阅读说明：本技术 一种促进紫色色杆菌中脱氧紫色杆菌素表达的方法 (Method for promoting expression of deoxyviolacein in chromobacterium violaceum ) 是由 张丽影 权春善 李容庆 马浩迪 石荟 向航宇 于 2019-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种促进紫色色杆菌中脱氧紫色杆菌素表达的方法,属于生物医药领域。主要技术方案为：在25-35℃条件下,将一定浓度的组氨酸脂肪醛希夫碱与已活化12小时的紫色色杆菌共同培养12-48小时,随后收集菌体表达的脱氧紫色杆菌素。本发明提供的组氨酸脂肪醛希夫碱具有与紫色色杆菌群体感应系统信号分子正己烷-L-高丝氨酸内酯极为相似五元环头部结构和长链脂肪醛尾部,可有效促进紫色色杆菌中脱氧紫色杆菌素的表达,该方法简便易行,便于推广,为解决脱氧紫色杆菌素产量极低的问题提供理论参考。(The invention relates to a method for promoting expression of deoxyviolacein in chromobacterium violaceum, belonging to the field of biological medicine. The main technical scheme is as follows: culturing histidine fatty aldehyde Schiff base with activated chromobacterium violaceum at 25-35 deg.c for 12-48 hr, and collecting deoxyviolacein expressed by thallus. The histidine fatty aldehyde Schiff base provided by the invention has a five-membered ring head structure and a long-chain fatty aldehyde tail part which are very similar to a signal molecule n-hexane-L-homoserine lactone of a chromobacterium violaceum quorum sensing system, and can effectively promote the expression of deoxyviolacein in chromobacterium violaceum.)

一种促进紫色色杆菌中脱氧紫色杆菌素表达的方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体的涉及一种促进紫色色杆菌中脱氧紫色杆菌素表达的方法。

背景技术

紫色杆菌素是微生物产生的一种代谢产物，属于吲哚衍生物，是非水溶性的蓝黑色色素。19世纪人们发现Chromobacterium violaceum能够表达紫色杆菌素，此后又有不同菌种被陆续发现能够产生紫色杆菌素。随后，人们发现这种蓝紫色色素中除了紫色杆菌素外还有另外一种含量较少的物质--脱氧紫色杆菌素。

研究表明，紫色杆菌素具有非常优异的生物活性，包括广谱抗菌性(有效抑制链球菌、芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、假单胞菌等)；抗病毒性(对侵染Hela细胞的单纯性疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒有抵抗活性)；抗肿瘤细胞(显著抑制结肠癌HT29细胞增殖)；遗传毒性和抗原生动物活性等。脱氧紫色杆菌素与紫色杆菌素结构上相差一个羟基，这种色素在菌体中的表达量更小，仅为紫色杆菌素的十分之一，但其也同样具有抗肿瘤、抗革兰氏阳性菌及抗植物致病菌等活性。然而，这两种蓝紫色微生物代谢产物目前的产量极低，无法实现工业化生产。因此，迫切需要一种促进紫色色杆菌中紫色杆菌素和脱氧紫色杆菌素表达的方法、以解决产量低的问题。

紫色杆菌素及脱氧紫色杆菌素的表达受紫色色杆菌中CviI/CviR群体感应系统的调控。该系统主要的信号分子为正己烷-L-高丝氨酸内酯(N-hexanoyl-L-homoserinelactone,HHL)。其分子结构式如下。

HHL信号分子与受体蛋白CviR结合后，受体蛋白胞内域发生磷酸化，随后激活下游信号通路，实现脱氧紫色杆菌素的表达。如能在胞外增强信号分子强度，则有望增强整个通路的信号，提高脱氧紫色杆菌素的表达量。

发明内容

为解决现有技术存在的问题，本发明设计并合成组氨酸脂肪醛类希夫碱，包括组氨酸庚醛、组氨酸辛醛、组氨酸癸醛和组氨酸十二醛。该类化合物在促进紫色色杆菌中脱氧紫色杆菌素的表达方面表现出优异的生物活性。本发明提供了一种促进紫色色杆菌中脱氧紫色杆菌素表达的方法，有效提高了脱氧紫色杆菌素的产量，为脱氧紫色杆菌素实现工业化量产提供理论依据。

本发明的技术方案如下：一种促进紫色色杆菌中脱氧紫色杆菌素表达的方法，步骤如下：

在25-35℃条件下，将一定浓度的组氨酸脂肪醛希夫碱与已活化12小时的紫色色杆菌共同培养12-48小时，随后收集菌体表达的脱氧紫色杆菌素；

所述组氨酸脂肪醛希夫碱的制备方法为：将组氨酸与不同链长的脂肪醛在氮气保护条件下，在混有碱性物质的溶剂中，50～90℃反应3-8小时生成组氨酸脂肪醛希夫碱；

所述组氨酸脂肪醛希夫碱的化学式为

其中，n为1-13之间的任意整数；

进一步的，所述的组氨酸脂肪醛希夫碱的浓度小于2.5mmol/L。

进一步的，最佳的表达方法为：在30℃条件下，将1.5mmol/L组氨酸脂肪醛希夫碱与已活化12小时的紫色色杆菌共同培养24小时，随后收集菌体表达的脱氧紫色杆菌素。

本发明的有益效果如下：

本发明提供的组氨酸脂肪醛希夫碱具有与紫色色杆菌群体感应系统信号分子正己烷-L-高丝氨酸内酯极为相似五元环头部结构和长链脂肪醛尾部，可有效促进紫色色杆菌中脱氧紫色杆菌素的表达，该方法简便易行，便于推广，为解决脱氧紫色杆菌素产量极低的问题提供理论参考。

附图说明

图1组氨酸正庚醛席夫碱¹H核磁谱图；

图2组氨酸正辛醛席夫碱¹H核磁谱图；

图3组氨酸席癸醛组夫碱¹H核磁谱图；

图4组氨酸十二醛席夫碱¹H核磁谱图；

图5脱氧紫色杆菌素质谱图；

图6脱氧紫色杆菌素紫外全波长光谱图；

图7脱氧紫色杆菌素标准曲线图；

图8为组氨酸脂肪醛席夫碱上样顺序图；

图9组氨酸脂肪醛希夫碱与紫色色杆菌共培养12小时图；

图10组氨酸脂肪醛希夫碱对脱氧紫色杆菌素表达量的影响(24小时)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，若无特殊说明，本发明所用原料均市售可得。

实施例1组氨酸脂肪醛希夫碱的合成

在装有60mL无水乙醇的圆底烧瓶中，加入10mmol组氨酸和10mmol氢氧化钾，氮气保护下50℃搅拌溶解。将20mmol脂肪醛溶于20mL无水乙醇，缓慢滴加到圆底烧瓶中，55℃搅拌3h。反应结束后，冷却至室温，抽滤除去未反应的组氨酸。将滤液溶液减压蒸发(40℃)，得到浅黄色固体。将产物置于20mL离心管中，加入15mL丙酮，超声清洗10分钟，7000rpm/min离心3分钟，共清洗10次，得到浅黄色固体，真空干燥得到浅黄色固体。利用核磁氢谱对其结构进行表征，结果图1、图2、图3和图4所示。

实施例2紫色色杆菌的培养

#802培养基：多聚蛋白胨10g，酵母粉2g,MgSO₄·7H₂O 1g加入去离子水定容至1升，120℃灭菌30min。

在超净工作台中，取一个无菌的24孔板。各孔均加入#802液体培养基1980μL，活化12h的紫色色杆菌液20μL，30℃培养36小时。

实施例3脱氧紫色杆菌素的鉴定

将实例1的培养液移至离心管中，离心20分钟(10000r/min)弃去上层，再加入去离子水超声洗涤10分钟，离心20分钟(10000r/min)弃去上层。向离心管中加入1mL甲醇进行萃取，离心20分钟(10000r/min)取上层液体，在旋转蒸发仪上蒸干。再次加入1mL甲醇进行萃取并旋干，重复操作三次。

经质谱鉴定，萃取得到的蓝紫色色素为分子量为326的脱氧紫色杆菌素(图5)。

将萃取得到的脱氧紫色杆菌素配制成浓度为1mg/mL的甲醇溶液，用规格为200μL的比色皿进行紫外全波长扫描，确定其特征吸收峰为564.5nm(图6)。

实施例4脱氧紫色杆菌素标准曲线测定

将脱氧紫色杆菌素配制成不同浓度的甲醇溶液，用规格为200μL的比色皿进行吸光度值(OD_564.5nm)测定，再用origin绘图软件绘制标准曲线(图7)。

实施例5组氨酸脂肪醛促进紫色色杆菌中脱氧紫色杆菌素的表达

组氨酸正庚醛浓度梯度液配制：在超净工作台中，以无菌水为溶剂，组氨酸正庚醛希夫碱为溶质配制出浓度梯度为2.5mmol/L、2mmol/L、1.5mmol/L、1mmol/L、0.5mmol/L、0.1mmol/L溶液，每各梯度液3mL。以相同方法配制组氨酸正辛醛席夫碱、组氨酸癸醛席夫碱、组氨酸十二醛席夫碱的浓度梯度液。

在超净工作台中，取一个无菌的24孔板。各孔均加入#802液体培养基1970μL，将活化12h的紫色色杆菌溶液加入各孔，每孔20μL，组氨酸脂肪醛希夫碱每孔10μL。组氨酸脂肪醛席夫碱上样顺序如图8所示。

组氨酸脂肪醛希夫碱与紫色色杆菌在30℃共培养12小时后，所得照片如图9所示。组氨酸脂肪醛希夫碱添加组明显变蓝，且随着样品浓度的增加，希夫碱分子中脂肪链长度的延长，体系蓝紫色加深。

实施例6脱氧紫色杆菌素含量测定

将实例5中各组样品继续培养12小时后(合计培养24小时)每个孔的培养液分别移至离心管中，离心20分钟(10000r/min)弃去上层，再加入去离子水超声洗涤10分钟，离心20分钟(10000r/min)弃去上层。向离心管中加入1mL甲醇进行萃取，离心20分钟(10000r/min)取上层液体，在旋转蒸发仪上蒸干。

再次加入1mL甲醇进行萃取并旋干，重复操作三次。

将萃取得到的脱氧紫色杆菌素分别溶解在200μL甲醇中，用紫外分光光度计检测其吸光度值(OD_564.5nm)。根据标准曲线计算出脱氧紫色色杆菌的表达量(图10)。

结果表明，组氨酸脂肪醛希夫碱可显著提高紫色色杆菌脱氧紫色杆菌素的表达量；随着组氨酸脂肪醛希夫碱脂肪链的延长，诱导效应增强。

上述实施例只是用于对本发明的举例和说明，而非意在将本发明限制于所描述的实施例范围内。此外本领域技术人员可以理解的是，本发明不局限于上述实施例，根据本发明的教导还可以做出更多种的变型和修改，这些变型和修改均落在本发明所要求保护的范围内。