阅读说明：本技术 化湿败毒组合物特征图谱的构建方法 (Method for constructing characteristic spectrum of dampness-resolving and toxin-vanquishing composition ) 是由 魏梅 程学仁 陈向东 邓淙友 罗文汇 霍文杰 李国卫 何广铭 何民友 杨晓东 吴 于 2020-08-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种化湿败毒组合物特征图谱的构建方法,其中,化湿败毒组合物主要包括以下组分：麻黄,炒苦杏仁,生石膏,甘草,广藿香,厚朴,麸炒苍术,炒草果仁,法半夏,茯苓,大黄,黄芪,葶苈子,赤芍；化湿败毒组合物特征图谱的构建方法包括：制备芍药苷、甘草素、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、甘草酸、和厚朴酚、厚朴酚混合对照品溶液；制备供试品溶液；然后注入液相色谱仪测试,建立化湿败毒组合物的特征图谱。本发明中的方法重现性良好,准确可靠,可为化湿败毒组合物质量控制提供数据基础,有效保证化湿败毒组合物产品质量的稳定性和可控性。(The invention discloses a method for constructing a characteristic spectrum of a dampness-resolving and toxin-vanquishing composition, wherein the dampness-resolving and toxin-vanquishing composition mainly comprises the following components: ephedra, fried bitter almond, gypsum, liquorice, patchouli, mangnolia officinalis, bran-fried rhizoma atractylodis, fried grass nut, rhizoma pinellinae praeparata, poria cocos, rheum officinale, astragalus membranaceus, semen lepidii and red paeony root; the construction method of the dampness-eliminating and toxin-vanquishing composition characteristic spectrum comprises the following steps: preparing paeoniflorin, liquiritigenin, chrysophanol-8-O-glucoside, glycyrrhizic acid, honokiol and magnolol mixed reference substance solution; preparing a test solution; then injecting the mixture into a liquid chromatograph for testing, and establishing a characteristic spectrum of the dampness-resolving and toxin-vanquishing composition. The method has good reproducibility, accuracy and reliability, can provide a data basis for controlling the quality of the dampness-resolving and toxin-vanquishing composition, and effectively ensures the stability and controllability of the product quality of the dampness-resolving and toxin-vanquishing composition.)

化湿败毒组合物特征图谱的构建方法

技术领域

本发明涉及中药质量分析检测技术领域，尤其涉及一种化湿败毒组合物特征图谱的构建方法。

背景技术

2019新型冠状病毒（COVID-19）感染引起的肺炎疫情，由于传染性强，传播迅速，人群普遍易感，且特效药缺乏，已在全球范围内形成大流行，成为了全球性的超重大公共卫生突发事件。中医药在抗击新冠肺炎疫情的过程中，发挥了独特的、重要的作用。中国中医药管理局指出，经研究筛选，“三药三方”中的金花清感颗粒、连花清瘟颗粒、血必净注射液、清肺排毒汤、化湿败毒方、宣肺败毒方在此次抗击疫情中发挥了良好的作用。

化湿败毒方由14味中药组成，包括生麻黄、杏仁、生石膏、甘草、藿香、厚朴、苍术、草果、法半夏、茯苓、生大黄、生黄芪、葶苈子和赤芍。临床实验表明，化湿败毒方对改善患者症状、提高核酸转阴率具有突出的作用。但目前对于化湿败毒方的研究多集中在药理、疗效的研究，尚无对于其质量标准的研究。且现有的生产也仅限于小范围内进行，无大规模工业化生产，对质量监控的要求也相对较低。

文献《抗新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的化湿败毒颗粒药味的物质基础研究》（中国现代中药，2020年第3期）研究了各味药物的物质基础。但并未对药品的具体质量控制方法进行研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种化湿败毒组合物特征图谱的构建方法，该方法重现性良好，准确可靠，可为化湿败毒组合物大生产质量控制提供数据基础，保证化湿败毒组合物产品质量的稳定性和可控性。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种化湿败毒组合物特征图谱的构建方法，所述化湿败毒组合物主要包括以下组分：麻黄，炒苦杏仁，生石膏，甘草，广藿香，厚朴，麸炒苍术，炒草果仁，法半夏，茯苓，大黄，黄芪，葶苈子，赤芍；

所述化湿败毒组合物特征图谱的构建方法包括：

（1）分别取芍药苷对照品、甘草素对照品、大黄酚-8-O-葡萄糖苷对照品、甘草酸对照品、和厚朴酚对照品、厚朴酚对照品适量，加入溶剂溶解或提取，制得对照品溶液；

（2）取化湿败毒组合物，加提取溶剂提取，制得供试品溶液；

（3）取预设量的对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，所述液相色谱仪以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，甲酸溶液为流动相B进行梯度洗脱，建立化湿败毒组合物的特征图谱。

作为上述技术方案的改进，步骤（2）中，所述提取溶剂为50~100%甲醇或50~70%乙醇；提取方式为超声提取或回流提取。

作为上述技术方案的改进，步骤（2）包括：

取化湿败毒组合物，研细，取0.5~1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50%~70%甲醇20~30mL，称定重量，加热回流处理30~90分钟，取出，放冷，再称定重量，用50%~70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，制得供试品溶液。

作为上述技术方案的改进，步骤（2）包括：

取化湿败毒组合物，研细，取0.5~1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50%~70%甲醇20~30mL，称定重量，采用功率为200~300 kW，频率为35~45 kHz的超声处理30~90分钟，取出，放冷，再称定重量，用50%~70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，制得供试品溶液。

作为上述技术方案的改进，步骤（3）中，所述甲酸溶液的体积浓度为0.05~0.2%。

作为上述技术方案的改进，所述甲酸溶液的体积浓度为0.05%。

作为上述技术方案的改进，所述梯度洗脱按下述程序进行：

0~1min，流动相A从3%→6%，流动相B从97%→94%；

1~3min，流动相A从6%→11%，流动相B从94%→89%；

3~5min，流动相A从11%→13%，流动相B从89%→87%；

5~15min，流动相A从13%→16%，流动相B从87%→84%；

15~22min，流动相A从16%→19%，流动相B从84%→81%；

22~30min，流动相A从19%→23%，流动相B从81%→77%；

30~35min，流动相A从23%→27%，流动相B从77%→73%；

35~40min，流动相A从27%→34%，流动相B从73%→66%；

40~45min，流动相A从34%→36%，流动相B从66%→64%；

45~50min，流动相A从36%→50%，流动相B从64%→50%；

50~65min，流动相A从50%→60%，流动相B从50%→40%。

作为上述技术方案的改进，步骤（3）中，分别吸取对照品溶液和供试品溶液各1~3μL，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm；以乙腈为流动相A，以0.05%~0.2%的甲酸溶液为流动相B；流速为0.28~0.32 mL/min；柱温为28~32℃，检测波长为235~250 nm。

作为上述技术方案的改进，步骤（3）中，分别吸取对照品溶液和供试品溶液各1μL，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm；以乙腈为流动相A，以0.05%的甲酸溶液为流动相B；流速为0.3mL/min；柱温为30℃，检测波长为235~250nm。

作为上述技术方案的改进，步骤（3）中，检测时间为0~18分钟时，检测波长为235nm；检测时间为18~65分钟时，检测波长为250 nm。

作为上述技术方案的改进，所述化湿败毒组合物特征图谱包括11个特征峰；其中，与大黄酚-8-O-葡萄糖苷对照品峰相对应的峰为S峰，各特征峰与S峰的相对保留时间应该在规定值的±10％之内；所述规定值包括：峰2为0.43、峰3为0.60、峰5为0.82、峰6为0.96、峰8为1.25。

实施本发明，具有如下有益效果：

本发明首次建立了化湿败毒组合物的特征图谱，该特征图谱可充分展示化湿败毒组合物的化学成分特征，特征峰信息量丰富，可全面地反映化湿败毒组合物的质量信息，从而能够达到全面、有效地控制化湿败毒组合物产品质量的目的。同时，本发明中的特征图谱构建方法重现性良好，准确可靠，稳定性好。

附图说明

图1是本发明中化湿败毒组合物采用不同洗脱梯度测定的特征图谱；

图2是本发明中化湿败毒组合物采用不同色谱柱测定的特征图谱；

图3是本发明中化湿败毒组合物采用不同吸收波长测定的特征图谱；

图4是本发明中化湿败毒组合物采用不同流动相测定的特征图谱；

图5是本发明中化湿败毒组合物采用不同浓度流动相测定的特征图谱；

图6是本发明化湿败毒组合物采用不同提取溶剂提取的特征图谱；

图7是本发明化湿败毒组合物采用不同提取方式提取的特征图谱；

图8是本发明化湿败毒组合物采用不同提取时间提取的特征图谱；

图9是本发明化湿败毒组合物特征图谱专属性考察中化湿败毒组合物、葶苈子对照药材、缺葶苈子阴性样品的特征图谱；

图10是本发明化湿败毒组合物特征图谱专属性考察中化湿败毒组合物、甘草对照药材、缺甘草阴性样品的特征图谱；

图11是本发明化湿败毒组合物特征图谱专属性考察中化湿败毒组合物、赤芍对照药材、缺赤芍阴性样品的特征图谱；

图12是本发明化湿败毒组合物特征图谱专属性考察中化湿败毒组合物、厚朴对照药材、缺厚朴阴性样品的特征图谱；

图13是本发明化湿败毒组合物特征图谱专属性考察中化湿败毒组合物、石膏工作对照药材、茯苓对照药材的特征图谱；

图14是本发明化湿败毒组合物特征图谱专属性考察中化湿败毒组合物、大黄对照药材、缺大黄阴性样品的特征图谱；

图15是本发明化湿败毒组合物特征图谱专属性考察中化湿败毒组合物、麻黄对照药材、缺麻黄阴性样品的特征图谱；

图16是本发明化湿败毒组合物特征图谱专属性考察中化湿败毒组合物、炒草果仁工作对照药材、缺炒草果仁阴性样品的特征图谱；

图17是本发明化湿败毒组合物特征图谱专属性考察中化湿败毒组合物、广藿香对照药材、缺广藿香阴性样品的特征图谱；

图18是本发明化湿败毒组合物特征图谱专属性考察中化湿败毒组合物、麸炒苍术工作对照药材、缺麸炒苍术阴性样品的特征图谱；

图19是本发明化湿败毒组合物特征图谱专属性考察中化湿败毒组合物、法半夏工作对照药材、缺法半夏阴性样品、缺法半夏和甘草双阴性样品的特征图谱；

图20是本发明化湿败毒组合物特征图谱专属性考察中化湿败毒组合物、黄芪对照药材、缺黄芪阴性样品的特征图谱；

图21是本发明化湿败毒组合物特征图谱专属性考察中化湿败毒组合物、炒苦杏仁工作对照药材、缺炒苦杏仁阴性样品的特征图谱；

图22是本发明化湿败毒组合物特征图谱专属性考察中各对照品、阴性样品、化湿败毒组合物的特征图谱；

图23是本发明化湿败毒组合物特征图谱中间精密度考察中采用不同仪器测定时化湿败毒组合物的特征图谱；

图24是本发明化湿败毒组合物特征图谱耐用性考察中采用不同柱温测定时化湿败毒组合物的特征图谱；

图25是本发明化湿败毒组合物特征图谱耐用性考察中采用不同流速测定时化湿败毒组合物的特征图谱；

图26是本发明化湿败毒组合物特征图谱耐用性考察中采用不同色谱柱测定时化湿败毒组合物的特征图谱；

图27是本发明15批次化湿败毒组合物小试样品的特征图谱叠加图；其中，峰1为芍药苷峰，峰4为甘草素峰，峰7为大黄酚-8-O-葡萄糖苷峰，峰9为甘草酸峰，峰10为和厚朴酚峰，峰11为厚朴酚峰；

图28是本发明6批次化湿败毒组合物生产样品的特征图谱叠加图；其中，峰1为芍药苷峰，峰4为甘草素峰，峰7为大黄酚-8-O-葡萄糖苷峰，峰9为甘草酸峰，峰10为和厚朴酚峰，峰11为厚朴酚峰；

图29是本发明化湿败毒组合物小试样品的对照特征图谱；其中，峰1为芍药苷峰，峰4为甘草素峰，峰7为大黄酚-8-O-葡萄糖苷峰，峰9为甘草酸峰，峰10为和厚朴酚峰，峰11为厚朴酚峰；

图30是本发明化湿败毒组合物生产样品的对照特征图谱，其中，峰1为芍药苷峰，峰4为甘草素峰，峰7为大黄酚-8-O-葡萄糖苷峰，峰9为甘草酸峰，峰10为和厚朴酚峰，峰11为厚朴酚峰。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施方式对本发明作进一步地详细描述。

本发明化湿败毒组合物主要包括以下组分：麻黄，炒苦杏仁，生石膏，甘草，广藿香，厚朴，麸炒苍术，炒草果仁，法半夏，茯苓，大黄，黄芪，葶苈子，赤芍。

本发明化湿败毒组合物，方中以麻黄、广藿香、石膏为君药，麻黄、广藿香，辛、苦、温兼气味芳香，解表平喘，化湿和中；石膏，辛、甘、寒，清泻肺胃郁热兼以生津，三药相辅，以达解表散寒、芳香化湿、清热平喘之效。炒苦杏仁、法半夏、厚朴、麸炒苍术、炒草果仁、茯苓共为臣药，炒苦杏仁、法半夏、厚朴，辛、苦、温，行气降逆，开结平喘；麸炒苍术、炒草果仁，辛烈、苦温，入脾胃经，燥湿健脾、破戾气所结；茯苓，淡渗除湿健脾；六味药共用以达助君药燥湿健脾，行气通窍，疏泄腠理，助邪外出之效。以黄芪、赤芍、葶苈子、大黄为佐药，黄芪，甘温益肺脾气，赤芍，苦、微寒，凉血散瘀，用以治疗疫病后期伤其正气，气机郁闭导致的血瘀等；葶苈子辛寒，辅助君药石膏清泄肺热，兼以利水，预防或治疗“湿肺（肺水肿）病变”；大黄，苦寒入大肠经而通腑，肺与大肠相表里，辅助君药石膏清泄肺热，并配合赤芍凉血活血，四药共为佐药，以达顾护正气、泻热凉血、活血化瘀之效。以甘草为使药，甘草甘平，调和诸药，配赤芍取芍药甘草汤意缓急。全方共奏解表化湿，清热平喘、益气散瘀之功。

临床发现新冠肺炎重型患者具有如下特点：①发热为主要表现多为身热不扬，缠绵难愈，但亦可为中低热，甚至不发热；②喘憋、乏力显著，亦为主要表现；③多合并纳差、便溏、腹泻等消化系统症状；④大多舌苔厚腻。从上述特点来看，符合湿邪致病特点：重浊、碍气伤阳、黏滞、趋下。湿邪既可单独致病，又可兼寒、兼热，表现为寒湿、湿热，其中热可为伏燥所致，亦可为湿邪久郁所化。湿邪、寒湿、湿热均可与疫毒合而致病，可见于轻型的寒湿郁肺、湿热蕴肺，普通型的湿毒郁肺、寒湿阻肺，若失治误治，或疾病发展，伤及营血，逆传心包，演变为新冠肺炎重型。因此，认为新冠肺炎突出表现为“湿毒疫”，病位在肺，与脾密切相关，病理性质为寒热错杂、虚实并见，病理因素为毒、湿、热、寒、瘀、虚，其中疫毒为根本，核心病机为疫毒与湿邪博结，可兼寒、热侵袭机体，闭阻胸肺，气机升降失常，血脉瘀阻，气阴耗伤。新冠肺炎病理性质复杂，涉及多个病理因素。

主要病位在肺，其次在脾胃，湿毒郁闭是其核心病机，可分为初期、中期、危重期及恢复期四期进行辨证论治，治法有化湿行气，辟秽解毒，清肺化痰，活血化瘀、通腑攻下和补益正气等方法。因此，本发明化湿败毒组合物配伍依据核心病机，当以解表化湿，清热平喘，祛毒为核心治法，兼以化瘀通络，益气养阴。疫毒与寒湿相合，恶寒发热，治宜解表化湿祛毒；疫毒与湿热相合，便溏不爽，倦怠乏力，治宜清热化湿祛毒，兼以益气养阴；闭阻胸肺，喘憋、胸闷、气短，治宜平喘，兼以化瘀通络。

本发明化湿败毒组合物融合了《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第五版）》中医治疗的核心病机，属温热夹湿，致肺失宣降，肺气壅闭”，以湿浊化热郁肺为主，突显化湿行气，宣肺平喘，清热化痰，益气活血之功效。前期临床观察显示，本发明能够改善重型新型冠状病毒感染肺炎的临床症状，对于重症患者，可明显缓解咳嗽、乏力、口干或呕吐等主要症状，中西医结合治疗后，治愈时间缩短。明显改善患者的呼吸功能，脱离吸氧时间缩短。对于普通型患者，对发热症状明显缓解，还可改善食欲减退、胸闷症状。对于重型及普通型新型冠状病毒感染肺炎的咳嗽、乏力、口干或呕吐等临床症状改善显著，补充了目前疫情形势急需的重型及普通型新型冠状病毒感染肺炎治疗用药。

优选的，化湿败毒组合物包括以下组分：

麻黄3-60份，炒苦杏仁4.5-90份，生石膏7.5-150份，甘草1.5-30份，广藿香5-100份，厚朴5-100份，麸炒苍术7.5-150份，炒草果仁5-100份，法半夏4.5-90份，茯苓7.5-150份，大黄2.5-50份，黄芪5-100份，葶苈子5-100份，赤芍5-100份，辅料适量。

所述化湿败毒组合物被制成中药制剂，所述中药制剂为颗粒剂、汤剂、散剂、胶囊剂、口服液、片剂或丸剂，但不限于此。

为了全面地反映化湿败毒组合物的质量信息，实现全面、有效地控制化湿败毒组合物产品质量，本发明提供了一种化湿败毒组合物特征图谱的建立方法，以下对其进行详细说明：

1 仪器与试药

仪器：Waters 超高效液相色谱仪（H-Class，沃特世有限公司），Thermo超高效液相色谱仪（Vanquish，赛默飞世尔科技（中国）有限公司），Agilent SB C18色谱柱(2.1×150mm，1.8μm)、Phenomenex Luna Omega C18色谱柱（2.1×150mm，1.6μm）Waters BEH C18色谱柱（2.1mm×150mm，1.7μm），万分之一天平（ME204E，梅特勒-托利多公司），百万分之一天平（XP26，梅特勒-托利多公司），数控超声波清洗器（KQ500D，昆山市超声仪器有限公司），恒温水浴锅（HWS28型，上海一恒科技有限公司），超纯水系统（Milli-Q Direct，默克股份有限公司）。

试剂：乙醇（西陇科学股份有限公司）、甲醇（西陇科学股份有限公司）均为分析纯；液相用甲酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）、冰醋酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）、36%乙酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）、乙腈（默克股份有限公司）、甲醇（默克股份有限公司）为HPLC色谱级，水为超纯水（实验室自制）。

试药：甘草素对照品（批号：wkq18030505，含量：98.0%，成都普菲德生物技术有限公司）；甘草酸对照品（批号：110731-201720，含量：97.7%，中国食品药品鉴定研究院）；芍药苷对照品（批号：110736-201943，含量：95.1%，中国食品药品鉴定研究院）；大黄酚-8-O-葡萄糖苷对照品（批号：CFN99410，含量：98.0%，ChemFaces）；厚朴酚对照品（批号：110729-201714，含量：100%，中国食品药品鉴定研究院）；和厚朴酚对照品（批号：110730-201915，含量：99.8%，中国食品药品鉴定研究院）；麻黄对照药材（批号：121051-200704，中国食品药品检定研究院）；赤芍对照药材（批号：121093-201804，中国食品药品检定研究院）；厚朴对照药材（批号：121285-201303，中国食品药品检定研究院）；甘草对照药材（批号：120904-201620，中国食品药品检定研究院）；大黄对照药材（批号：120984-201202，中国食品药品检定研究院）；茯苓对照药材（批号：121117-201910，中国食品药品检定研究院）；黄芪对照药材（批号：120974-201612，中国食品药品检定研究院）；广藿香对照药材（批号：121135-201606，中国食品药品检定研究院）；炒草果仁工作对照药材、石膏工作对照药材、法半夏工作对照药材、麸炒苍术工作对照药材、炒苦杏仁工作对照药材、葶苈子对照药材均来源于广东一方制药有限公司（某药材的工作对照药材是指该药材的标准药材按照《中华人民共和国药典》（2015版）记载的炮制工艺炮制后得到的药材）；化湿败毒颗粒生产样品（批号：P1~P6）、化湿败毒颗粒小试样品（批号：S1~S15）均来源于广东一方制药有限公司）、糊精（批号：FC1901004，曲阜天利药用辅料有限公司）、甜菊素（批号：TJ2004011，曲阜圣仁制药有限公司）。

色谱条件与参照物溶液、供试品溶液的制备

2.1 色谱条件

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm）；以乙腈为流动相A，以0.05%甲酸溶液为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.30mL；柱温为30℃；0~18分钟检测波长为235nm，18~65分钟检测波长为250nm。理论板数按大黄酚-8-O-葡萄糖苷峰计算应不低于50000。

2.2 参照物溶液的制备

对照品溶液的制备：取芍药苷对照品、甘草素对照品、大黄酚-8-O-葡萄糖苷对照品、甘草酸对照品、和厚朴酚对照品、厚朴酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含芍药苷160μg、甘草素25μg、大黄酚-8-O-葡萄糖苷20μg、甘草酸40μg、和厚朴酚3μg、厚朴酚4μg的混合对照品溶液，即得。

对照药材参照物溶液的制备：分别取麻黄、赤芍、大黄、厚朴、葶苈子、茯苓、黄芪、甘草、广藿香对照药材及炒草果仁、石膏、法半夏、麸炒苍术、炒苦杏仁工作对照药材约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水25mL，加热回流60分钟，取出，放冷，滤过，蒸干，用70%甲醇25mL溶解，转移置具塞锥形瓶中，称定重量，加热回流60分钟，取出，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取化湿败毒组合物适量，研细，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，称定重量，加热回流处理60分钟，取出，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 测定法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μL，注入液相色谱仪，测定，即得到特征图谱。供试品特征色谱中应呈现11个特征峰，其中6个峰应分别与相应的对照品峰保留时间相对应，具体的，峰1为芍药苷峰，峰4为甘草素峰，峰7为大黄酚-8-O-葡萄糖苷峰，峰9为甘草酸峰，峰10为和厚朴酚峰，峰11为厚朴酚峰。选定与大黄酚-8-O-葡萄糖苷对照品峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内；规定值为：0.43（峰2）、0.60（峰3）、0.82（峰5）、0.96（峰6）、1.25（峰8）。

色谱条件的确定

3.1 不同洗脱梯度的考察

梯度1：以Waters BEH C18柱（2.1×150mm，1.7μm）为色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.05%甲酸为流动相B，按照表2进行梯度洗脱；检测波长：0~18分钟为235nm，18~80分钟为250nm，柱温为30℃，流速为每分钟0.3mL，进样量为1μL，结果见图1。

梯度2：以Waters BEH C18柱（2.1×150mm，1.7μm）为色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.05%甲酸为流动相B，按照表3进行梯度洗脱；检测波长：0~18分钟时为235nm，18~80分钟时为250nm.，柱温为30℃，流速为每分钟0.3mL，进样量为1μL，结果见图1。

梯度3：以Waters BEH C18柱（2.1×150mm，1.7μm）为色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.05%甲酸为流动相B，分别按照表4进行梯度洗脱；检测波长：0~18分钟时为235nm，18~65分钟时为250nm，柱温为30℃，流速为每分钟0.3mL，进样量为1μL，结果见图1。

比较3个不同洗脱梯度，梯度2和梯度3色谱峰更多，能涵括更多药材特征峰信息，如：在采用梯度2和梯度3时，在乙腈比例为15%左右时，赤芍中芍药苷成分被洗脱出来，而在梯度1中则无法被洗脱出来。就梯度2和梯度3比较而言，梯度3中各色谱峰的分离度比梯度2中各色谱峰的分离度要好，综上，选择梯度3作为最佳色谱洗脱条件。

3.2 不同色谱柱的考察

对不同厂家超高色谱柱进行考察，包括：Agilent SB C18(2.1×150mm，1.7μm)、Phenomenex Luna Omega C18（2.1×150mm，1.6μm）、Waters BEH C18（2.1×150mm，1.7μm）三个不同厂家的色谱柱，确定最适合色谱柱。以乙腈为流动相A，以0.05%甲酸为流动相B，按表4中的规定进行梯度洗脱，流速为每分钟0.3mL；进样量为1μL；检测波长：0~18分钟时为235nm，18~60分钟时为250nm；结果见图2。

结果显示，三个不同厂家色谱柱对各色谱峰分离效果不同，Waters BEH 色谱柱对各色谱峰的分离效果较好，峰型较佳。因此，选择Waters BEH C18（2.1×150mm，1.7μm）作为分析色谱柱。

3.3 最佳吸收波长的确定

对不同吸收波长进行考察；吸收波长分别为235nm、240nm、250nm和300nm。采用WatersBEH C18（2.1mm×150mm，1.7μm）色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.05%甲酸为流动相B，按表4中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3mL；进样量为1μL；结果见图3。

通过对比4种检测波长色谱图，可发现选取235nm和240nm作为检测波长时，在35分钟后，基线不平稳；选取250nm、300nm波长时，整体色谱峰的响应值变低。

进一步的，通过查阅赤芍、大黄、厚朴、甘草等药材的文献，发现芍药苷的最佳吸收波长在230nm左右，厚朴中主要成分厚朴酚、和厚朴酚分别在250nm和290nm左右时有最大吸收，甘草中甘草酸的检测波长一般在250nm左右。

综合以上考虑，为尽可能体现各药材的特征峰、保证各色谱峰的响应值以及保证基线平稳，选择测试时间为0~18分钟时，检测波长为235nm；测试时间为18~65分钟时，检测波长为250nm。

3.4 流动相的考察

（1）对流动相中缓冲液（流动相B）的种类进行考察，分别选用0.1%磷酸溶液、0.1%醋酸溶液、0.05%甲酸溶液；采用Waters BEH C18（2.1mm×150mm，1.7μm）色谱柱；以乙腈为流动相A，按表4中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3mL；0~18分钟时检测波长为235nm，18~65分钟时检测波长为250nm；进样量为1μL，结果见图4。

（2）对流动相中缓冲液（流动相B）的浓度进行考察，分别选用0.05%甲酸溶液、0.1%甲酸溶液、0.2%甲酸溶液；采用Waters BEH C18（2.1mm×150mm，1.7μm）色谱柱；以乙腈为流动相A，按表4中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3mL；0~18分钟时检测波长为235nm，18~65分钟时检测波长为250nm；进样量为1μL，结果见图5。

比较0.1%磷酸溶液、0.1%醋酸溶液以及0.05%甲酸溶液三个色谱图，发现0.05%甲酸溶液峰信息完整，且分离度最佳；通过对不同浓度的甲酸溶液进行比较，三种不同浓度的甲酸溶液对整体峰信息影响较小，但0.05%甲酸溶液在切换波长时，基线波动较小。综上，采用0.05%甲酸溶液作为缓冲液（流动相B）。

供试品溶液制备方法考察

4.1 提取溶剂考察

对不同溶剂对化湿败毒组合物特征图谱的影响进行考察，分别以100%甲醇、70%甲醇、50%甲醇、20%甲醇、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、20%乙醇（上述浓度均为体积浓度）为提取溶剂，通过观察化湿败毒组合物中11个特征峰的峰型和分离度，并计算11个特征峰的“总峰面积/称样量”比较不同提取溶剂对化湿败毒组合物特征图谱的影响，选择最佳提取溶剂。

具体的，取化湿败毒组合物适量，研细，取约1.0g，精密称定，平行八组，每组两份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入100%甲醇、70%甲醇、50%甲醇、20%甲醇、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、20%乙醇25mL，称定重量，回流处理30分钟，取出，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，按2.1项下色谱条件进样分析，结果见图6、表5。

结果显示：95%乙醇、20%甲醇、20%乙醇作为提取溶剂时提取不完全，其他溶剂对各特征峰的提取效果相近，各特征峰的峰型及分离效果无明显差异，其中以70%甲醇、70%乙醇为提取溶剂时，11个特征峰的“总峰面积/称样量”最大，70%甲醇作为提取溶剂时，各特征峰的理论塔板数更优，因此选择70%甲醇为提取溶剂。

4.2 提取方式考察

对不同提取方式对化湿败毒组合物特征图谱的影响进行考察，分别考察超声与回流两种提取方式，观察11个特征峰的峰型和分离度，并计算11个特征峰的“总峰面积/称样量”，比较不同提取方式对化湿败毒组合物特征图谱的影响。

具体的，取化湿败毒组合物适量，研细，取约1.0g，精密称定，平行2组，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，称定重量，分别超声处理（功率250W，频率40kHz）60分钟、加热回流60分钟，取出，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液；按2.1项下色谱条件进样分析，结果见图7、表6。

结果显示：采用不同的提取方式，各特征峰的峰型、分离效果都无明显区别，但回流处理的“总峰面积/称样量”的值高于超声处理，为保证提取完全考虑，选择回流处理。

4.3 提取时间考察

考察提取时间对化湿败毒组合物特征图谱的影响，通过11个特征峰的“总峰面积/称样量”来比较不同的提取时间对化湿败毒组合物特征图谱的影响。

具体的，取化湿败毒颗粒适量，研细，取约1.0g，精密称定，平行3组，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，称定重量，分别加热回流处理30分钟、60分钟、90分钟，取出，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液。按2.1项下色谱条件进样分析，结果见图8、表7。

结果显示：采用不同的提取时间，11个特征峰的“总峰面积/称样量”无明显差别，30分钟提取时双样间存在一定偏差，考虑到实验环境的影响，为保证方法的耐用性及提取完全，选择回流提取时间为60分钟。

4.4 供试品溶液制备方法的确定

根据上述实验结果，化湿败毒组合物特征图谱样品前处理方法确定为：

取化湿败毒组合物适量，研细，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，称定重量，加热回流处理60分钟，取出，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

方法学验证

5.1 专属性考察

分别取缺每味药物的化湿败毒组合物，按照2.3项中的供试品溶液的制备方法制备，得到缺每味药材的阴性样品溶液。

分别取葶苈子、甘草、赤芍、厚朴、茯苓、大黄、麻黄、广藿香和黄芪对照药材，另分别取石膏、炒草果仁、麸炒苍术、法半夏、炒苦杏仁工作对照药材，按照2.2项对照药材参照物溶液的制备方法制备每味药材的对照药材参照物溶液。

分别取芍药苷对照品、甘草素对照品、大黄酚-8-O-葡萄糖苷对照品、甘草酸对照品、和厚朴酚对照品、厚朴酚对照品适量，按照2.2项对照品溶液的制备方法制备每种对照品的对照品溶液。

将供试品溶液、缺每味药材的阴性样品溶液、每味药材的对照药材参照物溶液、每种对照品的对照品溶液各1μL注入液相色谱仪，按2.1项下色谱条件进样分析，结果如图9~图22所示。

由图9~图21可知：峰4（甘草素）、峰8、峰9（甘草酸）为甘草的特征成分；峰1（芍药苷）、峰2为赤芍的特征成分；峰3、峰10（和厚朴酚）、峰11（厚朴酚）为厚朴的特征成分；峰5、峰6、峰7（大黄酚-8-O-葡萄糖苷）为大黄的特征成分；法半夏中检出有峰9（甘草酸），该成分是由于法半夏炮制过程使用甘草药材，结合甘草药材图谱，确定该成分为甘草的成分；石膏、茯苓、炒苦杏仁、麸炒苍术在该色谱条件下，均无成分被洗脱；葶苈子、麻黄、炒草果仁、广藿香、黄芪药材中主要成分在前20分钟被洗脱，但前20分钟各药材中色谱峰分离效果不佳，易受背景影响，故在确定的色谱条件下，无特征峰属于上述药材。

由图22可知，供试品色谱在与对照品色谱相应保留时间处有相同的色谱峰，阴性无干扰，综上所述，说明该方法专属性良好。

5.2 精密度考察

取化湿败毒组合物适量，研细，取约1.0g，精密称定，按4.4项下确定的供试品溶液制备方法制备，按2.1项下色谱条件进样分析，连续进样6次，以大黄酚-8-O-葡萄糖苷（峰7）色谱峰为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD值。结果见表8、表9。

结果显示，以大黄酚-8-O-葡萄糖苷（峰7）色谱峰为参照峰S，各特征峰与S峰的相对保留时间RSD在0.02%~0.16%范围内，相对峰面积RSD在0.45%~1.64%范围内，均小于3.0%，表明仪器精密度良好。

5.3 重复性考察

取化湿败毒组合物适量，研细，取约1.0g，平行6份，精密称定，按4.4项下确定的供试品溶液制备方法制备，按2.1项下色谱条件进样分析，以大黄酚-8-O-葡萄糖苷（峰7）为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD值。结果见表10和表11。

结果显示，以大黄酚-8-O-葡萄糖苷（峰7）色谱峰为参照峰S，各特征峰与S峰的相对保留时间RSD在0.02%~0.38%范围内，相对峰面积RSD在0.33%~1.70%范围内，均小于3.0%，表明该方法重复性良好。

5.4 稳定性考察

取化湿败毒组合物适量，研细，取约1.0g，精密称定，按4.4项下确定的供试品溶液制备方法制备，按2.1项下色谱条件，分别在0，8，12，17，22，24h进样分析，以大黄酚-8-O-葡萄糖苷（峰7）为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD值。结果见表12和表13。

结果显示，同一份供试品溶液分别在0，8，12，17，22，24h进行分析，以大黄酚-8-O-葡萄糖苷（峰7）为参照峰S，各特征峰与S峰的相对保留时间RSD在0.04%~0.60%范围内，相对峰面积RSD在0.70%~2.75%范围内，均小于3.0%，表明供试品溶液在24 h内相对稳定。

5.5 中间精密度考察

由不同的分析人员在不同时间于不同的仪器上操作，取化湿败毒组合物适量，研细，取约1.0g，平行6份，精密称定，按4.4项下确定的供试品溶液制备方法制备，按2.1项下色谱条件进样分析，以大黄酚-8-O-葡萄糖苷（峰7）色谱峰为参照峰S，记录各特征峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD值，结果见图23、表14、表15。

结果显示，以大黄酚-8-O-葡萄糖苷（峰7）色谱峰为参照峰S，各特征峰与S峰的相对保留时间RSD在0.14%~6.39%范围内，相对峰面积RSD在0.89%~3.36%范围内，相对峰面积RSD值小于5.0%，峰1（芍药苷）色谱峰的相对保留时间为6.39%，建议采用与芍药苷对照品指保留时间参考，其他各色谱峰的相对保留时间均小于3.0%，说明各特征峰中间精密度良好。

5.6 耐用性考察

（1）不同柱温考察

对不同柱温对化湿败毒组合物特征图谱的影响进行考察，分别以25℃、30℃和35℃的柱温进行考察。

具体的，取化湿败毒组合物适量，研细，取约1.0g，精密称定，按4.4项下确定的供试品溶液制备方法制备，除柱温分别为28℃、30℃和32℃外，其他色谱条件均同2.1项下的规定，以大黄酚-8-O-葡萄糖苷（峰7）色谱峰为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD值。结果见图24、表16和表17。

结果显示，在不同的柱温下，各特征峰与S峰的相对保留时间RSD在0.08%~0.74%范围内，相对峰面积RSD在0.63%~3.02%范围内，表明当柱温±2℃时，柱温的改变对各特征峰的相对保留时间、相对峰面积影响较小，柱温耐用性良好。

（2）不同流速考察

对不同流速对化湿败毒组合物特征图谱的影响进行考察，分别以每分钟0.28mL、每分钟0.30mL和每分钟0.32mL的流速进行考察。

具体的，取化湿败毒组合物适量，研细，取约1.0g，精密称定，按4.4项下确定的供试品溶液制备方法制备，除流速分别为0.28mL/min，0.30mL/min，0.32mL/min外，其他色谱条件均同2.1项下的规定，以大黄酚-8-O-葡萄糖苷（峰7）色谱峰为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD值。结果见图25、表18和表19。

结果显示，在不同的流速下，各特征峰与S峰的相对保留时间RSD在0.13%~3.40%范围内，相对峰面积RSD在0.22%~2.73%范围内，表明当流速±0.02mL/min时，流速的改变对各特征峰的相对保留时间、相对峰面积影响较小，说明流速耐用性良好。

（3）不同色谱柱考察

对不同色谱柱对化湿败毒组合物特征图谱的影响进行考察，分别以同一品牌不同的Waters BEH C18柱（编号分别为BH-195，BH-155，BH-216）进行考察。

具体的，取化湿败毒组合物适量，研细，取约1.0g，精密称定，按4.4项下确定的供试品溶液制备方法制备，除色谱柱不同外，其他色谱条件均同2.1项下的规定，以大黄酚-8-O-葡萄糖苷（峰7）色谱峰为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD值。结果见图26、表20和表21。

结果显示，以大黄酚-8-O-葡萄糖苷（峰7）色谱峰为参照峰S，各特征峰与S峰的相对保留时间RSD在0.07%~0.89%范围内，相对峰面积RSD在0.98%~9.54%范围，峰3、峰4（甘草素）的相对峰面积波动较大，说明不同批次的色谱柱对各特征峰的相对保留时间影响较小，而对相对峰面积影响较大。

5.7 小结

以大黄酚-8-O-葡萄糖苷（峰7）为参照峰S，各特征峰与S峰的相对保留时间、相对峰面积受柱温、流速的影响较小，同一品牌不同批次的色谱柱对各色谱峰的相对保留时间影响较小，而对相对峰面积影响较大。因此，只对各特征峰的相对保留时间作出规定，对相对峰面积不作要求。

样品测定

6.1 不同批次化湿败毒组合物的测定

分别取15批化湿败毒组合物小试样品（编号S1~S15），6批生产样品（编号P1~P6）；按4.4项下确定的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密吸取上述供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，15批化湿败毒组合物样品特征图谱叠加图见27，6批生产样品特征叠加图见28，以大黄酚-8-O-葡萄糖苷（峰7）为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积见表22~表25。

结果表明：15批化湿败毒组合物小试样品相对保留时间RSD值在0.06%~0.22%范围内，相对峰面积RSD值在46.36%~111.79%范围内。6批化湿败毒组合物生产样品特征图谱相对保留时间RSD值在0.02%~0.25%范围内，相对峰面积RSD值在5.03%~92.99%范围内。化湿败毒组合物生产样品和化湿败毒组合物小试样品的各特征峰的相对保留时间均在同一范围内，表明化湿败毒组合物生产与小试样品质量的一致性。

6.2 特征图谱的建立

分别将15批次的化湿败毒组合物小试样品、6批次的化湿败毒组合物生产样品的特征图谱使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》进行匹配，以大黄酚-8-O-葡萄糖苷（峰7）为参照峰S，按平均数法生成对照图谱，建立化湿败毒组合物小试样品对照特征图谱（图29），化湿败毒组合物生产样品对照特征图谱（图30）。

上述研究结果显示，以大黄酚-8-O-葡萄糖苷（峰7）色谱峰为参照峰S，参照以上特征图谱结果，确定化湿败毒组合物特征图谱标准为：供试品色谱中应呈现11个特征峰，其中6个峰应分别与相应的对照品峰保留时间相对应，与大黄酚-8-O-葡萄糖苷对照品峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.43（峰2）、0.60（峰3）、0.82（峰5）、0.96（峰6）、1.25（峰8）。

综上，本发明首次建立了化湿败毒组合物的特征图谱，该特征图谱可充分展示化湿败毒组合物的化学成分特征，特征峰信息量丰富，可全面地反映化湿败毒组合物的质量信息，从而能够达到全面、有效地控制化湿败毒组合物产品质量的目的。同时，本发明中的特征图谱构建方法重现性良好，准确可靠，稳定性好。

以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。