来说，依本发明专利范围及说明书内容所作的修改或改进，皆应仍属于本发明要求保护的范围。
本发明所述多功能仿生纳米药物经多次反复实验，具有很好的治疗效果，相关试验资料如下：
一、测定本发明实施例1制备的多功能仿生纳米药物不同PLGA与GA投料比时包封率及载药量变化，进行药物与载体最佳比例的筛选。
具体测定方法如下：
(1)紫外检测波长的选择和标准工作曲线的绘制：精密称取适量GA，以甲醇为溶剂，超声5分钟使其溶解，配成0.1mg/mL的溶液并稀释到适当浓度待测。甲醇溶液作为空白对照，使用紫外-可见分光光度计在300-800nm范围内对GA溶液进行波长扫描。记录紫外图谱，并以GA的最大吸收波长作为紫外检测波长。然后精确配置GA的甲醇储备液(0.5mg/mL)，然后用甲醇依次梯度稀释母液浓度：1.25、2.5、5、10、25、50和100μg/mL。甲醇溶液作为空白对照，测定不同浓度GA溶液在最大紫外吸收波长处的吸光度，建立GA的标准曲线回归方程(图2A、B)。
(2)将PLGA与GA投料比分别为100：1、50：1、25：1、15：1、10：1和7：1时合成PLGA-GA纳米粒12000rpm离心30分钟并水洗2遍，收集两次离心的上清液，加入甲醇定容并超声15分钟破乳。使用紫外-可见分光光度计测定其在360nm的吸光度，代入GA的标准曲线计算未包封的GA含量。
(3)将步骤(2)测得的吸光值带入标准工作曲线中，按下述公式计算藤黄酸的包封率和载药量：
包封率(％)＝(药物GA的总投药量-未包封的GA的量)/药物GA的总投药量
载药量(％)＝(药物GA的总投药量-未包封的GA的量)/纳米粒的总投料量
表1.PLGA/GA比例对纳米粒包封率和载药率的影响
当PLGA与GA的投料比为10：1时，制备的PLGA-GA纳米粒相对最优，包封率为80.02％，载药率为7.41％。
二、观察实施例1制备的多功能仿生纳米药物的形貌、粒径和电位特征。
图1透射电镜结果显示类囊体膜和癌细胞膜呈膜状结构，PLGA-GA呈球形结构，且粒径分布均匀，多功能仿生纳米药物TCPG呈清晰的球形核-壳结构，其内层为载药PLGA-GA内核，外层为包裹的约20nm的复合膜，然后使用纳米粒度仪测量不同纳米体系的粒径和zeta电位，如图3所示。PLGA-GA纳米内核的原始尺寸约为185nm，涂覆复合膜后粒径增加了约24nm，表明复合膜包裹在PLGA-GA纳米粒表面使粒径增大。而zeta电位从-21.4mV变为-31.8mV，表明负的内核被更负的外膜表面屏蔽，进一步证明膜包载在纳米粒外层。
三、考察实施例1制备的多功能仿生纳米药物TCPG在体外药物的释放情况。
精密移取1mL实施例1制备TCPG溶液置于截留分子质量为3500的透析袋中，然后将透析袋分别放入50mL pH 7.4和pH 6.8的PBS溶液中(含1％SDS)。在100rpm/min的37℃水浴恒温振荡器中特定时间点(0、0.5、1、2、4、8、12、24、48和72h)分别取样1mL，同时补充1mL的新鲜介质。测定溶液在360nm处的吸光度，代入GA标准曲线计算释放药物的浓度。根据药物的累积释放百分率绘制释药曲线：
Ct：第t次取样浓度；V0：释放介质的初始体积(V0＝50mL)；Ci：第i次取样浓度；Vi：第i次取样的体积(Vi＝1mL)；W：TCPG中所含药物的质量。
结果如图4显示，在pH＝7.4的PBS溶液中孵育72h后，TCPG释放了约25.6％的药物，说明TCPG在正常体液环境下可以比较稳定存在，降低了药物泄露对机体正常组织器官的损害。而当pH值降至6.8时，相同时间后的药物释放增加至61.7％，表明微酸性环境更有利于GA的释放，这可能是由于低pH条件下PLGA中酯键等发生断裂，导致聚合物降解而释药增加，从而在肿瘤部位更好的发挥药效。
四、考察实施例1制备的多功能仿生纳米药物TCPG的膜融合情况。
在避光冰浴条件下将5μLDiO细胞膜染料(1mg/mL的DiO/DMSO溶液)与100μL的癌细胞膜溶液搅拌1小时。混合后，膜溶液4℃15000g离心20分钟，PBS洗涤3次去除游离DiO染料，将类囊体膜和DiO标记的癌细胞膜混合并超声5分钟，然后将混合膜分别通过800、400和200nm聚碳酸酯多孔膜反复挤出以促进膜融合，最后，4℃15000g离心20分钟收集复合膜并重新分散在水中。以两种膜物理混合物作为对照，分别将10μL的类囊体膜、癌细胞膜、复合膜以及物理混合物溶液滴在玻片上自然蒸发，使用荧光显微镜观察膜融合情况。
由图5荧光显微镜成像结果可以看出，类囊体膜自身会被激发呈红色荧光，DiO标记的癌细胞膜激发后呈绿色荧光。两种膜物理混合后两种颜色荧光不重叠，而将两种膜超声共挤出后荧光信号共定位，呈黄色荧光，表明两种细胞膜的已成功融合。
五、实施例1制备的多功能仿生纳米药物TCPG的特异性蛋白表征。
为了考察TCPG中膜蛋白的完整性，采用十二烷基硫酸钠盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行膜蛋白分析。将凝胶置于考马斯亮蓝快速染液中染色30分钟，超纯水脱色后拍照分析。然后通过蛋白免疫印迹试验检测类囊体膜、癌细胞膜、复合膜和纳米药物TCPG上同源靶向相关蛋白的表达情况。提取蛋白后进行电泳、湿法转膜和封闭等步骤，将条带与N-钙黏蛋白(N-cadherin)、半乳糖凝集素-3(Galectin-3)、上皮细胞粘附分子(Ep-CAM)和Na+-K+-ATP酶(Na+-K+-ATPase)抗体在4℃条件下孵育过夜，然后分别与对应的二抗室温下孵育1.5h。Na+-K+-ATPase用作内源性对照，使用化学发光免疫分析仪进行拍照。
十二烷基硫酸钠盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，来自类囊体膜和癌细胞膜的大多数蛋白在复合膜和纳米药物TCPG的蛋白谱中良好保留，未发生明显的蛋白损失，说明TCPG保留了两种膜的完整性，从而能发挥两种膜各自的功能(图6A)。蛋白质印迹试验显示了复合膜和纳米药物TCPG表达了癌细胞膜表面的同源黏附因子N-钙黏蛋白、半乳糖凝集素-3和上皮细胞粘附分子，而类囊体膜上没有这些蛋白的表达，证实了癌细胞表面的同源粘附因子已成功转移到纳米药物TCPG上,具有特异性识别癌细胞的潜力(图6B)。
六、考察实施例1制备的多功能仿生纳米药物TCPG的催化产氧和活性氧生成能力。
类囊体膜中含有过氧化氢酶，能够催化分解过氧化氢产生氧气。为了检测氧气的生成，将10mL TCPG溶液(TK：40μg/mL)加入到同体积10mL的20mM过氧化氢溶液中，使用便携式溶解氧分析仪检测不同时间溶液中氧气的产生量，为了研究过氧化氢酶的选择性抑制剂3-氨基-1,2,4-三唑(3-Amino-1,2,4-triazole，3-AT)对纳米药物TCPG中过氧化氢酶活性的影响，将3-AT(10mM)与TCPG在室温下预孵育30分钟作为对照。
使用SOSG作为单线态氧荧光探针检测类囊体膜产生活性氧的性能。实验分为空白组、超纯水+NIR组、TCPG组、TCPG+NIR组、TCPG+NaN3+NIR组，其中叶绿素浓度为20μg/mL，NaN3作为一种特定的活性氧清除剂浓度为1mg/mL。避光条件下将3μL的SOSG(2.5mM)甲醇溶液分别加入到3mL的上述各组溶液中，超纯水作为对照组。然后用660nm激光(100mW/cm2)照射5分钟，使用荧光分光光度计检测488nm激发波长下溶液的荧光光谱。
制剂催化产氧结果如图7A所示，加入TCPG后，溶液氧气含量升高，而3-AT抑制了氧气的生成。活性氧生成实验显示(图7B)，TCPG在无激光照射时荧光信号很弱，几乎不产生活性氧。当激光照射溶液5分钟后SOSG的荧光强度明显增加，而加入活性氧清除剂NaN3抑制了荧光的增加。证明在660nm激光照射下，TCPG上的光敏剂叶绿素能产生活性氧，具有用于光动力治疗的潜力。
七、实施例1制备的多功能仿生纳米药物TCPG在体外抗肿瘤作用。
将食管鳞癌EC109细胞以8×103个细胞/孔的密度接种于96孔板。培养24小时后，加入各组制剂(1)PBS；(2)PBS+NIR；(3)[email protected](TCP)；(4)GA；(5)[email protected]+NIR(TCP+NIR)；(6)[email protected](TCPG)；(7)[email protected]+NIR(TPG+NIR)；(8)[email protected]+NIR(TCPG+NIR)(GA：5μM；n＝5)。培养24h后，使用CCK-8试剂盒评估细胞活力。
如图8所示，单纯近红外激光照射对肿瘤细胞的存活率没有明显影响。纳米载体TCP安全性高，对癌细胞没有明显毒性。而纳米药物TCPG由于同源靶向作用以及改善肿瘤乏氧，同时降低细胞内的谷胱甘肽含量，在激光照射下造成81.3％的细胞死亡，表现出最好的体外抗癌活性。
八、考察实施例1制备的多功能仿生纳米药物TCPG的体内肿瘤治疗效果。
首先在BALB/c-nu雌性裸鼠的右后背部注射5×106个食管鳞癌EC109细胞建立肿瘤模型。当小鼠肿瘤体积达到80mm3左右时，随机分成8组，每组5只小鼠。(1)NaCl；(2)NaCl+NIR；(3)TCP；(4)GA；(5)TCP+NIR；(6)TCPG；(7)TPG+NIR；(8)TCPG+NIR。其中GA给药剂量为5mg/kg，激光照射组在给药12小时后用660nm，100mW/cm2激光照射10分钟。每3天给药一次，共给药4次。在动物实验期间每2天监测小鼠的肿瘤的大小，并计算瘤体积和相对肿瘤体积。14天后结束治疗，切除肿瘤并拍照。
肿瘤体积(mm3)＝0.5×长径(mm)×短径2(mm2)
实验结果如图9A、B所示，NaCl，NaCl+NIR的肿瘤在接种后迅速生长，在14天内平均肿瘤体积达到800-1000mm3，表明单纯激光照射基本无肿瘤抑制效果。纳米载体TCP组的相对瘤体积为12.32±1.61，说明空白载体TCP毒性较低，也基本无抗肿瘤作用。而单纯光动力疗法和化疗表现出轻度的肿瘤抑制作用，难以发挥最佳的抗肿瘤效果。TCPG+NIR组由于癌细胞膜的同源靶向作用，通过缓解肿瘤缺氧以及降低肿瘤细胞内谷胱甘肽水平，联合化疗和光动力治疗显著抑制肿瘤的生长，具有最小的相对瘤体积。
在做上述实验的同时，还采用其他实施例制备的多功能仿生纳米药物做了类似的实验，均取得了相同和相类似的结果，证明本发明制备方法稳定可靠，其他实验结果不再一一列举。
本发明癌细胞膜涂覆使其在肿瘤部位特异性富集，而类囊体膜上的过氧化氢酶可以催化肿瘤中过量的的过氧化氢产生氧气，在近红外激光照射下，类囊体膜中的天然光敏剂叶绿素进一步将氧转化为具有细胞杀伤作用的活性氧，同时，化疗药物藤黄酸在诱导肿瘤细胞凋亡的同时，能够有效降低细胞内谷胱甘肽含量，调节氧化应激，实现肿瘤的联合治疗，本发明制备的多功能仿生纳米药物TCPG具有良好的生物相容性，通过特异性同源靶向与增强光动力疗法相结合的策略有效地提高纳米药物的抗肿瘤效果，具有较高的应用价值。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1.制备的多功能仿生纳米药物工艺简单，操作方便，不需要复杂的化学反应，具有良好的药物开发潜力；
2.多功能仿生纳米药物由于癌细胞膜的存在能延长循环半衰期并同源靶向到肿瘤部位，外侧的类囊体膜能够改善肿瘤乏氧并产生高毒性的活性氧，纳米内核包载的化疗药藤黄酸不仅能诱导肿瘤细胞凋亡，而且有效降低细胞内的谷胱甘肽含量，联合增强光动力疗法的癌症治疗效果；
3.多功能仿生纳米药物具有良好的生物相容性，能够显著的抑制肿瘤的生长。