阅读说明：本技术 提高中华羊茅-内生真菌菌株pa次生代谢产物震颤素含量的方法 (Method for improving content of tremorine in secondary metabolite of Festuca sinensis-endophytic fungi strain PA ) 是由 李春杰 刘静 陈振江 魏学凯 李涛 于 2019-09-20 设计创作，主要内容包括：本发明提供提高中华羊茅-内生真菌菌株PA次生代谢产物震颤素含量的方法,包括以下步骤：(1)将中华羊茅-内生真菌菌株PA的菌丝接种到平板PDA培养基上进行黑暗培养；(2)接种至M102种子液体培养基中继续培养；(3)接种至M104T培养基中进行发酵培养,离心收集滤液；发酵培养的条件为：黑暗培养,初始pH8-10,装液量25-100mL,接种量0.5％-5％,接种时间14d-28d,转速120r/min-160r/min,温度20℃-30℃。本发明利用中华羊茅-内生真菌菌株PA的发酵液为材料,通过优化发酵条件,提高菌株代谢产物活性物质的产率,为微生物农药的研发提供基础资料。(The invention provides a method for improving the content of tremorine of a secondary metabolite of a Festuca sinensis-endophytic fungi strain PA, which comprises the following steps: (1) inoculating hypha of a Festuca arundinacea-endophytic fungi strain PA to a flat PDA culture medium for dark culture; (2) inoculating to M102 seed liquid culture medium for continuous culture; (3) inoculating to M104T culture medium for fermentation culture, centrifuging, and collecting filtrate; the conditions of fermentation culture are as follows: dark culture, initial pH8-10, liquid loading 25-100mL, inoculation amount 0.5-5%, inoculation time 14d-28d, rotation speed 120r/min-160r/min, and temperature 20-30 ℃. The invention uses the fermentation liquor of the Festuca arundinacea-endophytic fungi strain PA as a material, improves the yield of the active substances of the metabolite of the strain by optimizing the fermentation conditions, and provides basic data for the research and development of microbial pesticides.)

提高中华羊茅-内生真菌菌株PA次生代谢产物震颤素含量的 方法

技术领域

本发明涉及提高中华羊茅(Festucasinensis)-内生真菌(

sp.)菌株PA次生代谢产物震颤素含量的方法。

背景技术

内生真菌是指在其生活史的部分或全部阶段生活于植物组织内，对植物没有引起明显病害症状的真菌(Siegeletal.,1987；李秀璋等,2014)。研究表明

内生真菌可产生具有生物活性的次生代谢产物生物碱，分别是以震颤素(lolitremB)为代表的吲哚双萜类(lndolditerpene)、以波胺(peramine)为代表的吡咯并吡嗪类(pyrrolopyrazine)、以麦角新碱(ergonovine)和麦角酰胺(ergine)为代表的麦角碱类(ergotalkaloids)、以黑麦草碱(loline)为代表的饱和吡咯类化合物(pyrrolizidine)等(高嘉卉和南志标,2007；徐瑞等,2012；李秀璋等,2015)。四大类生物碱均对某些线虫和食草昆虫具有一定的毒性。据统计超过77种禾草被认定为携带有禾草内生真菌(师茜等,2018)，已分离鉴定出45种

禾草内生真菌(Leuchtmannetal.,2014；金文进等,2015；Shymanovichetal.,2017；Mihwaetal.,2018)，并且其至少对79个种的害虫表现出较明显的抗性(李秀璋等,2015；Xiaetal.,2018)。说明禾草内生真菌资源丰富，有作为潜在生防因子的潜力。

众多研究人员发现纯培养条件下，

禾草内生真菌亦可以产生一些生物碱等次生代谢产物(Blankenshipetal.,2001；Yueetal.,2000；高嘉卉,2007)，其对害虫具有较高毒力作用(ChristensenandLatch,1991；Faeth,2002；张雪兵等,2010；Schardletal.,2013)，说明其可以作为生防资源，但是含量较低(高嘉卉,2007)。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了提高中华羊茅(Festucasinensis)-内生真菌(

sp.)菌株PA次生代谢产物震颤素(LolitremB)含量的方法。通过单因素实验和正交实验优化发酵条件，来提高菌株代谢物产量，缩短发酵时间，降低耗能，减少污染。

为了实现上述技术目的，本发明采用的技术方案为：

本发明提供提高中华羊茅(Festucasinensis)-内生真菌(

sp.)菌株PA次生代谢产物震颤素含量的方法，包括以下步骤：

(1)将中华羊茅(Festucasinensis)-内生真菌(

sp.)菌株PA的菌丝接种到平板PDA培养基上进行黑暗培养；

(2)接种至M102种子液体培养基中继续培养；

(3)接种至M104T培养基中进行发酵培养，离心，收集滤液；

其中，步骤(3)中，所述发酵培养的条件为：黑暗培养，初始pH8-10，装液量25-100mL，接种量0.5％-5％，接种时间14d-28d，转速120r/min-160r/min，温度20℃-30℃。

作为优选，步骤(1)中，所述黑暗培养是在22℃下黑暗培养四周。

作为优选，步骤(2)中，所述培养是在22℃，转速200r/min的条件下黑暗培养四周。

作为优选，步骤(3)中，所述发酵培养的条件为：黑暗培养，pH9、装液量75mL、接种量3％、接种时间21d、转速140r/min、温度20℃。

作为优选，所述禾草为中华羊茅。

本发明率先利用中华羊茅(Festucasinensis)-内生真菌(

sp.)菌株PA的发酵液为材料，通过单因素实验和正交实验优化发酵条件(pH、装液量、接种量、接种时间、摇床转速和温度)，提高菌株代谢产物活性物质的产率，为微生物农药的研发提供基础资料。

本发明通过摇瓶发酵获得发酵液；通过单因素实验获得菌株最适发酵条件(pH、装液量、接种量、接种时间、摇床转速和温度)，再通过正交实验获得菌株的最优发酵组合；根据最优组合进行发酵，测定生物碱含量，进行评价。

本发明的有益效果为：

1、减少发酵过程中的污染，成本低；

2、缩短发酵周期，能耗低；

3、提高活性代谢产物的产率；

4、为

禾草内生真菌研发为杀虫剂提供了基础资料。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为pH对震颤素含量的影响。

图2为装液量对震颤素含量的影响。

图3为接种量对震颤素含量的影响。

图4为接种时间对震颤素含量的影响。

图5为转速对震颤素含量的影响。

图6为温度对震颤素含量的影响。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。

中华羊茅(Festucasinensis)-内生真菌(sp.)菌株由兰州大学草地农业科技学院草地保护所提供，编号为MHLZU-FSPA。

本发明的提高中华羊茅(Festucasinensis)-内生真菌(

sp.)菌株PA次生代谢产物震颤素(LolitremB)含量的方法如下：

1、种子发酵液的制备：挑取斜面试管菌种中华羊茅(Festucasinensis)-内生真菌(

sp.)菌株PA的菌丝转接至平板PDA培养基上，22℃黑暗培养四周，四周后，用无菌打孔器在菌落边缘切取3块6mm的菌碟，尽量切碎，转入含100mLM102种子液体培养基的250mL三角烧瓶中，置于转速200r/min，温度22℃的摇床培养箱内黑暗培养四周，促进菌丝体生长，用一次性注射器分别吸取2mL种子液到含100mlM104T培养基的250mL三角烧瓶中，置于转速100r/min，温度22℃的摇床培养箱内黑暗培养两周，促使菌丝体产碱。在无菌条件下，将发酵液用一次性针管吸取10mL置于离心管中。以6000r/min离心10min，抽滤，把滤液和菌丝体分开，收集滤液。

其中，平板PDA培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂17g，蒸馏水1000mL。

M102种子液体培养基配方为：蔗糖30g，麦芽糖20g，酵母膏1.0g，蛋白胨2g，MgSO₄·7H₂O0.5g，KCl0.5g，KH₂PO₄1g，蒸馏水1000mL。(Bacon,1988；parrott,1994)。

M104T培养基配方为：山梨醇100g，葡萄糖40g，酵母浸膏3g，谷氨酸10g，色氨酸0.8g，MgSO₄·7H₂O0.3g，蒸馏水1000ml(Bacon,1988；parrott,1994)。

2、震颤素的体外检测：量取200μL菌液置于2ml离心管，加1ml的二氯甲烷，超声萃取5min，1000rmp离心10min，吸取0.4ml的上清液过Sep-pak柱(1ml甲醇活化)进行萃取，用1ml体积百分比为20％的甲醇和体积百分比为80％的二氯甲烷冲洗，然后用1ml相同的溶液收集，将收集的液体经0.33mm孔径的聚乙烯有机过滤垫(购自奋力达公司，商品名NAVIGATOR)至1.5ml棕色瓶中进行HPLC检测(Gallagheretal.,1985；刘静等,2017)。

3、单因素发酵筛选

将M104T培养基作为基础培养基进行发酵条件单因子筛选，包括初始值(pH)、装液量(发酵体积)、接种量、接种时间、摇床转速和温度。

3.1初始值

在250mL三角瓶装100mLM104T培养基，接种量2％，发酵液初始值pH分别为8、9、10、11和12，置于回转式摇床，22℃，100r/min培养两周。研究不同初始值pH对震颤素含量的影响，每个处理重复三次。

3.2装液量

采用筛选出的初始pH，装液量分别设置为25、50、75、100、125mL，装于含有M104T培养基的250mL三角瓶中，置于回转式摇床，22℃，100r/min培养两周。研究不同装液量对震颤素含量的影响，每个处理重复三次。

3.3接种量

采用筛选出的初始pH和装液量，接种量分别为0.5％、1％、2％、3％、4％和5％，装于含有M104T培养基的250mL三角瓶中，置于回转式摇床，22℃，100r/min培养两周。研究不同接种量对震颤素含量的影响，每个处理重复三次。

3.4接种时间

采用筛选出的初始pH、装液量和接种量，在250mL三角瓶装M104T培养基，发酵时间分别为0d、7d、14d、21d、28d和35d，置于回转式摇床，22℃，100r/min培养至所需时间。研究不同接种时间对震颤素含量的影响，每个处理重复三次。

3.5摇床转速

采用筛选出的初始pH、装液量、接种量和接种时间，250mL三角瓶装M104T培养基，置于回转式摇床培养，转速分别设为100r/min、120r/min、140r/min、160r/min、180r/min、200r/min，22℃培养至所需时间。研究不同转速对震颤素含量的影响，每个处理重复三次。

3.6发酵温度

采用筛选出的初始pH、装液量、接种量、接种时间和转速，在250mL三角瓶装M104T培养基，发酵温度分别为10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和35℃，置于回转式摇床培养至所需时间。研究不同的发酵温度对震颤素含量的影响，每个处理重复三次。

4、正交实验设计

根据单因素筛选结果，本实验选择了最适初始值(pH)、装液量(发酵体积)、接种量、接种时间、摇床转速和温度进行6因素3水平的正交实验。

按正交实验优化结果，选择最优组合进行发酵，在无菌条件下，将发酵液用一次性针管吸取10mL置于离心管中。以6000r/min离心10min，抽滤，把滤液和菌丝体分开，收集滤液。测定震颤素含量，每个处理重复三次。

5、结果分析

5.1单因素实验

根据单因素发酵条件筛选结果表明，选择初始pH(8、9、10)、装液量(25mL、75mL、100mL)、接种量(0.5％、3％、5％)、接种时间(14d、21d、28d)、转速(120r/min、140r/min、160r/min)、温度(20℃、25℃、30℃)进行6因素3水平(见表1)正交实验。

表1 PA菌株震颤素发酵因素和水平

5.2显著性分析

正交实验结果如表2所示，影响因素中pH、装液量、接种量、接种时间和温度对PA菌株震颤素含量具有显著(P＜0.05)影响，而转速对其影响不显著(P>0.05)，6个因素的主次关系是：pH>装液量>接种量>接种时间>温度>转速。(见表2)。

表2 PA菌株震颤素含量主体间效应检验显著性分析

R方＝0.961(调整R方＝0.867)

5.3处理组合优选

根据各因素显著性分析结果可得，最适PA菌株产震颤素的组合为A₂B₂C₂D₂E₂F₁。即pH9、装液量75mL、接种量3％、接种时间21d、转速140r/min、温度20℃。

5.4优化结果验证

优化后的PA菌株发酵液产震颤素含量增长了3.5倍(表3)。

表3发酵优化验证结果

实施例1

本发明的提高中华羊茅(Festucasinensis)-内生真菌(

sp.)菌株PA次生代谢产物震颤素(LolitremB)含量的方法如下：

挑取斜面试管菌种中华羊茅(Festucasinensis)-内生真菌(

sp.)菌株PA的菌丝转接至平板PDA培养基上，22℃黑暗培养四周，四周后，用无菌打孔器在菌落边缘切取3块6mm的菌碟，尽量切碎，转入含100mLM102种子液体培养基的250mL三角烧瓶中，置于转速200r/min，温度22℃的摇床培养箱内黑暗培养四周，促进菌丝体生长，用一次性注射器分别吸取2.25mL种子液到含75mlM104T培养基的250mL三角烧瓶中，培养基的初始pH为9，置于转速140r/min，温度20℃的摇床培养箱内黑暗培养三周，促使菌丝体产碱。在无菌条件下，将发酵液用一次性针管吸取10mL置于离心管中。以6000r/min离心10min，抽滤，把滤液和菌丝体分开，收集滤液。

实施例2

本发明的提高

禾草内生真菌菌株PA次生代谢产物震颤素(LolitremB)含量的方法如下：

挑取斜面试管菌种中华羊茅(Festucasinensis)-内生真菌(

sp.)菌株PA的菌丝转接至平板PDA培养基上，22℃黑暗培养四周，四周后，用无菌打孔器在菌落边缘切取3块6mm的菌碟，尽量切碎，转入含100mLM102种子液体培养基的250mL三角烧瓶中，置于转速200r/min，温度22℃的摇床培养箱内黑暗培养四周，促进菌丝体生长，用一次性注射器分别吸取1.25mL种子液到含25mlM104T培养基的250mL三角烧瓶中，培养基的初始pH为10，置于转速120r/min，温度25℃的摇床培养箱内黑暗培养两周，促使菌丝体产碱。在无菌条件下，将发酵液用一次性针管吸取10mL置于离心管中。以6000r/min离心10min，抽滤，把滤液和菌丝体分开，收集滤液。

实施例3

本发明的提高

禾草内生真菌菌株PA次生代谢产物震颤素(LolitremB)含量的方法如下：

挑取斜面试管菌种中华羊茅(Festucasinensis)-内生真菌(sp.)菌株PA的菌丝转接至平板PDA培养基上，22℃黑暗培养四周，四周后，用无菌打孔器在菌落边缘切取3块6mm的菌碟，尽量切碎，转入含100mLM102种子液体培养基的250mL三角烧瓶中，置于转速200r/min，温度22℃的摇床培养箱内黑暗培养四周，促进菌丝体生长，用一次性注射器分别吸取0.5mL种子液到含100mlM104T培养基的250mL三角烧瓶中，培养基的初始pH为8，置于转速160r/min，温度30℃的摇床培养箱内黑暗培养四周，促使菌丝体产碱。在无菌条件下，将发酵液用一次性针管吸取10mL置于离心管中。以6000r/min离心10min，抽滤，把滤液和菌丝体分开，收集滤液。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。