阅读说明：本技术 热炎宁制剂指纹特征图谱的建立方法及应用 (Method for establishing fingerprint characteristic spectrum of Reyanning preparation and application thereof ) 是由 杜成强 于 2020-07-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种热炎宁制剂指纹特征图谱的建立方法及应用。该建立方法包括以下步骤：分别配制热炎宁制剂对照品溶液及供试品溶液；分别配制不含有虎杖的热炎宁合剂的第一阴性对照溶液、不含有北败酱的热炎宁合剂的第二阴性对照溶液、不含有半枝莲的热炎宁合剂的第三阴性对照溶液、不含有蒲公英的热炎宁合剂的第四阴性对照溶液；吸取对照品溶液、供试品溶液、第一阴性对照溶液、第二阴性对照溶液、第三阴性对照溶液及第四阴性对照溶液注入高效液相色谱仪,按照高效液相色谱法检测,得到热炎宁制剂指纹特征图谱。应用本发明的技术方案,热炎宁制剂指纹特征图谱具有信息量大,重复性、稳定性良好,精密度高、特征性强,能整体控制多种组分特性。(The invention discloses a method for establishing a fingerprint characteristic spectrum of a Reyanning preparation and application thereof. The establishing method comprises the following steps: respectively preparing a control solution and a test solution of the Reyanning preparation; respectively preparing a first negative control solution without the hotanning mixture of giant knotweed, a second negative control solution without the hotanning mixture of patrinia scabiosaefolia, a third negative control solution without the hotanning mixture of barbed skullcap herb and a fourth negative control solution without the hotanning mixture of dandelion; and (3) sucking the reference substance solution, the test sample solution, the first negative control solution, the second negative control solution, the third negative control solution and the fourth negative control solution, injecting into a high performance liquid chromatograph, and detecting according to the high performance liquid chromatography to obtain the fingerprint characteristic spectrum of the feixianning preparation. By applying the technical scheme of the invention, the fingerprint characteristic spectrum of the Reyanning preparation has the advantages of large information amount, good repeatability and stability, high precision and strong characteristics, and can integrally control the characteristics of various components.)

热炎宁制剂指纹特征图谱的建立方法及应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体而言，涉及一种热炎宁制剂指纹特征图谱的建立方法及应用。

背景技术

热炎宁制剂为《中国药典》品种，由蒲公英、虎杖、北败酱、半枝莲4味药组成。用于外感风热、内郁化火所致的风热感冒、发热、咽喉肿痛、口苦咽干、咳嗽痰黄、尿黄便结；化脓性扁桃体炎，急性咽炎、急性支气管炎、单纯性肺炎见上述证候者。文献报道，该品在治疗上呼吸道感染、感冒发烧、急性咽炎、肺炎等许多呼吸系统疾病方面具有较好作用，尤其在治疗手足口病方面报道较多，显示其抗病毒效果显著。先后被确定为陕西省重点传染病中医防治用药，陕西省预防和治疗新型冠状病毒指定用药。

热炎宁制剂作为中成药，其药效是多种活性成分共同作用的结果。但目前热炎宁制剂现有的质量标准仅测定单一，未对其他有效成分进行检测，存在一定局限性，不能全面反映热炎宁制剂的质量水平。

发明内容

本发明旨在提供一种热炎宁制剂指纹特征图谱的建立方法及应用，以解决现有技术中质量检测不能全面反映热炎宁制剂的质量水平的技术问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种热炎宁制剂指纹特征图谱的建立方法。该建立方法包括以下步骤：分别配制热炎宁制剂对照品溶液及供试品溶液；分别配制不含有虎杖的热炎宁合剂的第一阴性对照溶液、不含有北败酱的热炎宁合剂的第二阴性对照溶液、不含有半枝莲的热炎宁合剂的第三阴性对照溶液、不含有蒲公英的热炎宁合剂的第四阴性对照溶液；吸取对照品溶液、供试品溶液、第一阴性对照溶液、第二阴性对照溶液、第三阴性对照溶液及第四阴性对照溶液注入高效液相色谱仪，按照高效液相色谱法检测，得到热炎宁制剂指纹特征图谱。

进一步地，高效液相色谱仪中采用的色谱柱为C₁₈反相色谱柱。

进一步地，高效液相色谱法检测中采用梯度洗脱，梯度洗脱流速为0.6ml/min～1.4ml/min；流动相为乙腈：0.1％～0.4％磷酸溶液组成的梯度洗脱液；柱温为25～35℃。

进一步地，高效液相色谱法检测中梯度洗脱时间为0～60min。

进一步地，高效液相色谱法检测中检测波长为300～320nm。

进一步地，对照品溶液通过以下步骤制备得到：取大黄素对照品、虎杖苷对照品、木犀草素对照品、绿原酸对照品、咖啡酸对照品，精密称定，加50％～100％甲醇制成每1mL含大黄素60～100μg、虎杖苷280～440μg、木犀草素40～80μg、绿原酸70～110μg、咖啡酸60～100μg的溶液，作为对照品溶液；优选的，加50％～100％甲醇制成每1mL含大黄素80μg、虎杖苷350μg、木犀草素60μg、绿原酸90μg、咖啡酸80μg的溶液，作为对照品溶液。

进一步地，供试品溶液通过以下步骤制备得到：量取热炎宁合剂5～15mL于离心管中，3000～5000r/min离心3～10分钟，精密量取1～3mL上清液，置于100mL容量瓶中，加入50％～100％甲醇80～95mL，超声20～40min，至室温后再加甲醇至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜滤过，取续滤液，得到所述供试品溶液；；优选的，量取热炎宁合剂10mL于离心管中，4000r/min离心5分钟，精密量取2mL上清液，置于100mL容量瓶中，加入甲醇90mL，超声30min，至室温后再加甲醇至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜滤过，取续滤液，得到供试品溶液。

进一步地，第一阴性对照溶液、第二阴性对照溶液、第三阴性对照溶液及第四阴性对照溶液参照2015年版《中国药典》热炎宁合剂提取制备方法工艺制备得到。

根据本发明的另一方面，提供了一种热炎宁制剂指纹特征图谱的建立方法在热炎宁制剂质量检测中的应用。

根据本发明的再一方面，提供了一种热炎宁制剂的质量检测方法。该质量检测方法包括以下步骤：根据上述热炎宁制剂指纹特征图谱的建立方法建立热炎宁制剂指纹特征图谱；根据热炎宁制剂指纹特征图谱对热炎宁制剂的质量进行检测。

应用本发明的技术方案，热炎宁制剂指纹特征图谱具有信息量大，重复性、稳定性良好，精密度高、特征性强，能整体控制多种组分特性，因而，该热炎宁制剂指纹特征图谱应用于质量检测能全面反映热炎宁制剂的质量水平。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了实施例1的10批热炎宁合剂样品HPLC指纹图谱；

图2示出了实施例1的对照指纹图谱；

图3示出了实施例1的共有峰归属，其中，S1为热炎宁合剂，S2为虎杖阴性样，S3为半枝莲阴性样，S4为蒲公英阴性样，S5为北败酱阴性样；

图4A示出了实施例1的对照品HPLC图谱；以及

图4B示出了实施例1的样品HPLC图谱。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

针对目前热炎宁制剂现有的质量检测不能全面反映热炎宁制剂的质量水平的技术问题，本发明通过建立以蒲公英、虎杖、北败酱、半枝莲中化学成分为主要指标的HPLC指纹图谱，共有峰归属和指认来控制热炎宁合剂的质量。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种热炎宁制剂指纹特征图谱的建立方法。该建立方法包括以下步骤：分别配制热炎宁制剂对照品溶液及供试品溶液；分别配制不含有虎杖的热炎宁合剂的第一阴性对照溶液、不含有北败酱的热炎宁合剂的第二阴性对照溶液、不含有半枝莲的热炎宁合剂的第三阴性对照溶液、不含有蒲公英的热炎宁合剂的第四阴性对照溶液；吸取对照品溶液、供试品溶液、第一阴性对照溶液、第二阴性对照溶液、第三阴性对照溶液及第四阴性对照溶液注入高效液相色谱仪，按照高效液相色谱法检测，得到热炎宁制剂指纹特征图谱。

应用本发明的技术方案，热炎宁制剂指纹特征图谱具有信息量大，重复性、稳定性良好，精密度高、特征性强，能整体控制多种组分特性，因而，该热炎宁制剂指纹特征图谱应用于质量检测能全面反映热炎宁制剂的质量水平。

优选的，高效液相色谱仪中采用的色谱柱为C₁₈反相色谱柱。

优选的，高效液相色谱法检测中采用梯度洗脱，梯度洗脱流速为0.6ml/min～1.4ml/min；流动相为乙腈：0.1％～0.4％磷酸溶液组成的梯度洗脱液；柱温为25～35℃。

优选的，高效液相色谱法检测中梯度洗脱时间为0～60min。

优选的，高效液相色谱法检测中检测波长为300～320nm。

根据本发明一种典型的实施方式，对照品溶液通过以下步骤制备得到：取大黄素对照品、虎杖苷对照品、木犀草素对照品、绿原酸对照品、咖啡酸对照品，精密称定，加50％～100％甲醇制成每1mL含大黄素60～100μg、虎杖苷280～440μg、木犀草素40～80μg、绿原酸70～110μg、咖啡酸60～100μg的溶液，作为对照品溶液；优选的，加50％～100％甲醇制成每1mL含大黄素80μg、虎杖苷350μg、木犀草素60μg、绿原酸90μg、咖啡酸80μg的溶液，作为对照品溶液。

根据本发明一种典型的实施方式，供试品溶液通过以下步骤制备得到：量取热炎宁合剂5～15mL于离心管中，3000～5000r/min离心3～10分钟，精密量取1～3mL上清液，置于100mL容量瓶中，加入50％～100％甲醇80～95mL，超声20～40min，至室温后再加甲醇至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜滤过，取续滤液，得到所述供试品溶液；；优选的，量取热炎宁合剂10mL于离心管中，4000r/min离心5分钟，精密量取2mL上清液，置于100mL容量瓶中，加入甲醇90mL，超声30min，至室温后再加甲醇至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜滤过，取续滤液，得到所述供试品溶液。

根据本发明一种典型的实施方式，第一阴性对照溶液、第二阴性对照溶液、第三阴性对照溶液及第四阴性对照溶液参照2015年版《中国药典》热炎宁合剂提取制备方法工艺制备得到。

根据本发明一种典型的实施方式，提供上述热炎宁制剂指纹特征图谱的建立方法在热炎宁制剂质量检测中的应用。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种热炎宁制剂的质量检测方法。该质量检测方法包括以下步骤：根据上述热炎宁制剂指纹特征图谱的建立方法建立热炎宁制剂指纹特征图谱；根据热炎宁制剂指纹特征图谱对热炎宁制剂的质量进行检测。

应用本发明的技术方案，热炎宁制剂指纹特征图谱具有信息量大，重复性、稳定性良好，精密度高、特征性强，能整体控制多种组分特性，因而，该热炎宁制剂指纹特征图谱应用于质量检测能全面反映热炎宁制剂的质量水平。

下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。

实施例1

1.材料

1.1仪器Agilent1260 infinityII型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；AG285型电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；L-500型离心机(长沙湘仪离心机有限公司)。

1.2试剂与试药对照品虎杖苷(批号111575-201603，纯度87.3％)，大黄素(批号110756-201512，纯度98.7％)，木犀草素(批号111520-201605，纯度99.6％)，咖啡酸(批号110885-201703，纯度99.7％)，绿原酸(批号110753-201817，纯度96.8％)均购于中国食品药品检定研究院；热炎宁合剂(清华德人西安幸福制药有限公司)；色谱乙腈、色谱甲醇(美国Fisher公司)；磷酸(色谱纯，天津市大茂化学试剂厂)；甲醇(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；水为娃哈哈纯净水。

2.方法与结果

2.1色谱条件Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色谱柱(150mm×4.6mm，4μm)；流动相；乙腈(A)：0.1％磷酸(B)；梯度洗脱程序(0-35min，10％-35％A，90％-65％B；35-40min，35％-85％A，65％-15％B；40-45min，85％-100％A，15％-0％B；45-50min，100％-10％A，0％-90％B；50-60min，10％-10％A，90％-90％B)；体积流量0.8mL/min；检测波长：305nm；柱温30℃；进样量10mL。

2.2溶液制备

2.2.1对照品溶液制备取大黄素对照品、虎杖苷对照品、木犀草素对照品、绿原酸对照品、咖啡酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含大黄素80μg、虎杖苷350μg、木犀草素60μg、绿原酸90μg、咖啡酸80μg的溶液，即得。

2.2.2供试品溶液量取热炎宁合剂10mL于离心管中，离心(4000转/min)5分钟，精密量取2mL上清液，置于100mL容量瓶中，加入甲醇90mL，超声30min，至室温后再加甲醇至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜滤过，取续滤液，即得。10批热炎宁合剂为清华德人西安幸福制药有限公司生产，样品批号见表1。

表1

2.2.3阴性样品溶液参照2015年版《中国药典》(一部)热炎宁合剂提取制备方法，分别制备缺4味药材的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3方法学考察

2.3.1精密度考察按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下连续进样6针，以大黄素为参照峰，测得各共有峰相对峰面积RSD％<3％，相对保留时间RSD％<2％，表明仪器精密度良好。

2.3.2稳定性考察按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下于0、2、4、8、12、24h进样，以大黄素为参照峰，测得各共有峰相对峰面积RSD％<3％，相对保留时间RSD％<1％，表明供试品溶液24h内稳定性良好。

2.3.3重复性试验按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，以大黄素为参照峰，测得各共有峰相对峰面积RSD％<3％，相对保留时间RSD％<2％，表明该方法重现性良好。

2.4指纹图谱建立

2.4.1共有峰标定，选取大黄素为参照峰，色谱图中各色谱峰保留时间与参照峰(S)保留时间的比值为相对保留时间进行计算，结果见图1，其中13个峰为10批样品共有，标定为共有峰。

2.4.2相似度评价共有峰通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)分析，中位数法建立对照指纹图谱，结果见图2。10批样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均在0.980以上，结果见表2。

表2相似度分析结果

2.4.3专属性考察分别吸取4种阴性样品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，色谱图见图3。通过与阴性样比较可以得出，1号、2号、3号、5号峰归属北败酱及蒲公英(北败酱及蒲公英化学成分相似)，4号、6号、7号、10号、11、号12号、13号归属虎杖，8号峰归属半枝莲，9号峰属归北败酱，其中虎杖色谱峰贡献最大(峰号对应图2)。

2.4.4共有峰指认吸取2.2.1项对照品溶液及2.2.2供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，色谱图见图4A和图4B。通过对照品对共有峰进行指认：2号峰为绿原酸、3号峰咖啡酸、4号峰为虎杖苷，9号峰为木犀草素，13号峰为大黄素，共指认5个共有峰。

3.讨论

本实验用乙醇、甲醇、乙腈分别对样品进行处理，结果发现甲醇处理样品后基线更稳定，峰数量较多，因此本实验采用甲醇处理样品。本实验用甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1％磷酸，乙腈0.4％磷酸分别做梯度考察，结果发现用乙腈-0.1％磷酸进行梯度洗脱，基线平稳，各峰分离度较好，因此采用乙腈-0.1％磷酸作为梯度洗脱流动相。本研究还对流速，检测波长，柱温等进行了考察，最后选流速为0.8mL/min；检测波长：305nm；柱温30℃。

本方法的13个共有峰分别归属于4种药材中，能全面反映热炎宁合剂中各种成分的分布和比例关系，对更好控制热炎宁合剂质量发挥重要作用。

上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。