阅读说明：本技术 一种利用安吉白茶修剪枝叶生产茶黄素的方法 (Method for producing theaflavin by utilizing branches and leaves of Anji white tea pruning ) 是由 田伟 程勇 邵云东 阎卫东 丁建宝 程琨 陈�峰 于 2020-06-01 设计创作，主要内容包括：本发明属于茶黄素提取技术领域,具体公开了一种利用安吉白茶修剪枝叶生产茶黄素的方法,该方法包括缓冲液的制备、酶液的制备、底物溶液的制备、发酵、过滤、萃取以及浓缩干燥步骤,本发明选用安吉白茶修剪枝叶作为酶源,既不引入外源性酶源又实现废弃资源的再利用,有效增加经济效益；并采用双液相发酵方法生产茶黄素,通过对酶液、缓冲液、酶促反应体系等条件的优化,显著提高了酶的转化率,并且反应稳定,能够持续高效进行,茶黄素得率高,因此能够实现产业化。此外,本发明发酵液过滤后的滤饼仍旧具有良好的活性,可作为二次酶源循环利用。(The invention belongs to the technical field of theaflavin extraction, and particularly discloses a method for producing theaflavin by utilizing Anji white tea pruning branches and leaves, which comprises the steps of buffer solution preparation, enzyme solution preparation, substrate solution preparation, fermentation, filtration, extraction, concentration and drying, wherein the Anji white tea pruning branches and leaves are used as an enzyme source, so that the exogenous enzyme source is not introduced, the reutilization of waste resources is realized, and the economic benefit is effectively increased; the method adopts a double-liquid-phase fermentation method to produce theaflavin, obviously improves the conversion rate of enzyme by optimizing the conditions of enzyme solution, buffer solution, enzymatic reaction system and the like, has stable reaction, can be continuously and efficiently carried out, and has high theaflavin yield, thereby realizing industrialization. In addition, the filter cake obtained after the fermentation liquor is filtered still has good activity and can be recycled as a secondary enzyme source.)

一种利用安吉白茶修剪枝叶生产茶黄素的方法

技术领域

本发明涉及茶黄素提取技术领域，具体涉及一种利用安吉白茶修剪枝叶生产茶黄素的方法。

背景技术

茶黄素是存在于红茶中的一种金黄色色素，是一类多酚羟基具有茶骈酚酮结构的物质，由多酚类及其衍生物氧化缩合而来，现已发现的茶黄素有12种，其中茶黄素（TFs）、茶黄素-3-没食子酸酯（TF-3-G）、茶黄素-3’-没食子酸酯（TF-3’-G）和茶黄素双没食子酸酯（TFDG）是四种最主要的茶黄素。红茶中茶黄素类的含量一般为0.3%～1.5%，对红茶的色香味及品质起着决定性的作用。茶黄素不仅是红茶的重要品质成分，而且具有多种与人体健康有关的潜在功效，如抗氧化、防癌抗癌、降血脂、预防心血管疾病、抗糖尿病、抗菌、抗病毒等，此外茶黄素还是化妆品、食品的天然着色剂，因而受到国内外广泛关注，成为研究热点。

目前，制备茶黄素的方法大致有三种：萃取法、化学氧化法、酶促氧化法。提取法是指直接将红茶中的茶黄素进行提取，但由于茶黄素在红茶中含量低微，提取纯化的难度大，得率低。化学氧化法是指利用化学试剂将茶多酚转化为茶黄素，需要使用大量的铁***、三氧化铁、氧化镁以及酸碱等化学试剂，环境污染严重，需要投入更多的污水处理费用，并且由于化学法缺乏底物专一性，副产品复杂，产品纯度、安全性受到限制。酶促氧化法是指利用酶进行发酵将茶多酚转化为茶黄素，反应条件温和、专一性强，能避免上述萃取法和化学氧化法的弊端，因而更具优势，但酶促氧化法也存在一些问题，如酶转化率低，反应速率不稳定难以控制，得率不高等，因此难以产业化。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种利用安吉白茶修剪枝叶生产茶黄素的方法，酶转化率高，反应速率稳定，茶黄素得率高，可以实现产业化。

为达到上述目的，本发明采用的具体技术方案如下：

一种利用安吉白茶修剪枝叶生产茶黄素的方法，包括以下步骤：

S1.缓冲液的制备：在水中按加入盐至盐的质量浓度为0.1～10%，再加入柠檬酸将pH调节至4.8～5.2；所述盐为(NH₄)₂ SO₄、Na₂HPO₄、K₂CO₃、Na₂ SO₄、K₂HPO₄、Na₂CO₃、CaCl₂、KH₂PO₄或者NaCl；

S2.酶液的制备：采集新鲜的安吉白茶修剪枝叶，按（45～55）:1的质量比加入缓冲液；再通过粉碎机进行粉碎，粉碎2次，置于冷库备用。

S3.底物溶液的制备：将茶多酚溶液与缓冲液混合，制得底物溶液，底物浓度按质量百分比计在3～8%；

S4.发酵：按1∶（5～8）的质量比将酶液与底物溶液混合，按底物溶液体积的0.5～1倍加入乙酸乙酯 ，形成双相反应体系；加热至30～45℃，并按0.5～2个单位/min的量通入空气或氧气，以60～150r/min的转速搅拌，发酵6～12h；

S5.过滤：发酵液进入板框压滤机进行过滤；进料结束后，进压缩空气，将板框中剩余料液带走，并吹干滤饼；滤饼可作为二次酶源循环利用，滤液用于作下步萃取；

S6.萃取：将滤液和乙酸乙酯按体积比1：（2.5～3.5）混合，进行萃取，搅拌20～30min，静置1～2h彻底分层，取上层有机层；

S7.浓缩干燥：对有机层进行减压浓缩，真空度控制在＞0.06MPa，去除溶剂乙酸乙酯，并多次补充水，去除乙酸乙酯残留；再对浸膏进行喷雾干燥，收集干粉，得到茶黄素产品。

优选的，步骤S1所述盐为Na₂HPO₄。

优选的，步骤S2所述安吉白茶修剪枝叶选取5～10cm的修剪部分。

优选的，步骤S2所述安吉白茶修剪枝叶的粉碎目数为在200～260目。

优选的，步骤S3所述茶多酚溶液为绿茶提取液，制备方法如下：茶叶粉碎至过20～50目筛，按1∶（10～20）的料液质量比加入纯净水，于70～95℃温度下，提取30～90min，提取液降温至25～45℃，用分子量为30万Da的澄清膜进行澄清后，再经反渗透浓缩,得绿茶提取液。

优选的，步骤S4发酵时加热至30～35℃，发酵时间8～12h。

优选的，步骤S4中底物溶液分批投料，至少分三批，后一批投料量不超过前一批投料量；分批投料间隔时间不少于20min。

进一步的，步骤S3所述底物浓度为5%，步骤S4中将底物溶液按质量比2:2:1分成三批，间隔30min投入。

优选的，步骤S5所述板框压滤机采用孔径在280-320目的滤布，进料速度制在200～300L/h。

优选的，步骤S7所述的浓缩过程中，温度控制在＜80℃，以相对密度1.08～1.12为浓缩终点；在收膏前按加水量：浸膏量（质量比）=1: （2.5～3.5）加水，除去溶剂残留，至少加三次水。

本发明具有以下有益效果：

1、选用茶的枝叶作为酶源，既不会在发酵过程中引入外源性酶源，也充分发挥因地制宜的特色，所选枝叶为茶农修剪茶树时遗弃的茶枝，体现废弃资源再利用的特点，既降低了成本，也为当地茶农增加了额外的收入。

2、安吉白茶修剪枝叶中的多酚氧化酶具有良好的催化活性，为使该酶充分发挥作用，本发明先将修剪枝叶与缓冲液混合，再连同修剪枝叶与缓冲液一起进行粉碎，通过粉碎破坏细胞的膜结构，将酶释放或者暴露，缓冲液的存在使酶获得良好的保护作用，制成酶液后，方便储存，不易失活。更加优化的，选取5～10cm的安吉白茶修剪枝叶以获得含量多、活性强的多酚氧化酶；缓冲液为pH4.8～5.2的柠檬酸-磷酸氢二钠体系，不仅对酶起保护作用，也为后续发酵提供合适的反应条件；将修剪枝叶的粉碎目数控制在200～260目，一方面使酶与底物有充分的接触面积，另一方面提高发酵过程氧气扩散的速率以及提升氧气的吸收水平，从而提高反应效率。

3、采用双液相发酵，加入乙酸乙酯构成二项反应体系，利用产物茶黄素易溶于有机溶剂，不易溶于水相的特性，茶黄素由水相富集到有机相，降低了水相中茶黄素浓度，使得氧化反应向正向进行，提高反应速率，提升发酵效果。具体的，需要严格控制以下条件以获得最佳的酶促反应体系：①底物浓度（即茶多酚量）是决定该反应进行的重要参数，过低反应速度慢，过高会抑制酶的活性也会导致反应速度过慢，本发明将底物浓度控制在3～8%（质量百分比），并按1∶（5～8）的质量比将酶液与底物溶液混合，以获得合适的底物浓度以及底物与酶的配比量，使反应能充分快速进行；②按底物溶液体积的0.5～1倍加入乙酸乙酯，乙酸乙酯用量低于或高于这个区间都降低反应速度，过低时影响茶黄素的转移，过高时会增加与酶接触的机会导致酶失活的可能性提高，也会增加残留量，影响酶的二次利用。更加优化的，底物溶液分批投料，至少分三批，后一批投料量不超过前一批投料量，分批投料间隔时间不少于20min，这样通过对底物浓度做线性控制，以免初始底物浓度过高抑制酶的活性导致反应速度过缓，确保反应的持续高效进行，提高发酵过程的稳定性。

4、减压浓缩时在收膏前通过多次补水，去除乙酸乙酯残留，提高茶黄素产品的品质与安全性。

5、发酵液过滤后滤饼可作为二次酶源循环利用，并且为了确保二次利用的酶仍旧具备良好的活性，本发明在工艺过程中从以下两方面对酶进行保护：①始终使酶处于缓冲液环境，并且缓冲液环境的温度、pH也严格控制；②通过乙酸乙酯量的控制，减少其在反应过程与酶的接触并降低滤饼中乙酸乙酯的残留，最后吹干滤饼除去剩余的乙酸乙酯，将乙酸乙酯的危害降至最低，有效避免了酶活性大幅下降甚至失活。

6、与单液相发酵相比，本发明在茶黄素含量上提高30%左右，净量收率提高10%左右，转换率提高30%左右。由此，本发明的双液相反应体系具有明显的优势。

综上，本法明采用双液相发酵，通过对酶液、缓冲液、酶促反应体系等条件的优化，显著提高了酶的转化率，并且反应稳定，能够持续高效进行，茶黄素得率高，因此能够实现产业化。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明进行进一步的说明。

实施例1

一种利用安吉白茶修剪枝叶生产茶黄素的方法，包括以下步骤：

S1.缓冲液的制备：在400mL水中加入5%（质量百分比）的Na₂HPO₄，再加

入柠檬酸将pH调节至4.8～5.2；

S2. 酶液的制备：取80g新鲜的5～10cm安吉白茶修剪枝叶，按50:1的质

量比加入缓冲液；再通过粉碎机粉碎2次，粉碎目数为在200～260目，置于冷库备用；

S3.底物溶液的制备：将茶多酚溶液与缓冲液混合，制得底物溶液，底物浓度

（即茶多酚量）按质量百分比计在5%；其中，所述茶多酚溶液为绿茶提取液，绿茶提取液，制备方法如下：茶叶粉碎至过20～50目筛，按1∶（10～20）的料液质量比加入纯净水，于70～95℃温度下，提取30～90min，提取液降温至25～45℃，用分子量为30万Da的澄清膜进行澄清后，再经反渗透浓缩,得绿茶提取液。

S4.发酵：按1∶6质量比将酶液与底物溶液混合，按底物溶液体积的0.5倍

加入乙酸乙酯 ，形成稳定的双相反应体系；加热至30～35℃，并按0.5～2个单位/min的量通入空气或氧气，以90r/min的转速搅拌，发酵8h；优选的，将底物溶液按质量比2:2:1分成三批，间隔30min投入；

S5.过滤：发酵液进入板框压滤机进行过滤，板框压滤机采用孔径在280～320

目的滤布，进料速度制在200～300L/h；进料结束后，进压缩空气，将板框中剩余料液带走，并吹干滤饼；滤饼可作为二次酶源循环利用，滤液用于作下步萃取；

S6.萃取：将滤液和乙酸乙酯按体积比1：3混合，进行萃取，搅拌20～30min，

静置1～2h彻底分层，取上层有机层；

S7.浓缩干燥：对有机层进行减压浓缩去除溶剂乙酸乙酯，真空度控制在＞

0.06MPa，温度控制在＜80℃，以相对密度1.08～1.12为浓缩终点；在收膏前按加水量：浸膏量（质量比）=1:3加水，除去溶剂残留，至少加三次水，去除乙酸乙酯残留；再对浸膏进行喷雾干燥，喷雾干燥时控制进风温度195±5℃，出风温度95±5℃，结束后收集干粉，得到均匀精细的茶黄素产品。

本实施例的效果评估结果如下：

其中：质量收率=（产物质量/底物质量）*100%；EGC、CF、DL-C、EC、EGCG、ECG的检测标准为GB/T 8313-2018 茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法；TF、TFDG、TF-3-G、TF-3'-G的检测标准为GB/T31740《茶制品》第三部分茶黄素的检测方法。

结论：由表格中数据可知，本实施例茶黄素得率高。

实施例2

本实施相对于实施例1为一扩大化试验，具体如下：

一种利用安吉白茶修剪枝叶生产茶黄素的方法，包括以下步骤：

S1.缓冲液的制备：在1500L水中加入5%（质量百分比）的Na₂HPO₄，再加

入柠檬酸将pH调节至4.8～5.2；

S2. 酶液的制备：取240g新鲜的5～10cm安吉白茶修剪枝叶，按50:1的质

量比加入缓冲液；再通过粉碎机粉碎2次，粉碎目数为在200～260目，置于冷库备用；

S3.底物溶液的制备：将茶多酚溶液与缓冲液混合，制得底物溶液，底物浓度

（即茶多酚量）按质量百分比计在5%；其中，所述茶多酚溶液为绿茶提取液，绿茶提取液，制备方法如下：茶叶粉碎至过20～50目筛，按1∶（10～20）的料液质量比加入纯净水，于70～95℃温度下，提取30～90min，提取液降温至25～45℃，用分子量为30万Da的澄清膜进行澄清后，再经反渗透浓缩,得绿茶提取液。

S4.发酵：按1∶6质量比将酶液与底物溶液混合，按底物溶液体积的0.5倍

加入乙酸乙酯 ，形成稳定的双相反应体系；加热至30～35℃，并按0.5～2个单位/min的量通入空气或氧气，以90r/min的转速搅拌，发酵12h；优选的，将底物溶液按质量比2:2:1分成三批，间隔30min投入；

S5.过滤：发酵液进入板框压滤机进行过滤，板框压滤机采用孔径在280～320

目的滤布，进料速度制在200～300L/h；进料结束后，进压缩空气，将板框中剩余料液带走，并吹干滤饼；滤饼可作为二次酶源循环利用，滤液用于作下步萃取；

S6.萃取：将滤液和乙酸乙酯按体积比1：3混合，进行萃取，搅拌20～30min，

静置1～2h彻底分层，取上层有机层；

S7.浓缩干燥：对有机层进行减压浓缩去除溶剂乙酸乙酯，真空度控制在＞

0.06MPa，温度控制在＜80℃，以相对密度1.08～1.12为浓缩终点；在收膏前按加水量：浸膏量（质量比）=1:3加水，除去溶剂残留，至少加三次水，去除乙酸乙酯残留；再对浸膏进行喷雾干燥，喷雾干燥时控制进风温度195±5℃，出风温度95±5℃，结束后收集干粉，得到均匀精细的茶黄素产品。

本实施例的效果评估结果如下：

结论：在实施例1小试的基础上扩大规模，结果显示仍旧有较高的茶黄素得率，质量收率也未有影响，说明本发明的体系比较稳定，可以实现产业化。

实施例3

一种利用安吉白茶修剪枝叶生产茶黄素的方法，具体实验步骤基本同实施例1，区别在于本实施例的底物添加量为12g（实施例1为20g），同时设置单向反应体系作为对照组，即发酵步骤不加乙酸乙酯，各做8组平行，两种体系制备茶黄素的效果对比结果如下：

其中：净量收率（茶黄素净量收率）=（产物质量*茶黄素含量）/底物质量；转化率=（底物量*反应前总儿茶含量-产物量*反应后总儿茶含量）/（底物量*反应前总儿茶含量）；

结论：本实施例将本发明与单相反应体系做对比，结果显示，双相反应体系相比单相反应体系，在茶黄素含量上提高30个百分点；净量收率提高10个百分点；转换率提高30个百分点。

本具体实施方式仅仅是对本发明的解释，并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读了本发明的说明书之后所做的任何改变，只要在本发明权利要求书的范围内，都将受到专利法的保护。