阅读说明：本技术 一种前体指导的Bacillamide卤代类似物的制备方法 (Precursor-guided preparation method of Bacillamide halogenated analogue ) 是由 张风丽 胡恒 李志勇 于 2020-07-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种前体指导的Bacillamide卤代类似物的制备方法,包括如下步骤：将海洋来源萎缩芽孢杆菌Bacillus atrephaeus C89经菌种活化,种子培养后用于摇瓶发酵,在菌株摇瓶发酵的5-7h添加终浓度为0.2-0.6mM的6-氯-色氨酸,在发酵48h后终止发酵,发酵培养液经分离纯化后获得6-Cl-Bacillamide C。本发明方法利用微生物胞内酶的底物宽泛性,将色氨酸的衍生物6-氯-色氨酸添加到培养基中,通过生物合成的方法将氯元素引入到了天然产物中。(The invention discloses a precursor-guided preparation method of a Bacillus amide halogenated analogue, which comprises the following steps: activating marine-source Bacillus atrophaeus C89 with strains, culturing seeds, then using the strains for shake flask fermentation, adding 6-chloro-tryptophan with the final concentration of 0.2-0.6mM in 5-7h of the strain shake flask fermentation, terminating the fermentation after 48h of the fermentation, and separating and purifying the fermentation culture solution to obtain 6-Cl-Bacillamide C. The method utilizes the substrate universality of the microbial intracellular enzyme, adds the derivative 6-chloro-tryptophan of the tryptophan into the culture medium, and introduces the chlorine element into the natural product by a biosynthesis method.)

一种前体指导的Bacillamide卤代类似物的制备方法

技术领域

本发明属于微生物分子生物学与天然产物化学领域，涉及一种前体指导的Bacillamide卤代类似物的制备方法，具体涉及在海洋来源的萎缩芽孢杆菌中利用前体指导的生物合成的方法合成Bacillamide氯代类似物。

背景技术

Bacillamide家族化合物属于非核糖体肽类化合物，目前已经发现有BacillamideA、B、C、D、E五个成员[[Bloudoff K,Fage CD,Marahiel MA,Schmeing TM:Structural andmutational analysis of the nonribosomal peptide synthetase heterocyclizationdomain provides insight into catalysis.Proc Natl Acad Sci U S A 2017,114(1):95-100.],在结构上的共同特性是都带有吲哚噻唑环。其结构如下所示：

已知该家族化合物能有效的抑制有害甲藻、鞭毛藻和蓝藻等多种藻的生长，此外Bacillamides类似物对人结直肠癌细胞HCT-116，人乳腺癌细胞MDA-MB-231和免疫系统癌细胞系(JURKAT)显示出与市售药物阿霉素相当的细胞毒性作用。在Bacillamide A及其衍生物抑蓝藻和抑微藻的活性实验中还发现Bacillamide卤代衍生物表现出了更高的生物活性[Kumar S,Aggarwal R,Kumar V,Sadana R,Patel B,Kaushik P,Kaushik D:Solvent-free synthesis of bacillamide analogues as novel cytotoxic and anti-inflammatory agents.Eur J Med Chem 2016,123:718-726.]。

CN201010278110、CN201310677108均提供了Bacillamide化合物的生物合成方法。目前已经发现的Bacillamide家族化合物包括Bacillamide A、B、C、D、E、五个成员。其中CN201010278110合成的是Bacillamide C，CN201310677108合成的是Bacillamide A、Bacillamide B、Bacillamide C以及Bacillamide前体化合物。然而其均不涉及在Bacillamide的骨架上引入卤素元素合成Bacillamide家族的卤代衍生物。

本发明以前体指导的生物合成的方法，利用萎缩芽孢杆菌B.atrephaeus C89体内Bacillamide生物合成途径中色氨酸脱羧酶的底物宽泛性，添加色氨酸的类似物6-氯-色氨酸为底物，成功在Bacillamide C的骨架上引入卤素元素得到了6-Cl-Bacillamide C。由于卤素原子具有较强的电负性，天然产物中引入卤素元素通常会影响分子的空间特性和电子特性，在药物开发中卤素的加入也具有增加药物有效性和生物利用度、延长半衰期等作用。因此卤代Bacillamdie衍生物具有重要的研究和开发价值。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提供了一种前体指导的Bacillamide卤代类似物的制备方法。该方法在海洋来源萎缩芽孢杆菌B.atrephaeus C89发酵培养基中添加氯代色氨酸前体，在发酵培养基萃取液中提取和制备得到Bacillamide卤代衍生物6-Cl-Bacillamide C，其分子式为C₁₈H₁₉ClN₄O₂S，结构如下所示：

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供一种前体指导的Bacillamide卤代类似物的制备方法，包括以下步骤：

S1、将海洋来源萎缩芽孢杆菌B.atrephaeus C89经菌种活化，种子培养后用于后续发酵；

S2、配制前体化合物：用人工海水配置6-氯-色氨酸母液，过滤除菌备用；

S3、在B.atrephaeus C89发酵的对数生长期起始阶段加入步骤S2配制的前体化合物而后继续发酵；

S4、B.atrephaeus C89发酵结束后分离纯化发酵液即可得到Bacillamide氯代类似物：6-Cl-Bacillamide C。

作为本发明的一个实施方案，步骤S1中，用于菌种活化的培养基为LB固体培养基，用于种子培养、发酵的培养基为LB液体培养基。

作为本发明的一个实施方案，所述LB液体培养基是由每1L人工海水中溶入10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠配制成的；所述LB固体培养基是由每1L人工海水中溶入10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠、15-20g琼脂粉配制而成。

作为本发明的一个实施方案，所述人工海水成分为：氯化钠26-27g/L，氯化镁2-3g/L，硫酸镁3-4g/L，氯化钙1-2g/L，氯化钾0.5-1g/L，碳酸氢钠0.1-0.2g/L，溴化钠0.05-0.1g/L，用超纯水逐个溶解各成分，调节pH至7.0-7.2。

进一步示例为：所述人工海水成分为：氯化钠26.518g/L，氯化镁2.447g/L，硫酸镁3.305g/L，氯化钙1.141g/L，氯化钾0.725g/L，碳酸氢钠0.202g/L，溴化钠0.083g/L，用超纯水逐个溶解各成分，调节pH至7.0-7.2。

作为本发明的一个实施方案，步骤S2中，用人工海水配置6-氯-色氨酸母液，具体是：6-氯-色氨酸先用甲酸溶解，然后用人工海水定容，配置成250-300mM的母液。

作为本发明的一个实施方案，步骤S1中，所述发酵为摇瓶发酵，培养条件为28℃，150rpm。

作为本发明的一个实施方案，步骤S2中，所述过滤除菌采用0.22μm滤膜过滤除菌。

作为本发明的一个实施方案，步骤S3中，前体化合物添加时间为发酵开始之后的5-7h，发酵结束时间为48h后。

作为本发明的一个实施方案，所述前体化合物添加的工作浓度为0.2-0.6mM。

作为本发明的一个实施方案，步骤S4中，所述分离纯化步骤为：发酵结束后立即加入一定体积的乙酸乙酯萃取过夜，减压过滤后的上清继续用乙酸乙酯进行萃取，萃取后的有机相溶液旋蒸吹干后即得含有6-Cl-Bacillamide C的粗浸膏。

作为本发明的一个实施方案，所述分离纯化步骤还包括：将粗浸膏用甲醇溶解，利用凝胶过滤层析对粗浸膏进行分离。

作为本发明的一个实施方案，凝胶过滤层析所用填充材料为葡聚糖凝胶sephadexLH-20，流动相为甲醇，利用高效液相色谱HPLC对洗脱液进行分析，确定6-Cl-BacillamideC差异峰所在组成。

作为本发明的一个实施方案，对凝胶过滤层析的洗脱液进行HPLC检测所用条件为：紫外检测波长：220nm；流动相为A相：超纯水，B相：HPLC级乙腈；柱温：25℃洗脱条件为：0-30min，B相10-100％；30-35min，B相100-10％。色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6×150mm，5μm)。流速1mL/min，进样量20μL，样品浓度4mg/mL。

作为本发明的一个实施方案，利用半制备型高效液相色谱对含有6-Cl-Bacillamide C差异峰所在组成进一步分离，即可得到6-Cl-Bacillamide C。

利用半制备型高效液相色谱对含有6-Cl-Bacillamide C差异峰所在组成进行粗制，半制备型高效液相色谱条件为：紫外检测波长：220nm；流动相为A相：超纯水，B相：HPLC级乙腈；柱温：25℃；洗脱条件为0-30min，B相10-100％；30-35min，B相100-10％；色谱柱为Durashell C18-AM,(4.6×250mm,5μm)。

对上述粗制品用半制备型高效液相色谱进行二制得到6-Cl-Bacillamide C单品，色谱条件为：紫外检测波长：220nm；流动相为A相：超纯水，B相：HPLC级乙腈；柱温：25℃；洗脱条件为0-11min，B相10-44％；11-16min，B相44-60％；16.01-20min,100-100％；20.01-25min，100-10％；色谱柱为Durashell C18-AM,(4.6×250mm,5μm)。

本发明利用前体指导的生物合成的方法，在海洋来源萎缩芽孢杆菌B.atrephaeusC89培养基中添加6-氯-色氨酸前体，在发酵产物中成功分离鉴定得到Bacillamide的卤代衍生物6-Cl-Bacillamide C。

本发明在Bacillamide家族化合物原有骨架上通过前体指导的生物合成的方法引入了卤素元素，最终得到Bacillamide家族的卤代衍生物，即本发明的Bacillamide氯代衍生物6-Cl-Bacillamide C。主要是利用萎缩芽孢杆菌B.atrephaeus C89体内色氨酸脱羧酶的底物宽泛性，通过在培养基中添加色氨酸的衍生物6-氯-色氨酸，最终将氯原子引入到Bacillamide C的骨架之上，合成得到6-Cl-Bacillamide C。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)用前体指导的生物合成的方法，在海洋来源萎缩芽孢杆菌B.atrephaeus C89发酵培养基中分离鉴定到Bacillamide的卤代衍生物6-Cl-Bacillamide C；

2)首次利用微生物合成了Bacillamide的氯代衍生物，对Bacillamide的卤代衍生物的生物合成具有指导意义，为Bacillamide类似物的抗藻和抗肿瘤活性研究提供基础；

3)本发明的6-Cl-Bacillamide C的分离纯化方法中所用洗脱试剂为甲醇和乙腈，成本低，制备方法简单，具有工业研发价值；

4)本发明拓宽了Bacillamide家族化合物的种类，为后续的活性筛选提供了更多的选择。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明6-Cl-Bacillamide C的制备流程图；

图2为实施例1中粗浸膏的高效液相色谱图；

图3为实施例2中半制备型HPLC纯化后的6-Cl-Bacillamide C的高效液相色谱图；

图4为6-Cl-Bacillamide C的一级质谱图；

图5为6-Cl-Bacillamide C的二级质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例提供了一种前体指导的Bacillamide卤代类似物的制备方法如图1，具体包括以下步骤：

人工海水的配置：氯化钠26.518g/L，氯化镁2.447g/L，硫酸镁3.305g/L，氯化钙1.141g/L，氯化钾0.725g/L，碳酸氢钠0.202g/L，溴化钠0.083g/L，用超纯水依次溶解上述成分避免沉淀的产生，pH7.0-7.2。

LB培养基的配置：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，固体培养基再加1.5％琼脂粉，用人工海水溶解，121℃，20min高温灭菌备用。

6-氯-色氨酸前体母液的配置：先用甲酸溶解，然后用人工海水定容，配置成250mM的母液备用，再用0.22μm滤膜过滤除菌备用。

菌株的活化：取-80℃保存的萎缩芽孢杆菌B.atrephaeus C89于LB固体培养基上划线，28℃恒温培养箱中培养过夜。

种子液的制备：待上述菌株活化平板上长出单菌落后，挑选单菌落加入到5-10mL的LB液体培养基中，28℃，150rpm培养12-16h。

菌株发酵：按照1％的接种量将种子液接种至500mL的LB液体培养基中，28℃，150rpm条件下开始发酵，在发酵开始5-7h加入终浓度为0.2-0.6mM的6-氯-色氨酸前体继续发酵，48h后结束发酵。

实施例2

分离纯化发酵产物，具体包括以下步骤：

萃取，减压过滤：在发酵结束的锥形瓶中加入发酵培养基等体积的乙酸乙酯，萃取过夜；然后利用孔径为20μm的定性滤纸对发酵液进行减压抽滤收集菌液上清；菌液上清在经过等体积的乙酸乙酯萃取，旋蒸后得到粗浸膏；用甲醇溶解旋蒸瓶中的粗浸膏后转移至样品瓶中吹干，利用高效液相色谱检测粗浸膏，检测条件为紫外检测波长：220nm；流动相为A相：超纯水，B相：HPLC级乙腈；柱温：25℃洗脱条件为：0-30min，B相10-100％；30-35min，B相100-10％。色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6×150mm，5μm)。流速1mL/min，进样量20μL，样品浓度4mg/mL。图2为粗浸膏的高效液相色谱图，由图2可知，6-Cl-Bacillamide C的出峰时间为11.871min)。

凝胶柱层析：将上述吹干的粗浸膏用甲醇溶解后，用0.22μm滤膜过滤，过滤后液体进行凝胶柱层析。凝胶柱层析柱子填料为葡聚糖凝胶sephadex LH-20，流动相为甲醇。凝胶柱层析具体步骤为：先用甲醇对凝胶柱进行平衡；然后采用胶头滴管将待分离样品沿凝胶柱管壁缓慢滴加，待样品完全浸入凝胶后，在凝胶柱上端加上洗脱液储存器；打开凝胶柱下端阀门开始洗脱，待样品流至凝胶柱底端15-20cm时开始用试管收集流出液。

高效液相色谱分析上述层析液：利用高效液相色谱检测上述试管中的流出液，对相同峰型的试管组分进行合并，检测所用条件为紫外检测波长：220nm；流动相为A相：超纯水，B相：HPLC级乙腈；柱温：25℃洗脱条件为：0-30min，B相10-100％；30-35min，B相100-10％。色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6×150mm，5μm)。流速1mL/min，进样量20μL，样品浓度4mg/mL。

半制备型高效液相色谱对上述合并样品进行粗制和二制：色谱条件为外检测波长：220nm；流动相为A相：超纯水，B相：HPLC级乙腈；柱温：25℃；洗脱条件为0-11min，B相10-44％；11-16min，B相44-60％；16.01-20min,100-100％；20.01-25min，100-10％；色谱柱为Durashell C18-AM,(4.6×250mm,5μm)。图3为经过凝胶柱层析，半制备型高效液相色谱纯化后的样品色谱图，由图3可知，6-Cl-Bacillamide C的出峰时间为11.023min。

所得化合物的结构如下所示，其分子式为C₁₈H₁₉ClN₄O₂S，该化合物的一级质谱如图4所示，二级质谱如图5所示。

图5是6-Cl-Bacillamide C的二级质谱图，图5中前面的3个峰是6-Cl-Bacillamide C分子在二级质谱中分子离子进一步发生键断裂形成的碎片离子峰，碎片离子峰在高效液相色谱HPLC分离中不会出现；最后1个峰才是6-Cl-Bacillamide C的分子离子峰，在HPLC中可以检测到。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。