阅读说明：本技术 一种新型抗病毒产品对抗包膜病毒的模型构建及其应用 (Model construction and application of novel antiviral product to resisting enveloped virus ) 是由 王婧宁 于 2020-07-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种新型抗病毒产品对抗包膜病毒的模型构建,包括抗病毒作用机制的构建；所述抗病毒作用机制模型构建包括对细胞毒性的测定、不同作用模式下抗病毒效果的测定、分子对接法测N蛋白相互作用、检测细胞膜中磷脂和胆固醇含量。(The invention discloses a model construction of a novel antiviral product against enveloped viruses, which comprises the construction of an antiviral action mechanism; the antiviral mechanism model construction comprises the steps of measuring cytotoxicity, measuring antiviral effect under different action modes, measuring the interaction of N protein by a molecular docking method and detecting the content of phospholipid and cholesterol in cell membranes.)

一种新型抗病毒产品对抗包膜病毒的模型构建及其应用

技术领域

本发明涉及抗病毒产品领域，尤其涉及一种新型抗病毒产品对抗包膜病毒的模型构建及其应用。

背景技术

人类的发展史伴随着与病毒的长期抗争，2019年末发现的新型冠状病毒(缩写为2019-nCoV)让全球陷入了严重的疫情危机，人经该病毒感染后，人体症状一般为发热、乏力、干咳、逐渐出现呼吸困难，严重者表现为急性呼吸窘迫综合征，脓毒症休克，难以纠正的代谢性酸中毒和凝血功能障碍。面对这种新型病毒，国内外尚无成熟的制剂和药物对其进行抑制甚至是灭活。

研究表明，含五环三萜母核的皂苷化合物具有广泛的药理作用和重要的生物活性，尤其在抗炎、护肝、抗肿瘤方面已经显现出令人关注的药理特性，对现有活性化合物展开研究并制成成熟的产品，能够实现对疫情的快速反应，在防疫常态化的背景下，该类产品的市场前景巨大，然而五环三萜化合物在抗病毒方面的研究较少，难以为其在抗病毒产品中的应用给出完善的理论指导。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的第一方面提供了一种新型抗病毒产品对抗包膜病毒的模型构建，包括抗病毒作用机制的构建；

所述抗病毒作用机制模型构建包括对细胞毒性的测定、不同作用模式下抗病毒效果的测定、分子对接法测N蛋白相互作用、检测细胞膜中磷脂和胆固醇含量。

作为一种优选的技术方案，所述新型抗病毒产品为含有五环三萜化合物的抗病毒产品。

作为一种优选的技术方案，所述对细胞毒性的测定包括以下步骤：向细胞中加入不同浓度的活性物，培养细胞后测试活性物对细胞的抑制率，求出对细胞无毒的最大浓度。

作为一种优选的技术方案，所述作用模式包括预处理病毒、病毒复制、预处理细胞、病毒吸附。

作为一种优选的技术方案，所述预处理病毒的作用模式下抗病毒效果的测定包括以下步骤：将活性物与包膜病毒混合并孵育后，将混合物加到细胞中共同培养，测试活性物对包膜病毒的抑制率，得到使用活性物预处理病毒的作用模式下的抗病毒效果。

作为一种优选的技术方案，所述病毒复制的作用模式下抗病毒效果的测定包括以下步骤：以病毒液侵染细胞，孵育后弃去病毒液，加入活性物继续培养细胞，测试细胞存活率，得到活性物对病毒复制的作用效果。

作为一种优选的技术方案，所述预处理细胞的作用模式下抗病毒效果的测定包括以下步骤：将活性物加入细胞中进行细胞培养，再加入病毒液继续培养，培养完成后测试细胞存活率，得到使用活性物预处理细胞的作用模式下的抗病毒效果。

作为一种优选的技术方案，所述病毒吸附的作用模式下抗病毒效果的测定包括以下步骤：将活性物与病毒液混合后立即加入细胞中进行吸附，吸附后弃去液体并继续培养，培养完成后测试细胞存活率，得到活性物对病毒吸附的作用效果。

作为一种优选的技术方案，所述新型抗病毒产品对抗包膜病毒的模型构建还包括产品开发模型构建。

本发明的第二方面提供了一种如上所述的新型抗病毒产品对抗包膜病毒的模型构建的应用，其用于预测抗病毒产品的作用机制。

有益效果：本发明提供的一种新型抗病毒产品对抗包膜病毒的模型构建，首先对活性物的细胞毒性进行测定，能够为后续整个研究过程提供基础指导，大大缩短研究时间，提高研究效率；通过在不同模式下测试活性物的抗病毒效果，并检测细胞膜中磷脂和胆固醇含量，可从细胞层面理解活性物对病毒、对细胞产生的作用，而利用分子对接法分析活性物与N蛋白之间的相互作用，则从分子层面完善活性物的作用机制，综合四种检测即可全面预测活性物抗病毒的作用机制，对接下来的活性物应用、产品研发提供理论指导。

附图说明

为了进一步解释说明本发明中提供的一种新型抗病毒产品对抗包膜病毒的模型构建及其应用的有益效果，提供了相应的附图，需要指出的是本发明中提供的附图只是所有附图中选出来的个别示例，目的也不是作为对权利要求的限定，所有通过本申请中提供的附图获得的其他相应图谱均应该认为在本申请保护的范围之内。

图1为本发明中的抗病毒作用机制模型构建。

图2为本发明中的产品开发模型构建。

具体实施方式

下面结合本发明的优选实施方法的详述，进一步阐述本发明。应理解，这些实施方法的详述仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

除非另有定义，否则在公开本发明时使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。借助于进一步引导，包括术语定义以更好地理解本发明的教导。

本文所用术语“由…制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

连接词“由…组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由…组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。

此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。

为了解决上述问题，本发明提供了一种新型抗病毒产品对抗包膜病毒的模型构建，包括抗病毒作用机制模型构建。

本申请中的新型抗病毒产品是指含有五环三萜化合物的抗病毒产品，尤其是指含有熊果酸和/或齐墩果酸的抗病毒产品。

本文中的术语“五环三萜化合物”是以由六个异戊二烯单元连接而成的五个闭合环作为母体的三萜类化合物。

本文中的术语“包膜病毒”是指在病毒蛋白质衣壳外具有一层包膜的病毒，这层包膜主要来源于宿主细胞膜(磷脂层和膜蛋白)，但也包含有一些病毒自身的糖蛋白，能够帮助病毒进入宿主细胞，并维护病毒体结构的完整性。

本申请中的包膜病毒可为流感病毒、冠状病毒、狂犬病毒、艾滋病毒等。

抗病毒作用机制模型构建

本申请中的抗病毒作用机制模型用于确定抗病毒产品中活性物对病毒的抑制和杀灭效果，进而对产品开发做出指导。

在一些优选的实施方式中，所述活性物为五环三萜化合物；进一步优选的，所述活性物为熊果酸和/或齐墩果酸。

如图1所示，在一些优选的实施方式中，所述抗病毒作用机制模型构建包括对细胞毒性的测定、不同作用模式下抗病毒效果的测定、分子对接法测N蛋白相互作用、检测细胞膜中磷脂和胆固醇含量。

对细胞毒性的测定

发明人发现，抗病毒产品中的活性物在一定浓度范围内，浓度与病毒抑制率成正比，然而当活性物浓度过高时，抗病毒效果反而降低，其原因在于，活性物在高浓度下会对细胞产生毒性，导致细胞的存活率降低，对细胞毒性的测定可指导后续实验及产品开发中活性物的用量范围。

在一些优选的实施方式中，所述对细胞毒性的测定包括以下步骤：向细胞中加入不同浓度的活性物，培养细胞后测试活性物对细胞的抑制率，求出对细胞无毒的最大浓度。

本文中的术语“抑制率”的计算公式为：抑制率(％)＝100％-存活率(％)。

在一些优选的实施方式中，所述细胞选自Huh7细胞(人肝癌细胞)、Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)、Hela细胞(海拉细胞)、MDCK细胞(犬肾细胞)中的一种。

不同作用模式下抗病毒效果的测定

在不同作用模式下测试活性物对病毒的抑制效果，以推断出抗病毒产品的作用机制，进而为产品开发提供理论支持。

在一些优选的实施方式中，所述作用模式包括预处理病毒、病毒复制、预处理细胞、病毒吸附。

本文中的术语“病毒复制”是指病毒在活细胞内，以其基因组为模板，在酶的作用下，分别合成病毒基因组及蛋白质，再组装成完整病毒颗粒的过程。在病毒的复制周期中主要包括吸附、穿入、脱壳、生物合成、组装、释放六个连续步骤，其中吸附步骤对应术语“病毒吸附”，是指病毒体与细胞接触，进行静电结合，结合后的病毒体表面位点与宿主细胞膜上相应的受体结合的过程。

在一些优选的实施方式中，所述预处理病毒的作用模式下抗病毒效果的测定包括以下步骤：将活性物与包膜病毒混合并孵育后，将混合物加到细胞中共同培养，测试活性物对包膜病毒的抑制率，得到使用活性物预处理病毒的作用模式下的抗病毒效果。

在一些优选的实施方式中，所述病毒复制的作用模式下抗病毒效果的测定包括以下步骤：以病毒液侵染细胞，孵育后弃去病毒液，加入活性物继续培养细胞，测试细胞存活率，得到活性物对病毒复制的作用效果。

在一些优选的实施方式中，所述预处理细胞的作用模式下抗病毒效果的测定包括以下步骤：将活性物加入细胞中进行细胞培养，再加入病毒液继续培养，培养完成后测试细胞存活率，得到使用活性物预处理细胞的作用模式下的抗病毒效果。

在一些优选的实施方式中，所述病毒吸附的作用模式下抗病毒效果的测定包括以下步骤：将活性物与病毒液混合后立即加入细胞中进行吸附，吸附后弃去液体并继续培养，培养完成后测试细胞存活率，得到活性物对病毒吸附的作用效果。

发明人发现，通过对活性物作用机制的研究可以对产品类型提供指导，例如当使用活性物对病毒进行预处理能够起到显著的抑制效果时，产品可开发为消毒剂类产品，用于环境杀毒；当活性物能够明显抑制病毒复制或病毒吸附，则可考虑将活性物用于治疗类药物研发，减少病毒在体内与正常细胞的相互作用；当活性物用于预处理细胞能够提高细胞存活率时，则活性物可用于预防类药物研发，提高人体对病毒的免疫力，降低病毒感染风险。

分子对接法测N蛋白相互作用

本文中的术语“分子对接法”是指通过受体的特征以及受体和药物分子之间的相互作用方式来进行药物设计的方法，用于预测分子间(如配体和受体)的结合模式和结合稳定性，可使用DOCK、AutoDock、FlexX等软件进行。

本文中的术语“N蛋白”是指核衣壳蛋白，冠状病毒中的N蛋白是存在与核衣壳中的唯一蛋白，与病毒基因组RNA相互缠绕形成病毒核衣壳，在病毒RNA的合成过程中发挥着重要的作用，N蛋白在病毒的结构蛋白中所占比例最大，可作为病毒防治药物的靶点。

发明人发现，采用分子对接法对活性物与N蛋白之间的相互作用进行研究，能够预测活性物与N蛋白的作用位点，从分子层面为活性物及其类似物作为药物的研发工作提供理论指导。

检测细胞膜中磷脂和胆固醇含量

发明人发现，包膜病毒很大程度上依赖脂类包膜进入易感细胞，包膜病毒感染宿主细胞时，其侵入过程主要是病毒包膜与宿主细胞膜的融合过程，进而使病毒粒子侵入宿主细胞内，即病毒的遗传物质以核衣壳的形式进入细胞。病毒的表面糖蛋白通过识别结合相应的特异性受体介导这一融合过程，而磷脂及胆固醇在病毒的侵入过程中起着重要的作用，检测活性物对细胞膜中磷脂和胆固醇含量的作用效果，可以从活性物对细胞产生作用的角度进行研究，以完善活性物的抗病毒机制。

在一些优选的实施方式中，所述检测细胞膜中磷脂和胆固醇含量包括以下步骤：使用活性物处理细胞，测定处理前后磷脂及胆固醇含量；用MβCD处理细胞，测定处理前后磷脂及胆固醇含量；比较活性物与MβCD的处理能力。

本文中的术语“MβCD”是指甲基-β-环糊精，是一种能破坏胆固醇和磷脂的化合物，其可破坏细胞的脂质筏，但对细胞膜的完整性无影响。

在一些优选的实施方式中，所述抗病毒作用机制模型构建还包括总结活性物抗病毒的作用机制。

发明人发现，测定活性物对细胞的毒性能够为后续整个研究过程提供基础指导，大大缩短研究时间，提高研究效率，通过在不同模式下测试活性物的抗病毒效果，并检测细胞膜中磷脂和胆固醇含量，可从细胞层面理解活性物对病毒、对细胞产生的作用，而利用分子对接法分析活性物与N蛋白之间的相互作用，则从分子层面完善活性物的作用机制，综合四种检测即可全面预测活性物抗病毒的作用机制，对接下来的活性物应用、产品研发提供理论指导。

在一些优选的实施方式中，所述新型抗病毒产品对抗包膜病毒的模型构建还包括产品开发模型构建。

产品开发模型构建

在一些优选的实施方式中，所述产品开发模型构建包括HPLC筛选天然植物原料、产品开发及优化、输出产品。

如图2所示，在一些优选的实施方式中，所述产品开发模型构建包括HPLC筛选出含有熊果酸和齐墩果酸的天然植物、天然植物原料组成产品配方、优化五环三萜类抗病毒产品并进行杀灭冠状病毒测试、输出产品。

本文中的术语“HPLC”是指高效液相色谱法，该方法以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。

在一些优选的实施方式中，所述天然植物选自枇杷叶、山楂、白花蛇舌草、女贞子、柿子、车前、石榴、乌梅、木瓜中的一种或多种的混合。

在一些优选的实施方式中，所述天然植物原料为相应天然植物的植物提取物，提取方法可为本领域技术人员熟知的任何一种，例如水煎法、醇提法、超临界CO₂萃取法等。

发明人通过HPLC法对含有熊果酸和齐墩果酸的天然植物进行筛选，采用活性物含量较高的天然植物作为原料进行产品开发，根据杀灭冠状病毒测试将初步配方逐步改进，最终得到病毒灭活性能优异的产品投入生产。

本发明的第二方面提供了一种如上所述的新型抗病毒产品对抗包膜病毒的模型构建的应用，其用于预测抗病毒产品的作用机制。

实施例

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本实施例提供了一种新型抗病毒产品对抗包膜病毒的模型构建，包括抗病毒作用机制模型构建。

所述抗病毒产品中的活性物为熊果酸。

所述包膜病毒为IBV病毒(鸡传染性支气管炎病毒)。

所述抗病毒作用机制模型构建包括对细胞毒性的测定、不同作用模式下抗病毒效果的测定、分子对接法测N蛋白相互作用、检测细胞膜中磷脂和胆固醇含量。

所述对细胞毒性的测定包括以下步骤：Vero细胞经胰酶消化后，以含10wt％小牛血清的DMEM培养液制成2×10⁵/mL细胞悬液，加入96孔培养板中，每孔200μL，24～48h待细胞长至90％左右后，加入不同稀释度的熊果酸(稀释10×4¹～10×4⁸倍)，每个浓度设8个复孔，置5％CO₂培养箱中37℃连续培养72h，培养结束前4h，每孔加入MTT(噻唑蓝，化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，CAS号：298-93-1)20μL，于37℃培养箱中培养4～6h，弃去各孔中液体后，每孔加入二甲基亚矾200μL，微量振荡器振荡5min，自动酶标读数仪比色(波长492nm)测吸光度A值并计算药物对Vero细胞的抑制率，求出对细胞无毒的最大浓度(TD0)。

细胞存活率(％)＝药物组吸光度A值/细胞对照组吸光度A值×100％，抑制率(％)＝100％-存活率。

所述不同作用模式下抗病毒效果的测定包括预处理病毒的作用模式下抗病毒效果的测定、病毒复制的作用模式下抗病毒效果的测定、预处理细胞的作用模式下抗病毒效果的测定、病毒吸附的作用模式下抗病毒效果的测定。

所述预处理病毒的作用模式下抗病毒效果的测定包括以下步骤：以2倍最大无毒浓度的熊果酸溶液100μL与2×100TCID50(TCID50，半数组织培养感染剂量)IBV病毒液100μL混合，室温孵育1h，加到Vero细胞已长成单层的96孔细胞培养板中，37℃吸附1h后，弃去96孔板中液体，加DMEM培养液200μL，于5％CO₂培养箱37℃培养72h。实验同时设细胞对照、病毒对照，MTT法测吸光度A值，计算熊果酸对IBV病毒的抑制率。实验重复3次，取3次实验的平均值作为实验结果。

所述病毒复制的作用模式下抗病毒效果的测定包括以下步骤：以100TCID50IBV病毒液200μL侵染Vero细胞，同时设细胞阴性对照和病毒阳性对照，37℃孵育1h后，弃病毒液，于培养液中加入最大无毒浓度的熊果酸溶液200μL，培养72h，观察CPE(细胞病变效应)，MTT法测吸光度A值。实验重复3次，取3次实验的平均值作为实验结果。

所述预处理细胞的作用模式下抗病毒效果的测定包括以下步骤：以最大无毒浓度的熊果酸溶液200μL加到已长成单层的96孔细胞培养板中，37℃预处理Vero细胞1h，同时设细胞阴性对照和病毒阳性对照，弃去液体，于96孔板中加入100TCID50IBV病毒液200μL，37℃吸附1h后，弃病毒液，加DMEM培养液200μL，于5％CO₂培养箱37℃培养72h，观察CPE，MTT法测吸光度A值。实验重复3次，取3次实验的平均值作为实验结果。

所述病毒吸附的作用模式下抗病毒效果的测定包括以下步骤：将2×最大无毒浓度的熊果酸溶液100μL与2×100TCID50IBV病毒液100μL混合后，立即加到Vero细胞已长成单层的96孔细胞培养板中，37℃吸附1h后，弃去96孔板中液体，加DMEM培养液200μL，于5％CO₂培养箱37℃培养72h。实验同时设细胞对照、病毒对照，MTT法测吸光度A值，计算熊果酸对IBV病毒的抑制率。实验重复3次，取3次实验的平均值作为实验结果。

所述分子对接法测N蛋白相互作用包括以下步骤：利用AutoDock模拟熊果酸与IBV病毒N蛋白的相互作用，预测熊果酸与IBV病毒N蛋白的作用位点。

所述检测细胞膜中磷脂和胆固醇含量包括以下步骤：使用熊果酸处理Vero细胞，测定处理前后磷脂及胆固醇含量，与MβCD(甲基-β-环糊精)处理Vero细胞膜中胆固醇的能力进行比较，研究脂筏中胆固醇在冠状病毒感染中的作用。

总结上述抗病毒作用机制模型构建中的实验结论，得到熊果酸抗病毒的作用机制。根据上述模型构建，还可得到齐墩果酸抗病毒的作用机制。

所述新型抗病毒产品对抗包膜病毒的模型构建还包括产品开发模型构建。

所述产品开发模型构建包括HPLC筛选出含有熊果酸和齐墩果酸的天然植物、天然植物原料组成产品配方、优化五环三萜类抗病毒产品并进行杀灭冠状病毒测试、输出产品。

所述HPLC筛选出含有熊果酸和齐墩果酸的天然植物中的检测条件包括：使用含碳量为27％的C18色谱柱，检测波为210nm，柱温为25℃，流动相为体积比89：11的甲醇和三氟乙酸水溶液。

所述HPLC筛选得到的天然植物为枇杷叶、山楂、白花蛇舌草，利用三种天然植物的提取物组成产品配方，根据杀灭冠状病毒测试逐步改进，输出最终产品。

前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。