阅读说明：本技术 一种烟草NtARF6基因突变体及分子鉴定方法和应用 (Tobacco NtARF6 gene mutant and molecular identification method and application ) 是由 白戈 谢贺 李勇 杨大海 姚恒 逄涛 费明亮 蔺忠龙 张谊寒 于 2020-06-01 设计创作，主要内容包括：一种烟草NtARF6基因突变体及分子鉴定方法和应用,所述烟草NtARF6基因突变体为Ntarf6-1,其为烟草Ntarf6基因第261位的G突变为A,形成终止密码子,使该基因提前终止,其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明的烟草NtARF6基因突变体Ntarf6-1在基因发生突变后,烟草烟碱含量会明显上调,显著提高烟草品质,在烟草育种上具有极大的价值。(A tobacco NtARF6 gene mutant and a molecular identification method and application thereof are disclosed, wherein the tobacco NtARF6 gene mutant is Ntarf6-1, which is a termination codon formed by mutating G at the 261 th position of a tobacco Ntarf6 gene to A, and the nucleotide sequence of the gene is shown as SEQ ID No. 1. After the tobacco NtARF6 gene mutant Ntarf6-1 is subjected to gene mutation, the nicotine content of tobacco can be obviously increased, the tobacco quality is obviously improved, and the tobacco mutant NtARF6 gene mutant has great value in tobacco breeding.)

一种烟草NtARF6基因突变体及分子鉴定方法和应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种烟草NtARF6基因突变体Ntarf6-1及其分子鉴定方法和应用。

背景技术

研究烟草尼古丁的代谢调控是非常有意义的一项工作，通过基因调控可以提供不同尼古丁含量的烟草品种，为烟草商业生产个性化烟碱烟草产品提供原材料。尼古丁对人体有很强的生理刺激作用，是烟草商业性使用的物质基础。许多世界顶级烟草公司如菲利普莫里斯、帝国烟草、日本烟草、英美烟草等公司都投入巨资对烟草尼古丁的代谢途径、调控机制进行研究。

尼古丁是一种吡啶类生物碱，主要存在于茄科烟草属(Nicotiana)植物中，是烟草体内的一种重要的次生代谢产物。烟草尼古丁的合成和转运受到多个因素的调控，目前已经鉴别和克隆出来了一些尼古丁合成途径中的关键基因，如QPT、PMT、MPO、JAZ、MYC2a等。

从分子生物学角度对尼古丁的合成代谢途径研究尚未完全透彻。通过氯离子通道调控尼古丁合成基因，从而影响尼古丁含量的研究未见报道。尼古丁调控基因对于烟草商业生产至关重要，目前大多数的烟碱合成基因相关专利都掌握在国外烟草公司手中。因此，研究尼古丁合成途径相关调控基因对中国烟草企业改良烟草产品中尼古丁含量具有重要意义。值得注意的是目前很多关于调控烟碱的基因都是以RNAi为主要技术方法进行验证基因功能，而这种方法的缺点就是可能会同时敲除与之同源的基因，另外非常重要的就是烟草育种不允许用转基因材料，因此为了育成高烟碱烟草材料，有必要通过EMS敲除的方法获得基因突变材料。

发明内容

本发明的目的是提供一种烟草NtARF6基因突变体Ntarf6-1及其分子鉴定方法，本发明还提供所述烟草NtARF6基因突变体Ntarf6-1的应用。

本发明采取的技术方案如下：

一种烟草NtARF6基因突变体，所述烟草NtARF6基因突变体为Ntarf6-1，其为烟草Ntarf6基因第261位的G突变为A，形成终止密码子，使该基因提前终止，其核苷酸序列如SEQID No.1所示。

本发明所述烟草NtARF6基因突变体Ntarf6-1的分子鉴定方法，所述突变体Ntarf6-1的DNA片段由以下引物对扩增得到，所述引物对的上游引物为NtARF6F，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，下游引物为NtARF6 R，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。

本发明所述烟草NtARF6基因突变体Ntarf6-1用于制备高烟碱材料。

本发明的烟草NtARF6基因突变体Ntarf6-1在基因发生突变后，烟草烟碱含量会明显上调，显著提高烟草品质，在烟草育种上具有极大的价值。

附图说明

图1为所述烟草NtARF6基因突变体Ntarf6-1扩增条带；

图2为所述烟草NtARF6基因突变体Ntarf6-1测序结果；

图3为所述烟草NtARF6基因突变体Ntarf6-1单株与野生型单株烟碱含量。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或者替换，均属本发明的保护范围。

1、烟草突变体材料的获得：

(1)将具有烟草NtARF6基因的烟草种子用次氯酸钠清洗消毒，然后用蒸馏水洗干；

(2)将烟草种子用磷酸缓冲液浸泡，以增加种子的萌发率；

(3)将浸泡后的烟草种子放置于0.5％的EMS(甲基磺酸乙酯)溶液中浸泡10-15小时，然后离心滤干种子；

(4)将种子用蒸馏水漂洗50次，充分洗去EMS溶液，作为烟草突变体材料。

2、筛选获得突变体Ntarf6-1：

(1)以突变体材料的DNA为模板设计特异引物对进行PCR扩增，所述引物对的上游引物为NtARF6 F，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，下游引物为NtARF6 R，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。

PCR扩增反应条件如下：

扩增条带见图1；

(2)将扩增获得的PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，采用Qiagen公司PCR产物纯化试剂盒，按照产品说明回收纯化所述的PCR产物，并送Invitrogen测序，验证序列结果，测序结果见图2；

(3)将候选突变体材料自交收种获得M2种子；

(4)种植M2种子获得M2突变体植株，用引物对NtARF6 F(核苷酸序列如SEQ IDN0.2所示)、NtARF6 R(核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示)鉴定突变体，最终获得突变体为Ntarf6-1的纯合突变植株。与野生型烟草NtARF6基因的核苷酸序列相比，其NtARF6基因序列的261位的G突变为A，于是碱基发生从色氨酸到终止突变的变化，形成终止密码子，从而造成该基因提前终止。突变体Ntarf6-1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3、尼古丁含量测定：

(1)依据标准YC/T 160-2002检测中烟草材料的尼古丁含量。选取的烟草材料为旺长期，发育表型相近的非转基因烟株及转基因烟株为处理对象，以野生型烟草K326为对照。取5株非转基因烟株及转基因烟株的上部、中部及下部叶片。对于另一组，对5株非转基因烟株及转基因烟株进行打顶处理，然后采取非转基因烟株及转基因烟株的上部、中部及下部叶片；

(2)用5％乙酸水溶液萃取烟草样品，萃取液中的总植物碱(以烟碱计)与对氨基苯磺酸和氯化氰反应，氯化氰由***和氯胺T在线反应产生。反应产物用比色计在460nm测定。

主要仪器设备：连续流动分析仪(美国API)(德国SEAL AA3)(法国ALLIANCE)；

配置试剂：Brij 35溶液(聚乙氧基月桂醚)：水中加5滴22％Brij35，搅拌均匀；

缓冲溶液A：称取2.35g氯化钠(NaCl)，7.60g硼酸钠(Na₂B₄O₃·10H₂O)，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，加入1mL Brij 35，用蒸馏水稀释至1L。使用前用定性滤纸过滤；

缓冲溶液B：称26g磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)，10.4g柠檬酸[COH(COOH)(CH₂COOH)₂·H₂O]，7g对氨基苯磺酸(NH₂C₆H₄SO₃H)，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，加入1mL Brij 35，用蒸馏水稀释至1L。使用前用定性滤纸过滤；

氯胺T溶液(N-氯-4-甲基苯硫酰胺钠盐)[CH₃C₆H₄SO₂N(Na)Cl·3H₂O]：取8.65g氯胺T，溶于水中，然后转入500mL的容量瓶中，用水定容至刻度。

使用前用定性滤纸过滤；

0.22mol/L NaOH缓冲液：NaOH 8.8g，Na₂HPO₄ 26.0g，C₆H₈O₇·H₂O(一水柠檬酸)10.4g，用水溶解并定容至1000mL；

对氨基苯磺酸缓冲液：称取C₆H₇NO₃S(对氨基苯磺酸)7g，Na₂HPO₄ 26.0g，C₆H₈O₇·H₂O(一水柠檬酸)10.4g，用水溶解并定容至1000mL；

氯胺T：称取氯胺T1.2g，用纯水溶解定容至100mL，用棕色试剂瓶保存；

***：KCN 0.4g，用纯水溶解定容至100mL；

NaCO₃溶液：10g NaCO₃，蒸馏水溶解并定容至1000mL；

(3)分析步骤：

称取0.3g烟草样品于150mL三角瓶或塑料瓶中(精确至0.0001g)；加入50mL 5％乙酸溶液盖上塞子；在普通摇床上振荡萃取30min，转速控制170r/min，用滤纸过滤上机(如样品液浓度超出工作标准液的浓度范围，则应稀释)。

以干基计的总植物碱的含量，由下面公式得出：

式中：

C——样品液总植物碱的仪器观测值，单位为mg/mL；

V——萃取液的体积，单位为mL；

m——试料的质量，单位为mg；

W——试样的水分含量，单位为％。

经过三次检测，Ntarf6-1突变体烟草的烟碱含量为1.63％，而野生型烟草的烟碱含量为1.18％(见图3)，突变体材料的烟碱含量提高了近38.1％，证明基因突变后，烟草烟碱含量有了极大的提高，因此该材料对于烟草育种具有极大的价值，可将所述突变体Ntarf6-1烟草用于制备高烟碱材料。

序列表

<110> 云南省烟草农业科学研究院

<120> 一种烟草NtARF6基因突变体及分子鉴定方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 831

<212> DNA

<213> 烟草(Ntarf6-1)

<400> 1

atgtctatac cattcgaaca tgattatata ggtttatcag aagcttcttt aatggaaaga 60

aattctgata aaaatagtga tgttcttaac cttaaggaga ctgagctaag acttgggtta 120

ccgggtactg aggaaacaaa tacgggtctt aacccttcaa acaattttat atcaagaacc 180

aaaaggggtt tttctgatgc cattgatgct tctggaaaat gggatttgtc cattaattgc 240

agatcagaaa ctgattgaag aaaagaagac ttgttatttt cccccaaagg aagtaatgga 300

agctcaaagc caactccatc aattgaaaat agtgctcctc agacttcaaa ggcacaagta 360

gtaggatggc caccaattag atcattccgc aaaaatacac tggccaccaa aaagaatgat 420

gctgaaggaa aatcaggttc aggttgcctt tatgtgaaag ttagaatgga tggtgctcca 480

tatttgagaa aggttgatat caaaacttac agcgactatg gggagctctc atcagcactt 540

gaaaagatgt tcagctgctt tagtattggg cagtgcgcca gcgatggact tccggggcaa 600

gaggaactta gtgaaagtca cttgatggat cttctcaatg gttctgagta tgttctgact 660

tatgaagaca aagatggtga ttggatgctt gttggcgatg ttccttggga gatgttcata 720

gactcatgca agagattgcg gatcatgaaa agctcagagg caattgggct aggtatgtcc 780

tatcactgtg atcctgtcca tgctgtattt tatgtctata cttaccattg a 831

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> NtARF6 F

<400> 2

tctataccat tcgaacatga ttatatagg 29

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> NtARF6 R

<400> 3

cttcctttrg gggaaaataa c 21