阅读说明：本技术 能常温环境贮藏和长途运输的蚓激酶浓缩浆料生产工艺 (Production process of lumbrokinase concentrated slurry capable of being stored in normal temperature environment and transported for long distance ) 是由 倪成 倪宝谦 于 2019-10-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种能常温环境贮藏和长途运输的蚓激酶浓缩浆料生产工艺,包括磨浆、除渣、过滤、脱脂、脱盐浓缩、灭菌等步骤,能够剔除水溶性杂质、变性蛋白、蚯蚓油脂等杂质,提高蚓激酶浓缩浆料中蚓激酶丰度,降低生产线分离介质的负荷,提高蚓激酶收率；且生产得到的蚓激酶浓缩浆料物化性质稳定,其中的酶活力保持持久。本发明的生产工艺适应不同蚓激酶工艺路线,制得的蚓激酶浓缩浆料能直接用于蚓激酶精制工程的蚯蚓体原料替代品,且能够常温储藏和运输,具有常年保质的特点,适用于蚓激酶工厂生产的起始原料。(The invention discloses a production process of lumbrokinase concentrated slurry capable of being stored in a normal-temperature environment and transported for a long distance, which comprises the steps of grinding, deslagging, filtering, degreasing, desalting, concentrating, sterilizing and the like, and can remove water-soluble impurities, denatured protein, earthworm oil and other impurities, improve the abundance of lumbrokinase in the lumbrokinase concentrated slurry, reduce the load of a separation medium of a production line, and improve the yield of lumbrokinase; the physical and chemical properties of the produced lumbrokinase concentrated slurry are stable, and the enzyme activity in the slurry is kept lasting. The production process is suitable for different lumbrukinase process routes, and the prepared lumbrukinase concentrated slurry can be directly used as a substitute of earthworm raw materials in lumbrukinase refining engineering, can be stored and transported at normal temperature, has the characteristic of long-term quality guarantee, and is suitable for starting raw materials produced in lumbrukinase factories.)

能常温环境贮藏和长途运输的蚓激酶浓缩浆料生产工艺

技术领域

本发明涉及蚓激酶领域，尤其涉及一种能常温环境贮藏和长途运输的蚓激酶浓缩浆料生产工艺。

背景技术

蚓激酶，是从特种蚯蚓中提取的一组蛋白水解酶(酸性蛋白质)，分子量为1.6万～4.5万D。蚓激酶为抗血栓药，临床上主要用于血栓性疾病，尤其是伴纤维蛋白原增高及血小板聚集率增高的患者；用于缺血性心脑血管疾病，可改善症状、防止病情发展。

但蚓激酶在加工过程及贮藏过程中，由于受到外界环境因素的影响，当环境改变或一些基团的相互作用被削弱时，容易引起酶结构的崩溃以及构象杂乱化。酶的空间结构一旦遭到破坏，活性中心的构象也随之改变，最终导致酶失活。冷冻干燥贮藏方法虽然能避免高温造成的酶失活问题，但是成本高，耗时长，且销售和应用都需在低温下进行。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种能常温环境贮藏和长途运输的蚓激酶浓缩浆料生产工艺，能够在常温储藏和运输，具有常年保质的特点。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种能常温环境贮藏和长途运输的蚓激酶浓缩浆料生产工艺，包括以下步骤：

a)收集蚯蚓磨浆液

排空蚯蚓腹腔杂物、清洗干净后，研磨制成浆，得到蚯蚓磨浆料；

b)连续离心除渣

将步骤a)得到的蚯蚓磨浆料在12000r/min下离心除渣，得到上清液；

c)澄清过滤，截留蚓浆残留固形物，释放蚓激酶生物大分子

向步骤b)得到的上清液中加通入膜组件，澄清料液；

d)脱脂处理

向步骤c)得到的料液加入氯化钠，直至氯化钠的浓度达到1M，经10000r/min离心30min，蚯蚓油脂相分离；

e)脱盐浓缩

将步骤d)得到的澄清液通入截留分子量为5KD的膜组件，得到浓缩液，再向浓缩液中加入纯净水，再通入截留分子量为5000D的膜组件，得到蚓激酶浓缩浆料；

步骤a)～步骤e)全程操作过程在紫外线连续照射、x射线累积辐照或γ射线累积辐照下进行操作。

进一步地，紫外线由功率为300～500W的紫外线设备发射。

进一步地，x射线累积辐照剂量为60万拉德、γ射线累积辐照剂量为100万拉德。

进一步地，步骤e)具体为：澄清液通入截留分子量为5KD的膜组件，浓缩至原澄清液体积的1/5时，向贮料罐中添加纯净水，再通入截留分子量为5KD的膜组件，如此反复操作，经8～10个循环过程，得到蚓激酶浓缩浆料。

进一步地，纯净水的加入量等于膜组件超出液的体积。

进一步地，步骤e)浓缩终点为，蚓激酶浓缩浆料中固含量在100mg/ml以下。

进一步地，步骤c)中膜组件的截留分子量为50KD。

进一步地，步骤e)后还包括将蚓激酶浓缩浆料经冷冻或喷雾干燥处理制成粉剂。

进一步地，步骤c)和步骤e)中膜组件为中空纤维膜、卷式膜、折叠膜、烧结金属膜或陶瓷膜。

本发明公开了一种能常温环境贮藏和长途运输的蚓激酶浓缩浆料生产工艺，包括磨浆、除渣、过滤、脱脂、脱盐浓缩、灭菌等步骤，能够剔除水溶性杂质、变性蛋白、蚯蚓油脂等杂质，提高蚓激酶浓缩浆料中蚓激酶丰度，降低生产线分离介质的负荷，提高蚓激酶收率；且生产得到的蚓激酶浓缩浆料物化性质稳定，其中的酶活力保持持久。本发明的生产工艺适应不同蚓激酶工艺路线，制得的蚓激酶浓缩浆料能直接用于蚓激酶精制工程，同时也可以经冷冻或喷雾干燥处理制成粉剂形式，作为蚯蚓体原料替代品，具备常温储藏和运输，常年保质的特点，适用于各种蚓激酶生产流程的起始原料。

附图说明

图1为试验工艺蚓激酶紫外光谱扫描图；

图2为对比工艺蚓激酶紫外光谱扫描图；

图3为试验工艺与对比工艺得到的蚓激酶效价测定图。

具体实施方式

为了进一步了解本发明，下面结合实施例对本发明的优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点而不是对本发明专利要求的限制。

本发明提供的一种能常温环境贮藏和长途运输的蚓激酶浓缩浆料生产工艺，包括以下步骤：

a)收集蚯蚓磨浆液

排空蚯蚓腹腔杂物、清洗干净后，研磨制成浆，得到蚯蚓磨浆料；

b)连续离心除渣

将步骤a)得到的蚯蚓磨浆料在12000r/min下离心除渣，得到上清液；

c)澄清过滤，截留蚓浆残留固形物，释放蚓激酶生物大分子

向步骤b)得到的上清液中加通入膜组件，澄清料液；

d)脱脂处理

向步骤c)得到的料液加入氯化钠，直至氯化钠的浓度达到1M，经10000r/min离心30min，蚯蚓油脂相分离；

e)脱盐浓缩

将步骤d)得到的澄清液通入截留分子量为5KD的膜组件，得到浓缩液，再向浓缩液中加入纯净水，再通入截留分子量为5000D的膜组件，得到蚓激酶浓缩浆料；

步骤a)～步骤e)全程操作过程在紫外线连续照射、x射线累积辐照或γ射线累积辐照下进行操作。

本发明的生产工艺包括磨浆、除渣、过滤、脱脂、脱盐浓缩、灭菌等步骤，能够剔除水溶性杂质、变性蛋白、蚯蚓油脂等杂质，提高蚓激酶浓缩浆料中蚓激酶丰度，降低生产线分离介质的负荷，提高蚓激酶收率；且生产得到的蚓激酶浓缩浆料物化性质稳定，其中的酶活力保持持久。本发明的生产工艺适应不同蚓激酶工艺路线，制得的蚓激酶浓缩浆料能直接用于蚓激酶精制工程的蚯蚓体原料替代品，且能够常温储藏和运输，具有常年保质的特点，适用于蚓激酶工厂生产的起始原料。

本发明排空蚯蚓腹腔杂物、清洗干净后，研磨成浆，得到蚯蚓磨浆料；为了保证蚯蚓中蚓激酶的活性，蚯蚓浆料制备过程的温度不超过15℃，时间不超过8h。在本发明的实施例中，研磨成浆采用的装置为砂轮磨，胶体磨，震动磨或球磨机。

将蚯蚓磨浆料在12000r/min下离心除渣，得到上清液。

上清液中加通入膜组件，澄清料液；上述用于截留蚓浆中残留固形物并释放蚓激酶生物大分子。在本发明的实施例中，膜组件的截留分子量为50KD。

向料液加入氯化钠，直至氯化钠的浓度达到1M，经10000r/min离心30min，蚯蚓油脂相被分离；上述步骤用于脱去蚯蚓油脂等杂质，提高蚓激酶浓缩浆料中蚓激酶丰度。

将澄清液通入截留分子量为5KD的膜组件，得到浓缩液，再向浓缩液中加入纯净水，再通入截留分子量为5000D的膜组件，得到蚓激酶浓缩浆料；需要说明的是，超出液为低于5000D小分子杂质，截留物溶质主要是蚓激酶。

在本发明的实施例中，上述步骤具体为澄清液通入截留分子量为5KD的膜组件，浓缩至原澄清液体积的1/5时，向贮料罐中添加纯净水，再通入截留分子量为5KD的膜组件，如此反复操作，经8～10个循环过程，得到蚓激酶浓缩浆料。其中纯净水的加入量等于超出液的体积。经上述步骤得到的蚓激酶浓缩浆料中固含量为100mg/ml以下，该固含量为浓缩步骤的终点。

需要说明的是，步骤a)～步骤e)全程操作过程在紫外线连续照射、x射线累积辐照或γ射线累积辐照下进行操作；通过上述杀菌步骤利于蚓激酶浓缩浆料常温储藏和运输，保证了蚓激酶浓缩浆料的质量。

其中，紫外线由功率为300～500W的紫外线设备发射；x射线累积辐照剂量为60万拉德、γ射线累积辐照剂量为100万拉德。

本发明能够剔除5×10³～10×10⁴D分子量范围之外的水溶性杂质，这些杂质剔除可降低生产线负荷，提高蚓激酶收率。

需要说明的是，本文中提到的膜组件为中空纤维膜、卷式膜、折叠膜、烧结金属膜或陶瓷膜。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种能常温环境贮藏和长途运输的蚓激酶浓缩浆料生产工艺进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

a)收集蚯蚓磨浆液

排空蚯蚓腹腔杂物、清洗干净后，采用砂轮磨研磨制成浆，得到蚯蚓磨浆料；蚯蚓浆料制备过程的温度为15℃，时间为8h；

b)连续离心除渣

将步骤a)得到的蚯蚓磨浆料在12000r/min下离心除渣，得到上清液；

c)澄清过滤

向步骤b)得到的上清液中加通入截留分子量为50KD的卷式膜组件，澄清料液；

d)脱脂处理

向步骤c)得到的料液加入氯化钠，直至氯化钠的浓度达到1M，经10000r/min离心30min，蚯蚓油脂相被分离；

e)脱盐浓缩

将步骤d)得到的澄清液通入截留分子量为5KD的折叠膜组件，浓缩至原澄清液体积的1/5时，向贮料罐中添加纯净水，纯净水的加入量等于超出液的体积，再通入截留分子量为5KD的折叠膜组件，如此反复操作，经8个循环过程，得到蚓激酶浓缩浆料，蚓激酶浓缩浆料中固含量为100mg/ml；再蚓激酶浓缩浆料经冷冻处理制成粉剂。

步骤a)～步骤e)全程操作过程在由功率为500W的紫外线设备发射的紫外线连续照射下进行操作。

实施例2与实施例1的区别仅为步骤a)～步骤e)全程操作过程在由功率为300W的紫外线设备发射的紫外线连续照射下进行操作，其他与实施例1完全相同。

实施例3

a)收集蚯蚓磨浆液

排空蚯蚓腹腔杂物、清洗干净后，采用球磨机研磨制成浆，得到蚯蚓磨浆料；蚯蚓浆料制备过程的温度为10℃，时间为6h；

b)连续离心除渣

将步骤a)得到的蚯蚓磨浆料在12000r/min下离心除渣，得到上清液；

c)澄清过滤

向步骤b)得到的上清液中加通入截留分子量为50KD的烧结金属膜组件，澄清料液；

d)脱脂处理

向步骤c)得到的料液加入氯化钠，直至氯化钠的浓度达到1M，经10000r/min离心30min，蚯蚓油脂相被分离；

e)脱盐浓缩

将步骤d)得到的澄清液通入截留分子量为5KD的陶瓷膜组件，浓缩至原澄清液体积的1/5时，向贮料罐中添加纯净水，纯净水的加入量等于超出液的体积，再通入截留分子量为5KD的陶瓷膜膜组件，如此反复操作，经8个循环过程，得到蚓激酶浓缩浆料，蚓激酶浓缩浆料中固含量为80mg/ml；将蚓激酶浓缩浆料经喷雾干燥制成粉剂。

步骤a)～步骤e)全程操作过程在x射线累积辐照下进行操作，x射线累积辐照剂量分别为60万拉德。

实施例4

a)收集蚯蚓磨浆液

排空蚯蚓腹腔杂物、清洗干净后，采用球磨机研磨制成浆，得到蚯蚓磨浆料；蚯蚓浆料制备过程的温度为15℃，时间为8h；

b)连续离心除渣

将步骤a)得到的蚯蚓磨浆料在12000r/min下离心除渣，得到上清液；

c)澄清过滤

向步骤b)得到的上清液中加通入截留分子量为50KD的中空纤维膜组件，澄清料液；

d)脱脂处理

向步骤c)得到的料液加入氯化钠，直至氯化钠的浓度达到1M，经10000r/min离心30min，蚯蚓油脂相被分离；

e)脱盐浓缩

将步骤d)得到的澄清液通入截留分子量为5KD的中空纤维膜组件，浓缩至原澄清液体积的1/5时，向贮料罐中添加纯净水，纯净水的加入量等于超出液的体积，再通入截留分子量为5KD的中空纤维膜组件，如此反复操作，经8个循环过程，得到蚓激酶浓缩浆料，蚓激酶浓缩浆料中固含量为100mg/ml。

步骤a)～步骤e)全程操作过程在γ射线累积辐照下进行操作，γ射线累积辐照剂量分别为100万拉德。

以实施例4制得的蚓激酶浓缩浆料为例，将其在常温下贮藏，并采用平板法检测酶活，结果见表1。

表1蚓激酶浓缩浆料的酶活力

检测年份	酶活力(u/mL)
		2010	1.5×10<sup>6</sup>
2011	1.5×10<sup>6</sup>
		2012	1.2×10<sup>6</sup>
2013	1.0×10<sup>6</sup>
		2016	0.7×10<sup>6</sup>
2019	0.5×10<sup>6</sup>

由表1可知，本发明提供的技术方案得到的蚓激酶浓缩浆料物化性质稳定，酶活力保持持久，十年后蚓激酶浓缩浆料中蚓激酶的酶活力仍保留1/3原蚓激酶浓缩浆料中蚓激酶的酶活力。

市售蚓激酶专用二乙胺基树脂纤维素装填柱，两种生产蚓激酶工艺平行对照操作：

对比工艺：采用离子交换法，以蚯蚓体为起始原料，分离蚓激酶。

具体制备方法过程为：以新鲜蚯蚓为原料，按照实施例4的步骤得到蚓激酶浓缩浆料后装填阴离子交换层析柱床，再经盐解析，澄清，脱盐浓缩，冷冻干燥得蚓激酶产成品。

试验工艺：以实施例4生产得到的蚓激酶浓缩浆料为起始原料，直接分离蚓激酶。方法为，以常温环境贮藏1年的实施例4生产得到的蚓激酶浓缩浆料为原料，将其装填阴离子交换层析柱床，再经盐解析、澄清、脱盐浓缩，冷冻干燥得到蚓激酶成品。

取试验工艺制得的蚓激酶进行样品编号84201、84204，取对比工艺制得的蚓激酶进行样品编号84202、84205，对这四个样品分别进行紫外光谱扫描及效价测定，结果见图1、图2、图3及见表2。

表2对比工艺和试验工艺的光谱扫描峰值

由图1～2可知，对比工艺和试验工艺制得的蚓激，紫外光谱扫描图可看出峰值已高出276nm+-2的药典要求值，说明该产品蛋白质含量更接近纯蛋白质的特征吸收峰280nm。

由表2、图3可知，对比工艺和试验工艺两条路线制得的蚓激酶产成品效价基本相同，光谱值均达到国家药典规定标准。试验工艺较对比工艺，由于前处理工段全部去除，工时、用工均省去一半，因此常温贮藏和长途运输的蚓激酶浓缩浆料，可替代蚯蚓体直接提取蚓激酶的工艺，可大幅度降低蚓激酶制造成本。

以上对本发明提供的一种能常温环境贮藏和长途运输的蚓激酶浓缩浆料生产工艺进行了详细的介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。