重组人奥克纤溶酶的制备方法
阅读说明：本技术 重组人奥克纤溶酶的制备方法 (Preparation method of recombinant human oxk fibrinolytic enzyme ) 是由 彭红卫 王冲 李晓鹏 张磊 万云雷 张宝华 于 2019-12-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种重组人奥克纤溶酶的制备方法,具体地,所述制备方法通过将重组人奥克纤溶酶原通过阳离子层析、酶切活化和疏水层析等步骤,得到高纯度的重组人奥克纤溶酶。本发明的方法步骤简单、蛋白收率高、产品纯度高,适合产业化生产。(The invention provides a preparation method of recombinant human oxkerin plasmin, and particularly the preparation method comprises the steps of carrying out cation chromatography, enzyme digestion activation, hydrophobic chromatography and the like on the recombinant human oxkerin plasminogen to obtain the high-purity recombinant human oxkerin plasmin. The method has the advantages of simple steps, high protein yield and high product purity, and is suitable for industrial production.)
技术领域
本发明涉及重组蛋白质领域，具体涉及重组人奥克纤溶酶的制备方法。
背景技术
人纤溶酶由791个氨基酸组成，分子量约为88kD，形成两条链，重链和轻链之间以二硫键连接。重组人奥克纤溶酶是截取人纤溶酶C端249氨基酸形成，分子量约为27.2kD。
人纤溶酶原是人体纤溶系统的关键成份之一。活化后的纤溶酶具有丝氨酸蛋白酶活性，能够降解多种蛋白，如层粘连蛋白、纤连蛋白和胶原蛋白等。此外，纤溶酶可以激活基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)，激活后的MMP也可以参与降解细胞外基质蛋白。纤溶酶通过水解玻璃体后膜和视网膜基底膜之间的粘附分子，使玻璃体和视网膜分离，达到治疗玻璃体黄斑粘连和黄斑牵引的目的。
重组人奥克纤溶酶是一种截短的纤溶酶，它只保留纤溶酶原C端249个氨基酸。重组人奥克纤溶酶具有纤溶酶的蛋白水解催化活性，并且比人纤溶酶更加稳定。
重组人奥克纤溶酶重链19个氨基酸(此肽链虽然短，但是来自于人纤溶酶的重链，故依然称为重链)，轻链230个氨基酸，重链和轻链之间通过两条二硫键相连，此外，轻链内还有4条二硫键。
对于重组人奥克纤溶酶的制备，中国专利2003801087731公开了微纤溶酶原和小纤溶酶原表达载体的构建，用pPICZɑ-MPLG1转化毕氏酵母，筛选高表达菌株X33-MPLG1-5#，纯化步骤包括：离子交换层析、疏水层析和亲和层析三步获得纤溶酶原，再通过定量活化、疏水层析纯化获得微纤溶酶，但其纯化步骤长，操作繁琐，收率低。
因此，本领域迫切需要开发出一种步骤简单、蛋白收率高、产品纯度高的重组人奥克纤溶酶的制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种步骤简单、蛋白收率高、产品纯度高的重组人奥克纤溶酶的制备方法。
本发明提供了一种重组人奥克纤溶酶制备方法，包括步骤：
(a)提供重组人纤溶酶原溶液；
(b)将所述重组人奥克纤溶酶原溶液通过阳离子层析柱，得含有重组人奥克纤溶酶原的洗脱液；
(c)将氨甲环酸加入所述洗脱液，并加入纤溶酶原活化剂进行酶切反应，得初级酶切液；和
(d)将所述初级酶切液通过疏水层析柱，得到纯化后的重组人奥克纤溶酶溶液。
在另一优选例中，在步骤(d)之前，还包括步骤：
(d1)将所述初级酶切液用稀释液稀释；和/或
(d2)用滤膜过滤，得滤液；
然后将所得液体进行步骤(d)。
在另一优选例中，所述重组人奥克纤溶酶原溶液包括毕赤酵母或酿酒酵母发酵上清液。
在另一优选例中，所述重组人奥克纤溶酶原包括具有SEQ ID No.:1所示氨基酸序列的肽段。
在另一优选例中，所述重组人奥克纤溶酶原溶液具有一个或多个下述特征：
1)所述重组人奥克纤溶酶原溶液中，重组人奥克纤溶酶原浓度为0.01-10g/kg，较佳地，0.02-8g/kg，更佳地，0.03-6g/kg；
2)所述重组人奥克纤溶酶原溶液的pH为5-7，较佳地，5.5-6.5；
3)所述重组人奥克纤溶酶原溶液的电导率为10-20mS/cm，较佳地，12-18mS/cm。
在另一优选例中，所述阳离子层析柱的填料选自下组：Diamond MMC Mustang、Diamond MMC、Capto MMC、或其组合。
在另一优选例中，所述阳离子层析柱的填料与奥克纤溶酶原进样量之比1L：0.1-100g；较佳地，1L:1-80g，更佳地，1L：2-60g。
在另一优选例中，步骤(b)中，所述阳离子层析柱的洗脱方法包括步骤：
i)用2-6倍柱体积第一平衡液平衡，较佳地，2-5倍柱体积；
ii)用3-10倍柱体积第一洗涤液与第一平衡液的混合液I淋洗，较佳地，7-9倍柱体积；然后
iii)用5-25倍柱体积第一洗涤液与第一平衡液的混合液II洗脱，较佳地，7-13倍柱体积；
其中，所述第一平衡液为pH为7±1的缓冲液，较佳地，7±0.5，更佳地，7±0.2；
所述第一洗涤液为缓冲液配制的无机盐溶液，无机盐浓度为0.5-1.5mol/L，较佳地，0.8-1.2mol/L；且所述缓冲液为pH为7±1的缓冲液，较佳地，7±0.5，更佳地，7±0.2；
所述混合液I中，所述第一洗涤液与第一平衡液的体积比为10-30:70-90；较佳地，15-25:75-85，更佳地，15-20:80-85；
所述混合液II中，所述第一洗涤液与第一平衡液的体积比为20-50:50-70；较佳地，25-40:60-75，更佳地，30-40:60-70。
在另一优选例中，所述第一洗涤液中，所述无机盐选自NaCl、KCl，或其组合。
在另一优选例中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
在另一优选例中，所述阳离子层析柱使用前，已用第一平衡液平衡。
在另一优选例中，步骤(b)中，所述含有重组人奥克纤溶酶原的洗脱液为在280±5nm处有紫外响应的组分，较佳地，280±2nm。
在另一优选例中，步骤(c)中，所述氨甲环酸的加入量为使洗脱液中氨甲环酸终浓度为0.01-0.80mol/L，较佳地，0.10-0.50mol/L，更佳地，0.15-0.3mol/L。
在另一优选例中，步骤(c)中，所述酶切反应具有一个或多个下述特征：
1)重组人奥克纤溶酶原活化剂与所述重组人奥克纤溶酶原重量比为1:120-500，较佳地，1:150-400，更佳地，1:200-350；
2)酶切反应的温度为15-30℃，较佳地，20-25℃；
3)酶切反应的温度为2-12h，较佳地，4-8h；和/或
4)所述重组人奥克纤溶酶原活化剂为链激酶、葡激酶、尿激酶，或其组合，较佳地，葡激酶或尿激酶。
在另一优选例中，步骤(d1)中，所述稀释液为所述缓冲液中的氨甲环酸和(NH4)2SO4溶液。
在另一优选例中，所述稀释液中的缓冲液为pH为7±1的缓冲液，较佳地，7±0.5，更佳地，7±0.2。
在另一优选例中，所述稀释液中，氨甲环酸的浓度为0.1-0.3mol/L，较佳地，0.15-0.25mol/L。
在另一优选例中，所述稀释液中，(NH4)2SO4的浓度为0.1-5mmol/L，较佳地，0.5-4mmol/L，更佳地，0.5-3mmol/L。
在另一优选例中，所述稀释液与所述初级酶切液的体积比为1-5:1，较佳地，1-3:1。
在另一优选例中，所述步骤(d1)中，稀释后所得液体中，蛋白浓度为0.1-1g/L，较佳地，0.1-0.8g/L。
在另一优选例中，步骤(d2)中，所述滤膜为0.22-0.45um。
在另一优选例中，所述疏水层析柱的填料选自下组：Capto ButyL ImpRes、CaptoButyl、Capto phenyl ImpRes，或其组合。
在另一优选例中，所述疏水层析柱的填料与奥克纤溶酶原进样量之比1L：0.1-100g；较佳地，1L:1-80g，更佳地，1L：2-60g。
在另一优选例中，步骤(d)中，所述疏水层析柱的洗脱方法包括步骤：
I)用1-4倍柱体积第二平衡液平衡，较佳地，2-3倍柱体积；
II)用2-6倍柱体积第二洗涤液与第二平衡液的混合液III淋洗，较佳地，3-5倍柱体积；然后
III)用第二洗脱液梯度洗脱；
其中，所述第二平衡液为缓冲液配制的氨甲环酸和(NH4)2SO4溶液，氨甲环酸的浓度为0.1-0.3mol/L，较佳地，0.15-0.25mol/L；且(NH4)2SO4的浓度为0.1-5mmol/L，较佳地，0.5-4mmol/L，更佳地，0.5-3mmol/L；
所述第二洗涤液为缓冲液配制的的氨甲环酸溶液，较佳地，所述第二洗涤液中，氨甲环酸浓度为0.1-0.3mol/L，较佳地，0.15-0.25mol/L；
所述混合液III中，所述第二洗涤液与第二平衡液的体积比为10-30:70-90；较佳地，15-25:75-85，更佳地，15-20:80-85；和
所述第二洗脱液由两相梯度混合形成，其中，所述两相包括：A相：第二平衡液；和B相：第二洗涤液；
其中，所述梯度洗脱为所述B相以(10-20％)至(80-90％)(V/V)线性梯度洗脱，以所述第二洗脱液总体积计；
各缓冲液独立地为pH为7±1的缓冲液，较佳地，7±0.5，更佳地，7±0.2。
在另一优选例中，所述疏水层析柱使用前，用第二平衡液平衡。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
(e)将步骤(d)得到的纯化后的重组人奥克纤溶酶溶液进行浓缩，得高浓度重组人奥克纤溶酶。
在另一优选例中，所述浓缩为超滤浓缩。
在另一优选例中，所述超滤浓缩包括步骤：
将步骤(d)得到的纯化后的重组人奥克纤溶酶溶液调整至pH为2.5-4，较佳地，2.5-3.5，更佳地，2.8-3.0；和
使用4-6KDa超滤膜进行超滤换液，较佳地，5KDa。
在另一优选例中，所述超滤换液中，pH调节剂为柠檬酸，磷酸和醋酸缓冲液。
在另一优选例中，所述超滤换液中，pH调节剂为柠檬酸和氨甲环酸的混合溶液。
在另一优选例中，所述超滤换液中，pH调节剂为1.5-3mol/L柠檬酸和0.1-0.3mol/L的氨甲环酸混合溶液。
在另一优选例中，超滤膜的膜内溶液的pH值与待浓缩溶液一样。
在另一优选例中，超滤膜的膜内溶液包括无机盐，所述无机盐浓度为60-200mmol/L，较佳地，80-150mmol/L，更佳地，80-120mmol/L。
在另一优选例中，所述无机盐选自下组：NaCl、KCl，或其组合。
在另一优选例中，所述步骤(e)中，所述“高浓度”指所得浓缩液中，所述重组人奥克纤溶酶浓度≥2g/L，较佳地，2-20g/L，更佳地，3-18g/L。
在另一优选例中，所述纯化后的重组人奥克纤溶酶纯度≥95％，较佳地，≥96％、≥97％或≥98％，更佳地，≥99％，最佳地，99.5-99.99％。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为重组人奥克纤溶酶的氨基酸序列及二硫键连接位点；
图2为实施例1所得奥克纤溶酶(a)与市售产品(JETREA，批号15088)(b)的色谱图；
图3为实施例4给药后28天玻璃体后脱离在光学相干断层扫描(OCT)图像，其中75μg/眼(a)、125μg/眼(b)；
图4为实施例5给药后2天玻璃体后脱离在光学相干断层扫描(OCT)图像，其中溶媒对照组(a)、62.5μg/眼(b)；
图5为给药后2天玻璃体后脱离在光学相干断层扫描(OCT)图像，其中75μg/眼(a)、125μg/眼(b)；
图6为给药后2天扫描电镜下(×1500倍)后界膜表面胶原纤维存留图，其中溶媒对照(a)、62.5μg/眼(b)、125μg/眼(c)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，提供了一种重组人奥克纤溶酶的制备方法。所述方法包括将重组人纤溶酶原溶液经过阳离子层析、酶切、疏水层析即可获得高蛋白收率、高纯度(>99.7％)的重组人奥克纤溶酶，所得重组人奥克纤溶酶可直接用于制备眼内注射制剂。在此基础上完成了本发明。
术语
除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。
本发明中，术语“缓冲液配制的…溶液”是指包含缓冲体系的溶液，所述缓冲体系使所述溶液的pH值保持在一定范围，所述“缓冲液配制的”并不用于限制相关溶液的配制方式。
重组人奥克纤溶酶原溶液
指在采取任何纯化步骤之前表达包括SEQ ID No.:1氨基酸序列的蛋白的重组细胞的细胞培养上清液。该表达包括了上清液未加工的形式(与细胞分离)，也包括浓缩的和/或过滤的和/或超滤的上清液。所述“溶液”可包含少量不溶性杂质。所述溶液在实施本发明的方法前可进行适当的调整(如浓度、pH值、电导率等)。
SEQ ID No.:1：
APSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN
术语“重组”是指通过使用重组DNA技术产生的物质。
术语“酶原”是指在细胞内合成或初分泌时只是酶的无活性前体。可通过对酶原的剪切修饰而使酶的活性中心形成或暴露出来。
本发明中，所述重组人奥克纤溶酶原不具有生物活性。
在另一优选例中，所述重组人奥克纤溶酶原溶液为毕赤酵母或酿酒酵母表达获得的。
在另一优选例中，所述重组人奥克纤溶酶原溶液具有一个或多个下述特征：
1)所述重组人奥克纤溶酶原溶液中，重组人奥克纤溶酶原浓度为0.01-10g/kg，较佳地，0.02-0.8g/kg，更佳地，0.03-6g/kg；
2)所述重组人奥克纤溶酶原溶液的pH为5-7，较佳地，5.5-6.5；
3)所述重组人奥克纤溶酶原溶液的电导率为10-20mS/cm，较佳地，12-18mS/cm。
重组人奥克纤溶酶
本发明的重组人奥克纤溶酶可通过重组人奥克纤溶酶原活化剂酶切所述酶原得到。其中活化剂将酶原的19位精氨酸与20位缬氨酸之间的肽键切断，并通过两条二硫键相连，从而得到具有生物活性的重组人奥克纤溶酶。
本发明中，所述重组人奥克纤溶酶原活化剂选自下组：链激酶、葡激酶、尿激酶，或其组合。
制备方法
本发明提供了一种重组人奥克纤溶酶制备方法，包括步骤：
(a)提供重组人纤溶酶原溶液；
(b)将所述重组人奥克纤溶酶原溶液通过阳离子层析柱，得含有重组人奥克纤溶酶原的洗脱液；
(c)将氨甲环酸加入所述洗脱液，并加入纤溶酶原活化剂进行酶切反应，得初级酶切液；和
(d)将所述初级酶切液通过疏水层析柱，得到纯化后的重组人奥克纤溶酶溶液。
在另一优选例中，在步骤(d)之前，还包括步骤：
(d1)将所述初级酶切液用稀释液稀释；和/或
(d2)用滤膜过滤，得滤液；
然后将所得液体进行步骤(d)。
在另一优选例中，所述重组人奥克纤溶酶原溶液包括毕赤酵母或酿酒酵母发酵上清液。
在另一优选例中，所述重组人奥克纤溶酶原包括具有SEQ ID No.:1所示氨基酸序列的肽段。
在另一优选例中，所述重组人奥克纤溶酶原溶液具有一个或多个下述特征：
1)所述重组人奥克纤溶酶原溶液中，重组人奥克纤溶酶原浓度为0.01-10g/kg，较佳地，0.02-8g/kg，更佳地，0.03-6g/kg；
2)所述重组人奥克纤溶酶原溶液的pH为5-7，较佳地，5.5-6.5；
3)所述重组人奥克纤溶酶原溶液的电导率为10-20mS/cm，较佳地，12-18mS/cm。
在另一优选例中，所述阳离子层析柱的填料选自下组：Diamond MMC Mustang、Diamond MMC、Capto MMC、或其组合。
在另一优选例中，所述阳离子层析柱的填料与奥克纤溶酶原进样量之比1L：0.1-100g；较佳地，1L:1-80g，更佳地，1L：2-60g。
在另一优选例中，步骤(b)中，所述阳离子层析柱的洗脱方法包括步骤：
i)用2-6倍柱体积第一平衡液平衡，较佳地，2-5倍柱体积；
ii)用3-10倍柱体积第一洗涤液与第一平衡液的混合液I淋洗，较佳地，7-9倍柱体积；然后
iii)用5-25倍柱体积第一洗涤液与第一平衡液的混合液II洗脱，较佳地，7-13倍柱体积；
其中，所述第一平衡液为pH为7±1的缓冲液，较佳地，7±0.5，更佳地，7±0.2；
所述第一洗涤液为缓冲液配制的无机盐溶液，无机盐浓度为0.5-1.5mol/L，较佳地，0.8-1.2mol/L；且所述缓冲液为pH为7±1的缓冲液，较佳地，7±0.5，更佳地，7±0.2；
所述混合液I中，所述第一洗涤液与第一平衡液的体积比为10-30:70-90；较佳地，15-25:75-85，更佳地，15-20:80-85；
所述混合液II中，所述第一洗涤液与第一平衡液的体积比为20-50:50-70；较佳地，25-40:60-75，更佳地，30-40:60-70。
在另一优选例中，所述第一洗涤液中，所述无机盐选自NaCl、KCl，或其组合。
在另一优选例中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
在另一优选例中，所述阳离子层析柱使用前，已用第一平衡液平衡。
在另一优选例中，步骤(b)中，所述含有重组人奥克纤溶酶原的洗脱液为在280±5nm处有紫外响应的组分，较佳地，280±2nm。
在另一优选例中，步骤(c)中，所述氨甲环酸的加入量为使洗脱液中氨甲环酸终浓度为0.01-0.80mol/L，较佳地，0.10-0.50mol/L，更佳地，0.15-0.3mol/L。
在另一优选例中，步骤(c)中，所述酶切反应具有一个或多个下述特征：
1)重组人奥克纤溶酶原活化剂与所述重组人奥克纤溶酶原重量比为1:120-500，较佳地，1:150-400，更佳地，1:200-350；
2)酶切反应的温度为15-30℃，较佳地，20-25℃；
3)酶切反应的温度为2-12h，较佳地，4-8h；和/或
4)所述重组人奥克纤溶酶原活化剂为链激酶、葡激酶、尿激酶，或其组合，较佳地，葡激酶或尿激酶。
在另一优选例中，步骤(d1)中，所述稀释液为所述缓冲液中的氨甲环酸和(NH4)2SO4溶液。
在另一优选例中，所述稀释液中的缓冲液为pH为7±1的缓冲液，较佳地，7±0.5，更佳地，7±0.2。
在另一优选例中，所述稀释液中，氨甲环酸的浓度为0.1-0.3mol/L，较佳地，0.15-0.25mol/L。
在另一优选例中，所述稀释液中，(NH4)2SO4的浓度为0.1-5mmol/L，较佳地，0.5-4mmol/L，更佳地，0.5-3mmol/L。
在另一优选例中，所述稀释液与所述初级酶切液的体积比为1-5:1，较佳地，1-3:1。
在另一优选例中，所述步骤(d1)中，稀释后所得液体中，蛋白浓度为0.1-1g/L，较佳地，0.1-0.8g/L。
在另一优选例中，步骤(d2)中，所述滤膜为0.22-0.45um。
在另一优选例中，所述疏水层析柱的填料的配基选自苯基、辛基、丁基、异丙基、醚基。
在另一优选例中，所述疏水层析的填料选自下组：Capto Butyl、Capto ButylImpress、Phenyl Sepharose 6FF(low sub)、Butyl Sepharose High Performance、ButylSepharose 6FF、Phenyl Sepharose High Performance、Capto Phenyl(high sub)，或其组合。
在另一优选例中，所述疏水层析柱的填料选自下组：Capto ButyL ImpRes、CaptoButyl、Capto phenyl ImpRes，或其组合。
在另一优选例中，所述疏水层析柱的填料与奥克纤溶酶原进样量之比1L：0.1-100g；较佳地，1L:1-80g，更佳地，1L：2-60g。
在另一优选例中，步骤(d)中，所述疏水层析柱的洗脱方法包括步骤：
I)用1-4倍柱体积第二平衡液平衡，较佳地，2-3倍柱体积；
II)用2-6倍柱体积第二洗涤液与第二平衡液的混合液III淋洗，较佳地，3-5倍柱体积；然后
III)用第二洗脱液梯度洗脱；
其中，所述第二平衡液为缓冲液配制的氨甲环酸和(NH4)2SO4溶液，氨甲环酸的浓度为0.1-0.3mol/L，较佳地，0.15-0.25mol/L；且(NH4)2SO4的浓度为0.1-5mmol/L，较佳地，0.5-4mmol/L，更佳地，0.5-3mmol/L；
所述第二洗涤液为缓冲液中配置的氨甲环酸溶液，较佳地，所述第二洗涤液中，氨甲环酸浓度为0.1-0.3mol/L，较佳地，0.15-0.25mol/L；
所述混合液III中，所述第二洗涤液与第二平衡液的体积比为10-30:70-90；较佳地，15-25:75-85，更佳地，15-20:80-85；和
所述第二洗脱液由两相梯度混合形成，其中，所述两相包括：A相：第二平衡液；和B相：第二洗涤液；
其中，所述梯度洗脱为所述B相以(10-20％)至(80-90％)(V/V)线性梯度洗脱，以所述第二洗脱液总体积计；
各缓冲液独立地为pH为7±1的缓冲液，较佳地，7±0.5，更佳地，7±0.2。
在另一优选例中，所述疏水层析柱使用前，用第二平衡液平衡。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
(e)将步骤(d)得到的纯化后的重组人奥克纤溶酶溶液进行浓缩，得高浓度重组人奥克纤溶酶。
在另一优选例中，所述浓缩为超滤浓缩。
在另一优选例中，所述超滤浓缩包括步骤：
将步骤(d)得到的纯化后的重组人奥克纤溶酶溶液调整至pH为2.5-4，较佳地，2.5-3.5，更佳的2.8-3.0；和
使用4-6KDa超滤膜进行超滤换液，较佳地，5KDa。
在另一优选例中，所述超滤换液中，pH调节剂为柠檬酸，磷酸和醋酸缓冲液。
在另一优选例中，所述超滤换液中，pH调节剂为柠檬酸和氨甲环酸的混合溶液。
在另一优选例中，所述超滤换液中，pH调节剂为1.5-3mol/L柠檬酸和0.1-0.3mol/L的氨甲环酸混合溶液。
在另一优选例中，超滤膜的膜内溶液的pH值与待浓缩溶液一样。
在另一优选例中，超滤膜的膜内溶液包括无机盐，所述无机盐浓度为60-200mmol/L，较佳地，80-150mmol/L，更佳地，80-120mmol/L。
在另一优选例中，所述无机盐选自下组：NaCl、KCl，或其组合。
在另一优选例中，所述步骤(e)中，所述“高浓度”指所得浓缩液中，所述重组人奥克纤溶酶浓度≥2g/L，较佳地，2-20g/L，更佳地，3-18g/L。
在另一优选例中，所述纯化后的重组人奥克纤溶酶纯度≥95％，较佳地，≥96％、≥97％或≥98％，更佳地，≥99％，最佳地，99.5-99.99％。
优选地，所述重组人奥克纤溶酶生物活性为参比品70-130％，80-120％或90-110％或95-100％，更佳地，95-110％，最佳地，95％-105％，所述活性百分比为与参比品活性相比。
制剂
本发明制备的重组人奥克纤溶酶可用于任何合适的制剂。优选眼用制剂，如注射剂、滴眼液等。所述注射剂可以以冻干剂形式或溶液形式存在。
通常，所述制剂还包括一种或多种药学上可接受载体。
特别优选地，本发明制备的重组人奥克纤溶酶可配置为：将其溶解于无热原水中使用渗透压调节剂(如NaCl)调节至等渗，pH调节剂调节pH为5-8。可直接注射或制备成冻干制剂。所述制剂可通过玻璃体注射给药。
适应症
本发明的重组人奥克纤溶酶可用于制备用于治疗和/或预防眼部疾病的药物组合物或制剂。
在另一优选例中，所述眼部疾病选自下组：视网膜脱离、视网膜破裂、玻璃体出血、糖尿病性玻璃体出血、增殖性糖尿病性视网膜病、非增殖性糖尿病性视网膜病、与衰老有关的黄斑变性、黄斑破洞、玻璃体黄斑牵引、黄斑皱褶、黄斑渗出物、囊状黄斑水肿、纤维蛋白沉积、视网膜静脉阻塞、视网膜动脉阻塞、视网膜下出血、弱视、眼内炎、早产儿视网膜病变、青光眼、视网膜色素变性，或其组合。
本发明的主要优点包括：
1、本发明的制备方法步骤简单，所得重组人奥克纤溶酶纯度高、收率高，适合工业化生产。
2.与现有技术中的纤溶酶纯化方法相比，本发明创造性地通过简化酶切之前的纯化步骤，使部分杂质在酶切之后的疏水层析中一并除去，从而减少了操作步骤，大大提高了蛋白收率(＞95％)，并通过在疏水层析中的洗脱方法的优化，成功获得了高纯度(≥99.7％)的重组人奥克纤溶酶。
3、本发明的制备方法制得的高纯度的重组人奥克纤溶酶，可直接用于制备眼内注射制剂，减少眼睛症状性玻璃体黄斑粘连发生率，方便患者使用，减少手术带来的痛苦。
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
试剂
重组人奥克纤溶酶原溶液可通过基因重组、克隆和毕赤酵母表达获得的，具有SEQID No.:1所示氨基酸序列。重组人奥克纤溶酶原溶液为毕赤酵母发酵上清液。
重组人奥克纤溶酶原活化剂为葡激酶：购自南京金斯瑞生物科技有限公司。
参比品：来自上海景泽生物技术有限公司，产品批号32S171102-RM02。
柱层析
柱层析设备：APPS Process，生产商：利穗科技(苏州)有限公司。
阳离子层析柱：购自利穗科技(苏州)有限公司：柱径/高：14cm*12cm；层析填料：Diamond MMC Mustang；生产厂家：博格隆(上海)生物技术有限公司；货号：AI0163。
疏水层析柱：购自利穗科技(苏州)有限公司：柱径/高：10cm*23cm；层析填料：Capto ButyL ImpRes；生产厂家：General Electric Company；货号：17-3719-03。
检测方法
本发明涉及的生物效价、纯度和酶动力学的测定方法：
生物活性：
重组人奥克纤溶酶的生物活性测定方法参照中国药典2015版相关生物活性测定方法检验。
纯度检测：
SEC-HPLC:安捷伦1260液相色谱上采用AdvanceBio SEC色谱柱(
酶动力学
运用纤溶酶/纤溶酶原-SK发色底物S-2403发色底物(上海船夫生物技术有限公司)测定酶动力，测定方法属于本领域技术人员熟知的方法。
实施例1
制备高纯度重组人奥克纤溶酶I
将低纯度重组人奥克纤溶酶原(序列见图1，纯度约0.15mg/ml)用作起始原料，其中所述酶原不具有活性，生物效价为0IU/mg。
将含有约8.2g重组人奥克纤溶酶原，pH为6,电导率为15mS/cm上述50kg低纯度重组人奥克纤溶酶原溶液上样至2L装有Diamond MMC Mustang填料的阳离子层析柱，该层析柱上样前已用20mmol/L PB(pH7.0)的平衡液平衡好。
上样结束后用平衡液4倍柱体积，然后用8倍柱体积混合液I(V第一洗涤液：V第一平衡液＝20:80)(第一洗涤液(20mmol/L PB+1mol/L NaCl，pH7；第一平衡液：20mmol/L PB，pH7)淋洗，10倍体积混合液II(V第一洗涤液：V第一平衡液＝38:62)洗脱液进行洗脱，用紫外检测器监测280nm处收集约16L，蛋白浓度为0.51mg/ml，HPLC纯度为95.2％。
将16L上述溶液用高浓度氨甲环酸溶液处理，至溶液中氨甲环酸溶液浓度为0.2mol/L，混匀，加入1mg/ml纤溶酶原活化剂26ml进行酶切，酶切温度为23℃，酶切5小时，得到初级酶切液。
将上述用高浓度氨甲环酸溶液处理后的初级酶切液用(20mmol/LPB,0.2M氨甲环酸，1mmol/L(NH4)2SO4)按照约2：1(V/V)稀释，再用0.45um滤膜过滤至储液袋中得到重约35kg的酶切液，蛋白浓度0.23g/L，保存。经检测4天内蛋白纯度不变，备用。
将上述酶切液上样至2L装有Capto ButyL ImpRes填料的疏水层析柱上，此柱上样前已用20mmol/PB，0.2mmol/氨甲环酸，1mol/(NH4)2SO4，pH7的第二平衡液平衡好。上样结束后用2倍柱体积第二平衡液平衡，然后用4倍柱体积20％第二淋洗液(V第二洗涤液：V第二平衡液＝20:80)(第二平衡液：20mmol/PB，0.2mmol/氨甲环酸，1mol/(NH4)2SO4，pH7；第二洗涤液20mmol/L PB，0.2mol/L氨甲环酸，pH7)洗涤，再用第二洗脱液进行10-90％线性梯度洗脱(V第二洗涤液：V(第二平衡液+第二洗涤液)＝10-90％)，用紫外检测器监测280nm处，分别收集各馏出峰，检测其重组人奥克纤溶酶生物活性和纯度，合并有效馏份约3.1L。
用2mol/L柠檬酸，0.2M氨甲环酸调pH至3.0，用孔径为5KDa超滤膜包，20mmol/L一水柠檬酸、100mmol/LNaCl(pH3.0)溶液进行超滤换液，经浓缩得体积1.3kg溶液，即高纯度高活性重组人奥克纤溶酶I(如图1所示)。
表1所得重组人奥克纤溶酶I的生物学活性等测定结果
上述结果表明：采用本实施例1方法进行纯化，只需要两步层析就可以获得高纯度和高蛋白收率的重组人奥克纤溶酶。
实施例2
制备高纯度重组人奥克纤溶酶II
将含有约16.3g重组人奥克纤溶酶原，pH为6,电导率为15mS/cm上述100kg低纯度重组人奥克纤溶酶原溶液上样至4L装有MMC Mustang填料的阳离子层析柱，该层析柱上样前已用约20mmol/L PB(pH6.8)的平衡液平衡好。
上样结束后用平衡液4倍柱体积，然后用9倍柱体积混合液I(V第一洗涤液：V第一平衡液＝20:80)(第一洗涤液(20mmol/L PB+1mol/L NaCl，pH6.8；第一洗涤液：20mmol/LPB，pH6.8)淋洗，10倍体积混合液II(V第一洗涤液：V第一平衡液＝38:62)洗脱液进行洗脱，用紫外检测器监测280nm处收集约31.5L，蛋白浓度为0.51mg/ml，HPLC纯度95.3％。
将31L上述溶液用高浓度氨甲环酸溶液处理，至溶液中氨甲环酸溶液浓度为0.2mol/L，混匀，加入1mg/ml纤溶酶原活化剂53ml进行酶切，酶切温度为23℃，酶切4小时，得到初级酶切液。
将上述用高浓度氨甲环酸溶液处理后的初级酶切液用稀释液(20mmol/LPB,0.2M氨甲环酸，1mmol/L(NH4)2SO4)按照约2：1(V/V)稀释，再用0.45um滤膜过滤至储液袋中得到重约67kg的酶切液II，蛋白浓度0.24g/L，保存。
将上述酶切液上样至4L装有Capto ButyL ImpRes填料的疏水层析柱上，此柱上样前已用20mmol/PB，0.2mmol/氨甲环酸，1mol/(NH4)2SO4，pH6.8的第二平衡液平衡好。上样结束后用2倍柱体积第二平衡液平衡，然后用3倍柱体积20％第二淋洗液(V第二洗涤液：V第二平衡液＝20:80)(第二平衡液：20mmol/PB，0.2mmol/氨甲环酸，1mol/(NH4)2SO4，pH6.8；第二洗涤液20mmol/L PB，0.2mol/L氨甲环酸，pH6.8)洗涤，再用第二洗脱液进行10-90％线性梯度洗脱(V第二洗涤液：V(第二平衡液+第二洗涤液)＝10-90％)，用紫外检测器监测280nm处，分别收集各馏出峰，检测其重组人奥克纤溶酶生物活性和纯度，合并有效馏份约6L。
用2mol/L柠檬酸，0.2M氨甲环酸调pH至3.0，用孔径为5KDa超滤膜包，20mmol/L一水柠檬酸、100mmol/LNaCl(pH3.0)溶液进行超滤换液，经浓缩得体积2.5kg溶液，即高纯度高活性重组人奥克纤溶酶II。
表2所得重组人奥克纤溶酶II的生物活性等测定结果
上述结果表明，本发明的方法重复性好，可用于放大生产。
实施例1和实施例2各操作阶段得到的产物质量(g)总结于表3：
表3实施例1和实施例2各操作阶段得到的产物质量(g)
实施例3
重组人奥克纤溶酶注射制剂
制造1000瓶重组人奥克纤溶酶注射制剂，且每瓶含0.375mg重组人奥克纤溶酶：
计算出重组人奥克纤溶酶的所需量(以质量为单位)，按量量取实施例1中重组人奥克纤溶酶I溶解于注射用无热原水中，用渗透压调节剂调节至等渗，并用pH调节剂调节pH至5.5，然后用0.22μm过滤器进行过滤无菌分装入西林瓶中，每瓶0.3mL，冷冻保存。
所得到的西林瓶中，每瓶含0.375mg重组人奥克纤溶酶。
实施例1所获得的高纯度重组人奥克纤溶酶和购买市售产品(JETREA，批号15088)的比较，SEC-HPLC如图2所示。
表4实施例1所得重组人奥克纤溶酶溶液和市售产品质量比较
由表4可知，本实施例产品生物活性和纯度均优于市售产品。
实施例4
高纯度重组人奥克纤溶酶溶液诱导的后玻璃体分离的体内分析
使用12只食蟹猴，随机分为2个组别(3只/性别/组)，单眼(左眼)玻璃体给药。第1、2组注射本发明的高纯度重组人奥克纤溶酶I(如实施例3配制不同浓度注射液)，剂量分别为75μg/眼(1.25mg/mL，60μL/眼)、125μg/眼(1.25mg/mL，100μL/眼)，均为单次给药。给药后28天(D29)时，OCT(光学相干断层扫描)显示75μg/眼、125μg/眼剂量组均可见玻璃体脱离。
结果如图3，可以看出75μg/眼(a)、125μg/眼(b)本发明的高纯度重组人奥克纤溶酶I单次玻璃体注射均可诱导食蟹猴玻璃体后脱离(如白色箭头所示)，且效果基本一致。
实施例5
单次玻璃体注射给予不同给药剂量食蟹猴后对玻璃体后脱离的发生率及后界膜及其纤维的影响
使用48只食蟹猴，雌雄各半，随机分为4组，6只/性别/组，前3只/性别/组动物单眼(左眼)玻璃体给药，后3只/性别/组动物双眼玻璃体给药。第1组注射溶媒对照品；第2、3、4组注射本发明的高纯度重组人奥克纤溶酶I(如实施例3配制不同浓度注射液)，剂量分别为62.5μg/眼(1.25mg/mL)、75μg/眼(1.5mg/mL)、125μg/眼(2.5mg/mL)，单次给药，给药体积为50μL/眼/次。1～4组动物在动物转入试验前，给药后2天(D3)，恢复期4周(D29)和恢复期结束(D57)进行光学相干断层扫描(OCT)。检测部位为视盘、视网膜血管弓及视网膜后极部。
结果如图4和图5所示，结果显示单眼给药，溶媒对照组未见玻璃体后脱离，本发明的高纯度重组人奥克纤溶酶I各剂量组可见玻璃体后脱离。单眼给药本发明的高纯度重组人奥克纤溶酶I62.5μg/眼、75μg/眼、125μg/眼剂量组2天后(D3)动物的玻璃体后脱离发生率分别为6/6眼、6/6眼、6/6眼。
单眼给药本发明的高纯度重组人奥克纤溶酶I62.5μg/眼、75μg/眼、125μg/眼剂量组4周后(D29)动物的玻璃体后脱离发生率分别为6/6眼、6/6眼、6/6眼。
单眼给药本发明的高纯度重组人奥克纤溶酶I62.5μg/眼、75μg/眼、125μg/眼剂量组8周后(D57)动物的玻璃体后脱离发生率分别为5/6眼、6/6眼、6/6眼。
详细结果见表5。给药2天(D3)玻璃体后脱离在OCT中表现见图4和图5。
表5单眼给药后2天(D3)、4周(D29)和8周(D57)玻璃体后脱离总结表(雄性3只，雌性3只)
电镜检查：对溶媒对照组动物，62.5μg/眼剂量组动物，125μg/眼剂量组动物进行电镜检查黄斑区域的玻璃体后界膜的降解情况，扫描电镜的放大倍数分别为1500倍的视野并拍照。
扫描电镜图片见图6。溶媒(a)对照动物内界膜表面覆盖致密网状胶原纤维；62.5μg/眼剂量组(b)动物内界膜表面覆盖散在分布稀疏胶原纤维；125μg/眼剂量组(c)动物内界膜表面几乎未见胶原纤维分布。上述结果表明，本发明的方法制备的重组人奥克纤溶酶能有效地降解或松解食蟹猴玻璃体后界膜胶原纤维。
对比例1
与实施例1基本相同，不同之处仅在于，在疏水层析过程中，用第二洗脱液进行洗脱时，分别使用30％、40％、50％、60％、70％和80％第二洗脱液(V第二洗涤液：V(第二平衡液+第二洗涤液)进行等度洗脱。
结果显示等度洗脱蛋白收率不高，蛋白纯度均低于99％。与梯度洗脱进行对比，经检测梯度洗脱馏出峰蛋白纯度明显优于等度洗脱，具体结果见表6。
表6梯度洗脱和等度洗脱馏出峰蛋白纯度
综上，与2003801087731中纤溶酶纯化方法相比，本发明创造性地通过简化酶切之前的纯化步骤，使部分杂质在酶切之后的疏水层析中一并除去，从而减少了操作步骤，大大提高了蛋白收率(＞95％)，并通过在疏水层析中的洗脱方法的优化，成功获得了高纯度(≥99.7％)的重组人奥克纤溶酶。且本发明获得的重组人奥克纤溶酶可直接用于制备玻璃体内注射制剂，活性高，治疗效果好。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 江苏璟泽生物医药有限公司
上海景泽生物技术有限公司
成都泽研生物技术有限公司
<120> 重组人奥克纤溶酶的制备方法
<130> P2019-1813
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 249
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys Cys
1 5 10 15
Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro
20 25 30
Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly
35 40 45
Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu
50 55 60
Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln
65 70 75 80
Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu
85 90 95
Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser
100 105 110
Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro
115 120 125
Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly
130 135 140
Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu
145 150 155 160
Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly
165 170 175
Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr
180 185 190
Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys
195 200 205
Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala
210 215 220
Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr
225 230 235 240
Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn
245